專利名稱：豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和胸腺素α1融合蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和胸腺素α I融合蛋白及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus type 2, PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multsystemic wasting syndrome, PMWS)的病原，引起斷奶仔豬發(fā)生進(jìn)行性消瘦、咳嗽、呼吸困難、腹瀉、皮膚蒼白或者黃染、淋巴結(jié)腫大、腎臟灰白水腫等癥狀。同時(shí)該病還會(huì)造成一定程度上的的免疫抑制，容易造成其它疾病的繼發(fā)或并發(fā)感染。自1991年加拿大首次發(fā)現(xiàn)臨床豬圓環(huán)病毒以來，該病已給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因編碼的Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可自我裝配成病毒性 粒子，并含有可中和病毒的抗原表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體反應(yīng)并獲得免疫保護(hù)，是設(shè)計(jì)PCV2新型疫苗的首選目標(biāo)基因。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)周期短和生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，是基因工程中蛋白類藥物開發(fā)的首選。但是豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因5’端存在成串排列的稀有密碼子并編碼許多堿性氨基酸，不利于其大腸桿菌表達(dá)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的竣基端131個(gè)氣基酸具有和完整Cap蛋白相同的抗原性，更利于大腸桿菌表達(dá)(韓凌霞，陳艷，崔尚金等，豬II型圓環(huán)病毒全基因組序列分析及其ORFl和0RF2基因的克隆與表達(dá)，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26 (1):10_14)。但隨著豬圓環(huán)病毒2型毒株不斷變異，現(xiàn)有疫苗的免疫保護(hù)力不斷下降。因此，篩選當(dāng)前流行毒株的Cap蛋白進(jìn)行疫苗研發(fā)無疑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和市場開發(fā)價(jià)值。1965年Goldestein等報(bào)道，動(dòng)物胸腺可分離到有生物活性的多胸腺肽類分子，命名為胸腺素(Thymosin) )。1972年Goldestein等報(bào)告進(jìn)一步純化所得到的主要分子量在1-15KD的組分，稱之為胸腺肽組分5 (ThymoSinF5)，用之于動(dòng)物研究和臨床觀察，有補(bǔ)償胸腺功能低下作用。此后，對(duì)胸腺內(nèi)激素樣物質(zhì)的生物化學(xué)研究，在一些實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)開展起來。胸腺素α I其中的一個(gè)組分，由28個(gè)氨基酸殘基組成，其相對(duì)分子量為3. 108KD，等電點(diǎn)為4. 2，無二硫鍵和糖基化，N端乙酞化，是高度保守的活性胸腺肽。研究表明，胸腺素α I能促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化為成熟的有免疫功能的T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，提高機(jī)體抗感染能力。在人用臨床上，已有超萬例胸腺肽產(chǎn)品作為免疫調(diào)節(jié)劑和增強(qiáng)劑用于治療原發(fā)性或繼發(fā)性免疫功能缺陷性疾病和肝炎等，其療效得到國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜业恼J(rèn)可。雖然胸腺素α I有著廣泛的應(yīng)用前景，但由于其基因過短，很難利用基因工程方法實(shí)現(xiàn)直接表達(dá)，所以目前多是化學(xué)合成產(chǎn)品，價(jià)格比較昂貴，另外，由于分子量非常小，所以體內(nèi)半衰期很短，應(yīng)用推廣受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和胸腺素α I融合蛋白及應(yīng)用，即將篩選的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白與具有免疫增強(qiáng)作用的胸腺素α I蛋白通過Lingker序列連接獲得的融合蛋白，并將該融合蛋白作為疫苗用于免疫應(yīng)答。本發(fā)明一個(gè)方面涉及一種融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID Ν0:1。本發(fā)明的融合蛋白用于制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。上述制備的亞單位疫苗，其制備方法如下將96份融合蛋白與滅菌的4份吐溫80攪拌混合作為水相；將94份注射用白油，6份加司本80、2份硬脂酸鋁，混合均勻，高壓滅菌后作為油相；按水相和油相體積比1:3比例混合乳化即可制備豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明的亞單位疫苗用于對(duì)仔豬的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明將篩選的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因與具有免疫增強(qiáng)作用的胸腺素α I基因通過Lingker序列連接獲得融合蛋白。一次免疫操作就可以使仔豬可以獲得雙重免疫保護(hù)。本發(fā)明的基因工程亞單位疫苗免疫原性良好，可以高效的引起仔豬的免疫應(yīng)答。說明書附I :本發(fā)明的重組表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白與胸腺素α I組成的融合蛋白。其中豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白3'端的131個(gè)氨基酸片段和胸腺素α I的28個(gè)氨基酸序列通過Lingker序列GSGGG連接起來，其具有序列為SEQ ID NO: I的氨基酸序列和序列為SEQ IDΝ0:2的核苷酸序列。所述的融合蛋白可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的基因重組的方法進(jìn)行制備。
將重組制備的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白與胸腺素α I組成的融合蛋白經(jīng)白油佐劑乳化制成豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞疫苗。按獸用生物制品規(guī)程的檢驗(yàn)方法進(jìn)行性狀、無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)均合格。再將制備的疫苗免疫PCV2陰性斷奶仔豬，結(jié)果顯示制備的疫苗免疫原性良好，可有效的引起仔豬的免疫應(yīng)答。下面結(jié)合具體實(shí)施方式
來進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)質(zhì)的情況下可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。一、豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的篩選包括有如下的步驟I、申請(qǐng)人首先從臨床分離的疑似PMWS的病料處理后接種無PCVl污染的ΡΚ-15細(xì)胞、盲傳三代后PCR擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型基因全長，引物序列如下Pl: 5' --GCTGGCTGAACTTTTGAAAG—3'Ρ2 5 ' —AAATTTCTGACAAACGTTAC—3'擴(kuò)增的條件如下94°C5min 變性，94°C 30S,65°C 30S,72°C I. 5min，30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，豬圓環(huán)病毒2型基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:3，氨基酸序列為SEQ ID N0:4。將Cap蛋白基因序列部分在NCBI上Blast比對(duì)，同源性最高為97%，表明擴(kuò)增的樣品為發(fā)生變異的病毒株。將獲得的Cap蛋白基因的5'端和3'端分別加上BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)，送基因公司進(jìn)行全基因合成。將合成得到的Cap蛋白基因雙酶切后連入pET30a載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pET30a/mCap表達(dá)載體。用CaCl2法將pET30a/mCap表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于含50μ g/ml卡那霉素的瓊脂平板，37°C過夜培養(yǎng)。選取10個(gè)單菌落提取質(zhì)粒，BamH I和Hind III雙酶切驗(yàn)證陽性的菌落進(jìn)一步測序鑒定。將測序驗(yàn)證后的陽性克隆在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)至O. 6 O. 8時(shí)加入O. 3mM IPTG誘導(dǎo)4 5小時(shí)，離心收集菌體跑SDS-PAGE電泳，同時(shí)設(shè)立未誘導(dǎo)菌體作為對(duì)照。結(jié)果誘導(dǎo)后陽性克隆比對(duì)照菌在30KD處多出一條蛋白條帶，與重組蛋白理論分子量一致，表達(dá)量約為35%以上。經(jīng)PCV2抗體免疫印跡檢定，顯示陽性反 應(yīng)。證明獲得的陽性克隆為高效表達(dá)基因工程蛋白的工程菌。
發(fā)酵、純化與豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗的制備I、發(fā)酵工藝I) LB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO4 · 7H20的LB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，補(bǔ)料為葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO4 · 7H20 5 g/L ο2)發(fā)酵過程挑取鑒定過的工程菌接種于含卡那霉素的濃度為50μ g/ml的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，作為種子液。將種子液按2%接種量接種于發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)好各參數(shù)，37°C，200轉(zhuǎn)，溶氧控制在20%以上。發(fā)酵4小時(shí)后開始流加補(bǔ)料，發(fā)酵6小時(shí)后加入O. 3mmol/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)后6小時(shí)發(fā)酵結(jié)束。3)鎳柱純化、脫鹽4)親和層析采用鎳離子金屬螯合層析柱，重組蛋白可以用含300mmol/L咪唑的洗脫液洗下來，純度達(dá)到90%以上5)脫鹽收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外液，透析脫鹽即得重組蛋白液。2、豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗的制備將制備的重組蛋白96份與滅菌的4份吐溫-80充分?jǐn)嚢杌旌献鳛樗唷Ｍ瑫r(shí)注射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸鋁2份，混合均勻，高壓滅菌后作為油相。按水相和油相1:3比例混合乳化即可制備豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗。按獸用生物制品規(guī)程的檢驗(yàn)方法進(jìn)行性狀、無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)均合格。重組蛋白制備的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗的動(dòng)物試驗(yàn)將制備的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗經(jīng)肌肉接種21日齡PCV2陰性斷奶仔豬5頭，另取5頭作為對(duì)照。接種28日后取血測PCV2抗體，免疫組PCV2抗體全部為陽性，有效率達(dá)到100%，對(duì)照組未檢測到抗體。結(jié)果顯示制備的重組蛋白免疫原性良好，其進(jìn)一步制備的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗可以引起仔豬的免疫應(yīng)答。并且，由于本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型基因?yàn)樾碌牡任换颍梢愿行У膶?duì)仔豬進(jìn)行免疫保護(hù)。
二、融合蛋白的制備I、將獲得的Cap蛋白V端的131個(gè)氨基酸片段和胸腺素α I的28個(gè)氨基酸序列通過Lingker序列GSGGG連接起來,既得融合蛋白序列(SEQ ID NO: I)。在保證融合蛋白的氨基酸序列不變的情況下將融合蛋白的DNA序列進(jìn)行畢赤酵母稀有密碼子改造獲得融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO: 2)。 2、將本發(fā)明的融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO: 2 )，的5'端和3'端分別引入XhoI和Xba I酶切位點(diǎn)后全基因合成，雙酶切后連入pPICZ B載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pPICZB/T a -PCV2表達(dá)載體(

圖1)，并進(jìn)行進(jìn)行PCR鑒定、測序；3、陽性質(zhì)粒加入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞懸液中。電轉(zhuǎn)化后均勻涂布于含100 μ g/mLZeocin的YPDS選擇平板上，30°C孵育3 -5天。待YPDS平板上的陽性轉(zhuǎn)化子生長較大，將各轉(zhuǎn)化子依次點(diǎn)種至含Zeocin 200 μ g/mL, 500 μ g/mL, 1000 μ g/mL的YPDS選擇平板，以在高濃度Zeocin平板上正常生長的菌落為可能高拷貝重組菌株。提取可能的高拷貝重組酵 母基因組DNA。以P1、P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，能擴(kuò)增出大約247bp的條帶重組子定為陽性轉(zhuǎn)化子。4、將篩選到的陽性重組菌單菌落接種于含100 μ g/mL Zeocin的YPD培養(yǎng)液中，28°C振搖培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)。取此菌液按4%體積比轉(zhuǎn)接于5 ml BMGY培養(yǎng)基中，28°C搖振培養(yǎng)18-24h左右，0D600值約為5-6。培養(yǎng)物直接轉(zhuǎn)接于25 ml BMMY培養(yǎng)基中，28°C繼續(xù)搖振培養(yǎng)。為了維持誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24h補(bǔ)加100%甲醇使終濃度達(dá)1%。60h后，4°C 5000 r/min離心lOmin，收集上清，即為豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白-胸腺素α I融合蛋白原液。二、發(fā)酵、純化與豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗的制備I、將篩選得到的陽性重組子活化后按1% 10%接種量接種于三角瓶，28 30°C，200r/min搖床培養(yǎng)16 24h后以5% 20%接種量接入發(fā)酵罐，在28 30°C，500 1500r/min, pH值5· O 6· O，通氣量O. I I. OVVM (IL發(fā)酵液Imin通入的氧氣量)，溶氧>20%情況下進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)18 24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%時(shí)流加甲醇至發(fā)酵結(jié)束，整個(gè)發(fā)酵持續(xù)48 72h。發(fā)酵結(jié)束后放料，5000r/min離心lOmin，收集發(fā)酵上清即為豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白-胸腺素α I融合蛋白原液。上述原液經(jīng)超濾濃縮、鎳柱純化后即得豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白-胸腺素α I融合蛋白液。2、豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗的制備。將制備的融合蛋白96份與滅菌的吐溫80 4份充分?jǐn)嚢杌旌献鳛樗唷Ｍ瑫r(shí)注射用白油94份，加司本80 6份、硬脂酸鋁2份，混合均勻，高壓滅菌后作為油相。按水相和油相1:3比例混合乳化即可制備豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗。按獸用生物制品規(guī)程的檢驗(yàn)方法進(jìn)行性狀、無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)均合格。三、基因工程亞單位疫苗的動(dòng)物試驗(yàn)將制備的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗經(jīng)肌肉接種21日齡PCV2陰性斷奶仔豬5頭，另取5頭作為對(duì)照。接種7日采血加入肝素抗凝，用于測定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，接種28日后取血測PCV2抗體。結(jié)果表明免疫組接種7日時(shí)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于對(duì)照組，顯示胸腺素可明顯促進(jìn)機(jī)體免疫狀態(tài)。接種28日后PCV2抗體全部為陽性，有效率達(dá)到100%，對(duì)照組未檢測到抗體。顯示制備的融合蛋白免疫原性良好，其進(jìn)一步制備的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗可以引起仔豬的免疫應(yīng)答。
權(quán)利要求
1.一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和胸腺素α I融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ IDNO: I。
2.權(quán)利要求I所述的融合蛋白在制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗中的應(yīng)用。
3.一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗，其制備方法如下將96份權(quán)利要求I所述的融合蛋白與滅菌的4份吐溫80攪拌混合作為水相；再將94份注射用白油，6份加司本80、2份硬脂酸鋁混合均勻，高壓滅菌后作為油相；按水相和油相體積比1:3比例混合乳化后制成亞單位疫苗。
4.權(quán)利要求3所述的亞單位疫苗用于對(duì)仔豬的免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白和胸腺素α1融合蛋白及應(yīng)用，所述的融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。本發(fā)明的融合蛋白用于制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。本發(fā)明將篩選的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因與具有免疫增強(qiáng)作用的胸腺素α1基因通過Lingker序列連接獲得融合蛋白。本發(fā)明的基因工程亞單位疫苗免疫原性良好，可以高效的引起仔豬的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102827289SQ20121031712
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者王宏華, 凌紅麗, 于春梅, 王雷, 徐麗麗 申請(qǐng)人:青島康地恩藥業(yè)股份有限公司, 青島寶依特生物制藥有限公司