專利名稱：一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液及注射液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液及注射液。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。干細(xì)胞(Stem Cell)是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細(xì)胞”。間充質(zhì)干細(xì)胞mesenchymal stem cells, MSC是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點而日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi) 皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。由MSCs制備的干細(xì)胞注射液在臨床上可以用于預(yù)防和治療異體造血干細(xì)胞移植后產(chǎn)生的移植物抗宿主病(GVHD)，以及治療自生免疫性疾病，I型糖尿病、如紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和硬皮病等。然而，與普通生物制品和藥品不同，間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的活性物質(zhì)是細(xì)胞，細(xì)胞在離體環(huán)境中，活性會迅速下降，傳統(tǒng)方法用含人血白蛋白的氯化鈉注射對MSCs進(jìn)行保存，在8 24小時以內(nèi)，細(xì)胞活性即大幅下降，無法長期保證細(xì)胞活性，給MSCs注射液大量、全國大范圍臨床應(yīng)用于提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，用含有胎牛血清或者細(xì)胞培養(yǎng)基的保存液可以解決細(xì)胞活性下降快的問題，能夠長時間維持細(xì)胞活率。但是，細(xì)胞接觸胎牛血清時會內(nèi)吞胎牛血清，進(jìn)而引起細(xì)胞某些蛋白表達(dá)特性的變化，細(xì)胞回輸人體后可能引起過敏反應(yīng)，不能直接用于臨床輸注；細(xì)胞培養(yǎng)基因其成分與人體環(huán)境相差較遠(yuǎn)，未被批準(zhǔn)臨床使用，也不能直接臨床輸注，通常被科研機(jī)構(gòu)用來體外培養(yǎng)及凍存細(xì)胞。申請?zhí)?01010246409. 3，發(fā)明名稱一種直接靜脈應(yīng)用的間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液的專利申請，公開了一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液的制備方法，包括如下步驟1)將人AB血置于無菌離心管中，在1000rpm-1200rpm條件下離心15分鐘；2)吸取上清液，轉(zhuǎn)移入新的離心管中，在4000g條件下離心20分鐘，上清即為凍存用人AB血漿；3)將二甲基亞砜、上述凍存用人AB血漿、勃脈力A注射液按體積比I : 3 6混合均勻，即為間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液。由該專利申請文件的實施例表I可以看出，該發(fā)明的凍存液I和II凍存1、2、3個月后復(fù)蘇，檢測細(xì)胞活率，凍存液I的細(xì)胞活率依次為96%、92. 6%和89%，其細(xì)胞活率降低率為3. 5%/月，凍存液II細(xì)胞活率依次為97. 4%,95%和為94. 7%，其細(xì)胞活率降低率為I. 35%/月，該申請公開的凍存液雖然可以直接靜脈輸注，但是細(xì)胞活率維持時間短。并且，該細(xì)胞凍存液中含有人AB血漿，血漿中含有大量未知成分，用于異體輸注存在安全隱患，同時，血漿來源也很少，成本高，難以大規(guī)模應(yīng)用。綜上，現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞的凍存液難以兼顧長時間維持細(xì)胞活率與臨床直接輸注。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液。本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液，它包含如下體積百分比的成分
勃脈力A液25 75%
18AA5%復(fù)方氨基酸注射液10 35%
20%人血白蛋白I 50%
DMSO5 20%。優(yōu)選地，所述凍存液包含如下體積百分比的成分
勃脈力A液30 55%
18AA5%復(fù)方氨基酸注射液10 35%
20%人血白蛋白10 25%
DMSO10-20%,進(jìn)一步優(yōu)選地，所述凍存液包含如下體積百分比的成分它包含如下體積百分比的成分
勃脈力A液40-50%
18 AA5%復(fù)方氨基酸注射液15 25%
20%人血白蛋白25%
DMSO10%。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述凍存液由如下體積百分比的成分組成
勃脈力A液40%
18AA5%復(fù)方氨基酸注射液25%
20%人血白蛋白25%
DMSO10% o勃脈力A液每IOOOml含氯化鈉5. 26g、葡萄糖酸鈉5. 02g、醋酸鈉3. 68g、氯化鉀0. 37g、氯化鎂 0. 30g ；20%人血白蛋白是藥典規(guī)定的人血白蛋白制品，其中，人血白蛋白的濃度為20%(v/v)。18AA5%復(fù)方氨基酸注射液由18種氨基酸與山梨醇配制而成的滅菌水溶液。每IOOOml含L-脯氨酸I. 00g、L-絲氨酸I. 00g、L_丙氨酸2. 00g、L_異亮氨酸3. 52g、L_亮氨酸4. 90g、L-門冬氨酸2. 50g、L-酪氨酸0. 25g、L_谷氨酸0. 75g、L_苯丙氨酸5. 33g、L_精氨酸鹽酸鹽5. 00g, L-賴氨酸鹽酸鹽4. 30g、L-纈氨酸3. 60g、L-蘇氨酸2. 50g、L-組氨酸鹽酸鹽
(C6H9N302 HCl H20) 2. 50g、L-色氨酸 0. 90g、L-甲硫氨酸 2. 25g、L-胱氨酸0. 10g、甘氨酸7. 60g、山梨醇50. 00g、亞硫酸氫鈉0. 5g。DMSO 二甲基亞砜。本發(fā)明還提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，其包含前述間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液和間充質(zhì)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為I X IO5Ix IO8個/ml。間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度根據(jù)臨床
需求調(diào)整。本發(fā)明還提供一種制備前述間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的方法，它包括如下步驟(I)按照前述比例取勃脈力A液、18AA 5%復(fù)方氨基酸注射液、20%人血白蛋白和DMSO ；
(2)將步驟(I)勃脈力A液、18AA 5%復(fù)方氨基酸注射液和20%人血白蛋白混勻，加入間充質(zhì)干細(xì)胞至細(xì)胞濃度為I X IO5^l X IO8個/ml，得細(xì)胞懸液；(3)將步驟(I) DMSO加入步驟(2)所得的細(xì)胞懸液，即可。制備得到的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，程控降溫后保存在液氮罐里，使用時，取出復(fù)蘇即可。本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液，可以長時間維持間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，不含細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、人血漿等不安全成分，制備的間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，凍存復(fù)蘇后可直接用于臨床輸注，安全有效，制備方法簡單，成本低廉，具有良好的臨床應(yīng)用前景。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖I生長曲線對比2細(xì)胞凍存前生長形態(tài)圖3本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年后復(fù)蘇后細(xì)胞生長形態(tài)圖4對照組凍存一年后復(fù)蘇期細(xì)胞生長形態(tài)圖5本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞凍存I年復(fù)蘇后細(xì)胞成脂分化能力6未凍存新鮮細(xì)胞成脂分化能力7對照組凍存細(xì)胞成脂分化能力8本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年復(fù)蘇后細(xì)胞成骨分化能力9未凍存新鮮細(xì)胞成骨分化能力圖
圖10對照組凍存細(xì)胞成骨分化能力11本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年復(fù)蘇后48小時后細(xì)胞的成脂分化能力圖
圖12本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年復(fù)蘇后48小時后細(xì)胞的成骨分化能力13本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后細(xì)胞表面CD45檢測結(jié)果
圖14本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后細(xì)胞表面HLA-DR檢測結(jié)果圖15本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后細(xì)胞表面CD14檢測結(jié)果圖16本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后細(xì)胞表面CD34檢測結(jié)果圖17本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后細(xì)胞表面79a檢測結(jié)果圖18本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后細(xì)胞表面CD90檢測結(jié)果圖19本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后細(xì)胞表面CD105檢測結(jié)果圖20本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后細(xì)胞表面CD166檢測結(jié)果圖21本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面CD45檢測結(jié)果
圖22本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面HLA-DR檢測結(jié)果圖23本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面CD14檢測結(jié)果圖24本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面CD34檢測結(jié)果圖25本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面79a檢測結(jié)果圖26本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面CD90檢測結(jié)果圖27本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面CD105檢測結(jié)果圖28本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液凍存I年，復(fù)蘇后48h細(xì)胞表面CD166檢測結(jié)果
具體實施例方式主要儀器及試劑儀器離心機(jī)Eppendorf5810R、流式細(xì)胞儀Beckman FC500、細(xì)胞計數(shù)儀羅氏CASYModel77、倒置相差顯微鏡奧林巴斯CKX41、C02培養(yǎng)箱Thermo8000 ；試劑0. 9%氯化鈉注射液購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)18AA5%氨基酸復(fù)方注射液購自山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司勃脈力A液(PLASMA-LYTE)購自上海百特醫(yī)療用品有限公司20%人血白蛋白購自成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司DMSO 購自 WAK-ChemieLG-DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清購自GIBCO人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基購自GIBCO0. 05% 胰酶-0. 02%EDTA 溶液購自 GIBCO
0. 25% 胰酶-0. 38g/L EDTA 溶液購自 GIBCO0. 04%臺盼藍(lán)染色液購自GIBCO人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化試劑盒購自GIBCO人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化試劑盒購自GIBCO菌素紅S購自Sigam油紅0購自Sigam多聚甲醛購自Sigam實施例I用本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液制備注射液I、制備本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞注射液
如表I所示凍存液的配方，取勃脈力A液、18AA 5%復(fù)方氨基酸注射液和20%人血白蛋白，混勻，加入臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞至細(xì)胞密度為I X IO7個/ml，再加入DMS0，即可。表I本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液配方

權(quán)利要求
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液，其特征在于它包含如下體積百分比的成分勃脈力A液25 75%18AA5%復(fù)方氨基酸注射液10 35%20%人血白蛋白I 50%DMSO5 20%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的凍存液，其特征在于它包含如下體積百分比的成分 勃脈力A液30 55%18AA5%復(fù)方氨基酸注射液10-35%20%人血白蛋白10-25%DMSO10 '20%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍存液，其特征在于它包含如下體積百分比的成分 勃脈力A液40 50%18AA5%復(fù)方氨基酸注射液15 25%20%人血白蛋白25%DMSO10% ο
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的凍存液，其特征在于它由如下體積百分比的成分組成 勃脈力A液50%18AA5%復(fù)方氨基酸注射液15%20%人血白蛋白25%DMSO10%。
5.一種間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，其特征在于它包含權(quán)利要求Γ4任意一項所述的間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液和間充質(zhì)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為I X IO5^l X IO8個/ml。
6.一種制備權(quán)利要求5所述間充質(zhì)干細(xì)胞注射液的方法，其特征在于它包括如下步驟 (1)按照權(quán)利要求廣4任意一項所述比例取勃脈力A液、18AA5%復(fù)方氨基酸注射液、20%人血白蛋白和DMSO ； (2)將步驟(I)勃脈力A液、18AA5%復(fù)方氨基酸注射液和20%人血白蛋白混勻，加入間充質(zhì)干細(xì)胞至細(xì)胞濃度為I X IO5^l X IO8個/ml，得細(xì)胞懸液； (3)將步驟(I)DMSO加入步驟(2)所得的細(xì)胞懸液，即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液，它包含如下體積百分比的成分勃脈力A液25~75%、18AA5%復(fù)方氨基酸注射液10~35%、20%人血白蛋白1~50%、DMSO5~20%。本發(fā)明還提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞注射液及其制備方法。本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液可克服現(xiàn)有細(xì)胞凍存液的缺陷，既能長時間維持間充質(zhì)干細(xì)胞的活率，又能直接臨床輸注，具有良好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號A61P37/06GK102792947SQ20121032153
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者任瑩瑩, 田甜, 馮學(xué)蓉 申請人:四川新生命干細(xì)胞科技股份有限公司