TNF-α受體-抗體融合蛋白在制備治療糖尿病周圍神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種TNF-α受體-抗體融合蛋白的用途，包括TNF-α受體-抗體融合蛋白在制備治療糖尿病周圍神經(jīng)病變、延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變、提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度或減輕神經(jīng)脫髓鞘的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：通過(guò)在DPN大鼠模型上給予TNF-α受體-抗體融合蛋白抑制TNF-α的功能，觀察其對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、神經(jīng)組織病理學(xué)改變及髓鞘堿性蛋白表達(dá)的影響，明確了TNF-a在DPN發(fā)病機(jī)制中的作用，證實(shí)了TNF-α受體-抗體融合蛋白可以有效延緩DPN大鼠的周圍神經(jīng)病變的進(jìn)展，改善DPN大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)的表現(xiàn)，減輕坐骨神經(jīng)的脫髓鞘，因而在制備治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的藥物中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】TNF-α受體-抗體融合蛋白在制備治療糖尿病周圍神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞因子TNF-α受體-抗體融合蛋白的用途，具體地說(shuō)，是TNF-α受體-抗體融合蛋白在制備治療糖尿病周圍神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是一種常見(jiàn)的慢性代謝性疾病，是全球患病率最高的疾病之一。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們生活方式的改變及人口的老齡化，糖尿病的發(fā)病率逐年上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界糖尿病患者人數(shù)已超過(guò)I億，隨著糖尿病發(fā)病率的上升，糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病率亦在不斷增長(zhǎng)。糖尿病神經(jīng)病變按神經(jīng)解剖可分以下幾類:周圍神經(jīng)病變、植物神經(jīng)病變、顱神經(jīng)病變、脊髓病變和腦部病變。其中糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic PeripheralNeuropathy，DPN)是最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，約60-90%的糖尿病患者合并周圍神經(jīng)病變。DPN包括對(duì)稱性周圍神經(jīng)病變、不對(duì)稱性周圍神經(jīng)病變和神經(jīng)根病變。最常累及的有股神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、正中神經(jīng)、橈神經(jīng)、尺神經(jīng)、腓腸神經(jīng)及股外側(cè)皮神經(jīng)等。早期癥狀以感覺(jué)障礙為主，但電生理檢查發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)及感覺(jué)神經(jīng)均有累及。感覺(jué)異常有麻木、蟻?zhàn)?、發(fā)熱、觸電樣感覺(jué)，往往從遠(yuǎn)端腳趾上行可達(dá)膝上，患者有穿襪子與戴手套樣感覺(jué)。感覺(jué)障礙嚴(yán)重的病例可出現(xiàn)下肢關(guān)節(jié)病及潰瘍。當(dāng)累及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)時(shí)，肌力常有不同程度的減退，晚期有營(yíng)養(yǎng)不良性肌萎縮。研究發(fā)現(xiàn)DPN是造成糖尿病患者下肢、足部慢性難治性潰瘍、干性壞疽、濕性壞疽、截肢(趾)的主要原因。而且DPN發(fā)病隱匿，約40%-60%的患者無(wú)明顯癥狀。在糖尿病早期，臨床上周圍神經(jīng)病變癥狀及體征多不明顯，但其神經(jīng)結(jié)構(gòu)、功能可能已受到損害，即周圍神經(jīng)出現(xiàn)節(jié)段性脫髓鞘改變，并常伴有軸突變性。
[0003]目前DPN病因尚未完全闡明，既往研究認(rèn)為是由于多種因素包括遺傳因素引起糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂和血管異常所致，其主要有以下學(xué)說(shuō):多元醇途徑學(xué)說(shuō)、非酶促蛋白糖基化學(xué)說(shuō)、脂代謝異常學(xué)說(shuō)、氧自由基損傷學(xué)說(shuō)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏學(xué)說(shuō)。臨床上針對(duì)以上發(fā)病機(jī)制的治療包括控制血糖、血壓、血脂，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)，抗氧化及改善微循環(huán)等，但效果不甚理想。一項(xiàng)研究顯示，盡管進(jìn)行強(qiáng)化綜合干預(yù)治療，平均隨訪13.3年，仍有55%的DM患病。因此提示可能存在其他因素在DPN中扮演重要角色。最近有證據(jù)表明免疫因素參與了 DPN的發(fā)生。由于遺傳背景的差異，部分患者可能更易于發(fā)生自身免疫紊亂，一般情況下，血-神經(jīng)屏障的保護(hù)作用使循環(huán)中的T細(xì)胞處于免疫耐受狀態(tài)。長(zhǎng)期高血糖可破壞神經(jīng)的血管屏障，同時(shí)神經(jīng)髓鞘蛋白糖基化后其抗原性改變，因此血循環(huán)或組織中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞可特異性識(shí)別糖基化的神經(jīng)髓鞘、暴露的外周神經(jīng)抗原，或胰腺和外周神經(jīng)共同抗原，吞噬后引起神經(jīng)髓鞘脫失和自身抗原成分的進(jìn)一步暴露。同時(shí)，活化的免疫細(xì)胞可過(guò)度表達(dá)一系列細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1 β等。 [0004]前期研究證實(shí)DPN患者和模型大鼠血液中TNF- α表達(dá)升高。TNF-a作為一種重要的多功能的免疫細(xì)胞因子，參與許多炎性、傳染性和自體免疫疾病的發(fā)展進(jìn)程，具有殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞、提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力、刺激產(chǎn)生其他細(xì)胞因子的作用。DPN的病理改變是無(wú)髓鞘神經(jīng)纖維軸突變性，而有髓鞘神經(jīng)纖維節(jié)段性或彌漫性皺縮，脫髓鞘。其中自身抗原成分暴露引起的免疫反應(yīng)是導(dǎo)致脫髓鞘的主要原因。T細(xì)胞在這些抗原的作用下產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子(包括TNF-a等)，后者上調(diào)了自身免疫應(yīng)答，介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)過(guò)程。另外發(fā)現(xiàn)，TNF-a對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞具有毒性作用，能引起脫髓鞘改變，并能刺激單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-1 β和IL-6等炎癥因子，以放大或間接增強(qiáng)其本身效應(yīng)。同時(shí)TNF-a尚可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(NOS)的活性，減弱NO所致的血管舒張作用，并促進(jìn)多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附因子的表達(dá)，引起內(nèi)皮功能紊亂和病理改變最終導(dǎo)致管腔狹窄、血流動(dòng)力學(xué)異常、灌注降低，損害了營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的血管。
[0005]然而，現(xiàn)有研究?jī)H證實(shí)DPN患者和模型大鼠血液中TNF- α表達(dá)升高，卻并不能證實(shí)TNF-a在DPN發(fā)病機(jī)制中所起的作用，因而無(wú)從得知抑制TNF_a對(duì)阻止DPN的發(fā)展能否起積極作用。
[0006]TNF-α受體-抗體融合蛋白，商品名賽益普，是一種采用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的重組融合蛋白，它可以特異性結(jié)合TNF，阻斷其與細(xì)胞表面TNF受體的相互作用，降低其活性。中國(guó)期刊《中國(guó)藥物與臨床》，2006年第7期，刊出的論文“重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有效性和安全性研究”，公開(kāi)了使用TNF-a受體-抗體融合蛋白治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；中國(guó)期刊《臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》，2008年11期，刊出的論文“重組人II型TNF受體-抗體融合蛋白對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血趨化因子受體CXCR4的表達(dá)調(diào)控作用”，公開(kāi)了使用TNF- α受體-抗體融合蛋白顯著地抑制CXCR4表達(dá)、降低BASDAI評(píng)分，同時(shí)也能有效地降低紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)炎癥活動(dòng)性指標(biāo)，有效地緩解和改善AS病情。但 是目前關(guān)于利用TNF- α受體-抗體融合蛋白抑制TNF- α治療DPN還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種TNF- α受體-抗體融合蛋白的用途。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
TNF-a受體-抗體融合蛋白在制備治療糖尿病周圍神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用；
TNF-a受體-抗體融合蛋白在制備延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用；
TNF-a受體-抗體融合蛋白在制備提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度的藥物中的應(yīng)用；
TNF-a受體-抗體融合蛋白在制備減輕神經(jīng)脫髓鞘的藥物中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
通過(guò)在DPN大鼠模型上，給予TNF-α受體-抗體融合蛋白抑制TNF-α的功能，觀察其對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、神經(jīng)組織病理學(xué)改變及髓鞘堿性蛋白(Myelin BasicProtein，MBP)表達(dá)的影響，明確了 TNF_a在DPN發(fā)病機(jī)制中的作用，證實(shí)了 TNF-α受體-抗體融合蛋白可以有效延緩DPN大鼠的周圍神經(jīng)病變的進(jìn)展，改善DPN大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)的表現(xiàn)，減輕坐骨神經(jīng)的脫髓鞘，在制備治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的藥物中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0010]附圖1是治療前各組間神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)比較。并立的四個(gè)柱子從左至右依次是:正常組、DPN組、DPN+T1組、DPN+T2組。
[0011]附圖2是治療后各組間神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)比較。并立的四個(gè)柱子從左至右依次是:正常組、DPN組、DPN+T1組、DPN+T2組。
[0012]附圖3是各組治療前后的MNCV比較。
[0013]附圖4是各組治療前后的SNCV比較。
[0014]附圖5是各組大鼠坐骨神經(jīng)HE染色結(jié)果圖。A:正常組(100X)，B:DPN+T2組(100X )，C:DPN 組(100X )，D:DPN 組(300X )。
[0015]附圖6是各組大鼠髓鞘勞克-堅(jiān)牢藍(lán)染色結(jié)果(橫狀位)。A:正常組(100X )，B:DPN+T2 組(100X)，C:DPN 組(100X)，D:DPN 組(300X)。
[0016]附圖7是各組大鼠髓鞘勞克-堅(jiān)牢藍(lán)染色結(jié)果(縱狀位)。六-正常組^。?！?，B:DPN+T2 組(100X )，C:DPN 組(100X )，D:DPN 組(300X )。
[0017]附圖8是各組大鼠坐骨神經(jīng)透射電鏡圖片。第一排從左至右為A、B，第二排從左至右為 C、D。A:正常組(4000X )，B:DPN+T2 組(4000X)，C:DPN 組(4000X )，D:DPN 組(13000X )。
[0018]附圖9是MBP在坐骨神經(jīng)上的表達(dá)?！?正常組(300\)，8觀奸了2組(300父)，(::DPN 組(300X )。
[0019]附圖10是各組MBP的表達(dá)。
[0020]附圖11 是各組 western-blot 結(jié)果。1:DPN 組，2:DPN+T1 組，3:DPN+T2 組，4:正常`組。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0022]一、實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6周齡(140-160g)的Wistar大鼠，雄性，共60只，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。動(dòng)物使用符合上海市動(dòng)物管理委員會(huì)管理?xiàng)l例。單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室安靜，保持溫度為20±2°C，相對(duì)濕度為60%，光照時(shí)間12h/天，清潔飲水，造模前標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。
[0023]清潔級(jí)大鼠普通維持飼料，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心；高脂、高糖飼料，即在清潔級(jí)大鼠普通維持飼料中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%豬油和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%蔗糖，混勻干燥后照射消毒滅菌。
[0024]兔抗大鼠MBP單克隆抗體,購(gòu)自Sigma公司；辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗，購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；TNF-a受體-抗體融合蛋白，購(gòu)自上海中信國(guó)健藥業(yè)股份有限公司；鏈脲霉素(STZ)，購(gòu)自Sigma公司。
[0025]二、實(shí)驗(yàn)方法
I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、DPN大鼠模型的建立和治療
分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被分成4組，每組各12只。正常組、DPN組、DPN+低劑量TNF-α受體-抗體融合蛋白組(0.4mg/Kg/次，簡(jiǎn)稱DPN+T1組)和DPN+高劑量TNF- α受體-抗體融合蛋白組(4mg/Kg/次，簡(jiǎn)稱DPN+T2組)。
[0026]DPN大鼠模型的建立:DPN組、DPN+T1組與DPN+T2組大鼠采用高脂、高糖飼料。高月旨、高糖飼料喂養(yǎng)6周后，腹腔注射STZ 30mg / kg，注射前禁食12h以上但不禁水。造模后48h測(cè)大鼠空腹血糖(測(cè)試前禁食12h)，以血糖高于16.7mmol/L為大鼠2型糖尿病模型造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后繼續(xù)高脂、高糖飼料喂養(yǎng)4周，即建立DPN模型。
[0027]治療方法:正常組大鼠采用清潔級(jí)大鼠普通維持飼料。DPN+T1組與DPN+T2組分別皮下注射TNF- α受體-抗體融合蛋白0.4mg/Kg/次和4mg/Kg/次，2次/周，連續(xù)4周。DPN組與正常組皮下注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要定期監(jiān)測(cè)各組血糖水平，保證DPN組、DPN+T1組與DPN+T2組在治療后的血糖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0028]2坐骨神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)測(cè)定
于治療前和治療后分別測(cè)定大鼠的坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)，包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(Motor Nerve Conduction Velocity, MNCV)和感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(Sensory NerveConduction Velocity, SNCV)?
[0029]3神經(jīng)組織病理學(xué)改變的觀察 3.1 DPN大鼠坐骨神經(jīng)標(biāo)本的收集
3.1.1光鏡標(biāo)本的采集
腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，分離雙側(cè)坐骨神經(jīng)，取長(zhǎng)約Icm置于10%甲醛固定待作光鏡。1%鋨酸染色，常規(guī)脫水、石蠟包埋，精密輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國(guó)LEICA RM2135型)連續(xù)切片，厚5 μ m。
[0030]3.1.2電鏡標(biāo)本的采集
剝離神經(jīng)，在戊二醛中取樣`l*l*(3-4)mm，兩端用刀切平，勿剪；神經(jīng)縱向分成四部分，利于固定液滲入；保存于0-4°C冰箱，勿使戊二醛結(jié)冰。
[0031]3.2 HE 染色 具體染色方法如下:
1)二甲苯I脫蠟IOmin左右(自動(dòng)染色機(jī)染IOmin)；
2)二甲苯I1、III脫蠟5min左右(自動(dòng)染色機(jī)染IOmin)；
3)無(wú)水酒精(乙醇)I洗去二甲苯Imin(機(jī)染Imin)；
4)無(wú)水酒精(乙醇)II洗去二甲苯Imin(機(jī)染Imin)；
5)95% 酒精 Imin (機(jī)染 Imin)；
6)85% 酒精 Imin (機(jī)染 Imin)；
7)75% 乙醇 Imin ；
8)蒸餾水洗2min；
9)蘇木素染色5-20min(可以根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整時(shí)間)，自來(lái)水沖洗；
10)分化液分化30s；
11)自來(lái)水浸泡15min或溫水(約50°C) 5min ；
12)置伊紅液2min；
13)自來(lái)水沖洗；
14)常規(guī)脫水，透明，封片:95%乙醇(I)min— 95%乙醇(II) Imin — 100%乙醇(I )Imin — 100 % 乙醇(II ) Imin — 二甲苯石碳酸(3:1) Imin — 二甲苯(I ) Imin — 二甲苯
(II)lmin—中性樹(shù)脂封固。鏡下觀察。
[0032]3.3堅(jiān)牢藍(lán)染色具體染色方法如下:
1)脫蠟水化至95%酒精；
2)LFB (堅(jiān)勞藍(lán))600C 2-5h瓶密封(新配時(shí))或37°C過(guò)夜最佳；
3 ) 95%酒精(沖洗，洗凈)；
4)蒸餾水洗(流水沖洗干凈)；
5)0.05%碳酸鋰溶液5s，注意，使用后要經(jīng)常更換，保持新鮮；
6)70%酒精兩次；
7)蒸餾水洗(流水沖洗干凈)；
8)顯微鏡下觀察，重復(fù)5-7次至白質(zhì)和灰質(zhì)有鮮明對(duì)比，標(biāo)準(zhǔn):核無(wú)色，髓鞘在淺灰/藍(lán)色背景下呈綠寶石色；
9)70%酒精洗;
10)0.5%伊紅浸一下(新配)，乙醇性依紅好(可不用)；
11)蒸餾水洗；
12)Cresyl violet (結(jié)晶紫)浸一下(新配);
13)70%酒精洗至可見(jiàn) 核和尼氏小體呈紫色，大約30s ；
14)蒸餾水洗；
15)脫水95%酒精I(xiàn)次，100%酒精2次(快)吹干二甲苯透明，封片；
16)結(jié)果:髓鞘藍(lán)色，尼氏小體和神經(jīng)細(xì)胞紫色，紅細(xì)胞寶藍(lán)色。
[0033]3.4電鏡觀察
取2.5%戊二醛固定的坐骨神經(jīng)組織，用1%鋨酸固定，Epon812包埋，超薄切片，乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙染色，乙醇丙酮梯度脫水，透射電鏡(Philips CM 120)觀察。
[0034]4免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)MBP的表達(dá)
4.1免疫組織化學(xué)染色及切片制作
切片入0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2-7.4)漂洗3次，每次5min。然后入含有10%正常兔血清中，37°C孵育Ih。將切片放入稀釋后的第一抗體(兔抗鼠1:400)中，37°C孵育4h，移入4°C冰箱孵育48-72h。然后經(jīng)PBS漂洗3次，切片入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(HRP 羊抗兔 IgG 1:2000)，37°C孵育 lh。PBS 漂洗 3 次，再用 0.lmol/L Tris-HCL緩沖液洗5min。切片挑入0.05% DAB+0.05mol/L Tris-HCL緩沖液，加3%過(guò)氧化氫1-2滴顯色，反應(yīng)需5-15min，顯微鏡下觀察監(jiān)控呈色反應(yīng)。切片入0.05mol/L Tris-HCL緩沖液終止反應(yīng)，洗去非特異性著色。貼片，晾干，透明，封片，鏡下觀察。
[0035]4.2陰性對(duì)照及免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)
對(duì)照實(shí)驗(yàn):以正常兔血清和PBS代替一抗，同步進(jìn)行上述免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果為陰性。光鏡下(100X)對(duì)各組大鼠腦片免疫陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每一腦片在皮層和海馬
隨機(jī)取6個(gè)視野，求其算術(shù)平均值，最后測(cè)定結(jié)果均以X 土 S表示。
[0036]5 Western-blot 方法檢測(cè) MBP 的表達(dá)
5.1 SDS-PAGE凝膠的制備
先在制膠用的兩層玻璃板中加入新鮮配制的5ml 10%分離膠，然后加％0壓膠30min凝固后將水到出，并用濾紙洗干分離膠的表面，然后灌入新鮮配制的5%濃縮膠，插入梳子，待膠凝固后放入裝有1% SDS電泳緩沖液的電泳槽中拔出梳子。
[0037]5.2加樣和電泳
蛋白樣本融化后加等體積2% SDS上樣緩沖液短暫離心，煮沸3min，每個(gè)泳道中加等體積樣品10-20 μ 1，采用Mini Trans-Blot電泳儀(Bio-Rad公司)先用IOOV電泳待樣品指示線到達(dá)分離膠和濃縮膠分界線時(shí)將電壓調(diào)至120V，待溴酚藍(lán)電泳至分離膠底部時(shí)結(jié)束電泳。
[0038]5.3 轉(zhuǎn)膜
采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，電泳結(jié)束后取出凝膠，切除分離膠及多余的泳道，在轉(zhuǎn)膜夾板的兩層海綿之間叢負(fù)極到正極依次放置修剪好的濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙，放入電泳槽中(膠在負(fù)極側(cè)，膜在正極側(cè))，電泳槽中加滿預(yù)冷的電泳緩沖液，0°C，30V恒定電壓，轉(zhuǎn)膜9h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜用麗春紅染色約3-5min，然后用自來(lái)水漂洗以觀察轉(zhuǎn)移效果；同時(shí)用考馬斯亮藍(lán)對(duì)凝膠進(jìn)行染色約半小時(shí)，脫色，觀察蛋白轉(zhuǎn)膜的充分性。濾紙和海綿應(yīng)放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30min，PVDF膜在甲醇中預(yù)濕30min。
[0039]5.4 封閉
將PVDF膜浸入含10%的脫脂奶粉辣根過(guò)氧化物美的TBST的封閉液中，置于水平搖床上，室溫封閉Ih，然后用TBST清洗3次，每次5min。
[0040]5.5免疫印跡
用TBST配制一抗(羊抗鼠1:400)，將PVDF膜的放入配好的抗體稀釋液中，保證抗體吸附面全部與液體接觸，中間無(wú)氣泡，4°C過(guò)夜，TBST清洗3次，每次IOmin ;用TBST配制HRP標(biāo)記的兔抗山羊二抗(工作濃度為1: 2000)。
[0041]5.6 ECL發(fā)光及顯影
取ECL試劑盒的A液和B液各0.5ml，混勻后與膜于室溫下作用60s，用平頭鑷鉗住膜片，垂直置于吸水紙以吸去過(guò)量試劑，置膜片于二層保鮮膜之間，小心趕盡氣泡，將膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中，于暗室中壓上X片，曝光2-5min，顯影液顯影40s，定影液定影2min,水洗IOmin,晾干。
[0042]5.7結(jié)果分析
以β-actin作為內(nèi)參照，以證明各組蛋白上樣量相等，上述硝酸纖維素膜洗膜后與β -actin的一抗結(jié)合，再與二抗結(jié)合，ECL顯色，X光膠片曝光。將X光膠片采用Bio-Rad2000型凝膠成像系統(tǒng)在白光下掃描后，應(yīng)用QUANTITY ONE軟件(Bio-Rad公司)進(jìn)行吸光度分析，以MBP/ β -actin比值表示各組蛋白表達(dá)水平。
[0043]6統(tǒng)計(jì)方法
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.0。將所有樣品的MBP/β-actin比值，免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行Independent-samples t檢驗(yàn)分析。
[0044]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
I治療前后各組間NCV的變化
研究發(fā)現(xiàn)治療前DPN各組間NCV數(shù)值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。治療后DPN+T1組NCV高于DPN組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而DPN+T2組MNCV和SNCV明顯高于DPN組(P〈0.05)。具體結(jié)果參見(jiàn)表1、表2及圖1、圖2。
[0045]表1治療前各組NCV (m/s)
【權(quán)利要求】
1.TNF-α受體-抗體融合蛋白在制備治療糖尿病周圍神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用。
2.TNF-α受體-抗體融合蛋白在制備延緩糖尿病周圍神經(jīng)病變藥物中的應(yīng)用。
3.TNF-α受體-抗體融合蛋白在制備提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度的藥物中的應(yīng)用。
4.TNF-α受體-抗體融合蛋白在制備減輕神經(jīng)脫髓鞘的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P3/10GK103656620SQ201210342183
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月17日
【發(fā)明者】陳英輝, 施曉紅, 許國(guó)雄, 李炳, 陳碧琴 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院