專利名稱：廣藿香醇的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及廣藿香醇的新用途。
背景技術(shù)：
柯薩奇病毒(Coxsaekieviurs),屬小核糖核酸病毒科(Picomaviridea),腸道病毒屬(Enteiroviurs)，根據(jù)其對(duì)乳鼠致病能力的不同可分為A組和B組。該類病毒，沒(méi)有套膜，正股RNA，正20面體蛋白殼體的病毒，它的基因體在5'端有一個(gè)蛋白是用來(lái)當(dāng)作RNA復(fù)制的prime。其中，柯薩奇病毒B (Coxsackievirusgroup B,CVB)可引起流行性胸痛、無(wú)菌性腦炎、腦膜腦炎和心包炎，尤其CVB3是病毒性心肌炎的主要病原體，能引起心肌組織發(fā)生灶性壞死，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞裂解等病理改變，病毒持續(xù)感染可導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病，給人類帶來(lái)了極大的威脅。20世紀(jì)90年代以來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)不少新的抗病毒藥物，目前在臨床上應(yīng)用的抗病毒藥物已超過(guò)20余種，但其確切療效仍有很大爭(zhēng)議。因?yàn)椴《臼羌纳谒拗骷?xì)胞內(nèi)，要保證抗病毒的藥物具有高度選擇性，既要能進(jìn)入細(xì)胞，選擇性地有效干擾病毒的復(fù)制過(guò)程，又要避免傷害宿主細(xì)胞，這是抗病毒尤其呼吸道病毒西藥中多存在選擇性高和毒副作用高的主要原因。如利巴韋林，會(huì)損傷紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致溶血性貧血。因此，抗病毒藥物的研究具有重要的實(shí)際意義，尋找一種高效、安全、副作用少的抗病毒藥物的研究勢(shì)在必行。廣藿香醇，為廣藿香揮發(fā)油的主要成分，是歷版《中國(guó)藥典》規(guī)定的評(píng)價(jià)廣藿香藥材及廣藿香油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)性成分。廣藿香醇又稱百秋李醇，是一種存在天然植物中的三環(huán)倍半萜化合物，其分子式為C15H26O,分子量為222. 37，結(jié)構(gòu)如下
H:tC CHri廣藿香醇單體為無(wú)色晶體，有較淡的廣藿香香氣，其熔點(diǎn)為55 56°C，沸點(diǎn)2800C (常壓下)，相對(duì)密度為I. 0284，旋光度-97. 4° (c = 24，氯仿);不溶于水，溶于醇、醚和常用有機(jī)溶劑?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，廣藿香醇具有抗炎、抑菌、抗雛蟲(chóng)、抗氧化、拮抗I丐離子異常升高等藥理活性，有一定的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。目前，還未見(jiàn)使用廣藿香醇抗柯薩奇病毒以及治療柯薩奇病毒感染性疾病的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
CH
本發(fā)明的目的在于提供廣藿香醇的醫(yī)藥新用途。本發(fā)明提供了廣藿香醇在制備抗腸道病毒屬病毒的藥物中的用途。其中，所述腸道病毒屬病毒是柯薩奇病毒。進(jìn)一步地，所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒B組。進(jìn)一步地優(yōu)選地，所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒B組3型C0XSackieViruSB3。其中，所述藥物是治療柯薩奇病毒感染性疾病的藥物。進(jìn)一步地，所述柯薩奇病毒感染性疾病是流行性胸痛、無(wú)菌性腦炎、腦膜腦炎、心包炎或病毒性心肌炎。其中，所述藥物是由廣藿香醇為活性成分，加入藥學(xué)上常用的輔料制備而成的制劑。進(jìn)一步地，所述制劑為口服制劑、注射制劑或外用制劑。廣藿香醇能夠有效抑制柯薩奇病毒B組3型合成，具有一定的抗柯薩奇病毒作用，可用于治療柯薩奇病毒感染性疾病，尤其是柯薩奇病毒B組3型感染性疾??；同時(shí)，廣藿香醇對(duì)宿主細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于陽(yáng)性藥物利巴韋林，毒副作用更低，為臨床用藥提供了一種安全有效的新選擇。
具體實(shí)施例方式廣藿香醇，可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)市售商品得到，也可通過(guò)現(xiàn)有分離純化方法制備得到。本發(fā)明具體實(shí)施方式
中所用廣藿香醇，經(jīng)鑒定后，純度大于95%。實(shí)施例I廣藿香醇抗柯薩奇病毒的作用I、材料及儀器I. I細(xì)胞株和病毒株I. I. I 細(xì)胞株HeIa細(xì)胞(宮頸癌細(xì)胞)，購(gòu)自中國(guó)藥品與生物制品檢定所。1.1.2 病毒株柯薩奇病毒B組3型(以下可簡(jiǎn)稱CVB-3)，源自四川省臨檢中心提供的臨床分離株。I. 2藥物及對(duì)照藥物試驗(yàn)藥物廣藿香醇。陽(yáng)性藥物利巴韋林注射液規(guī)格為100mg/ml，天津藥業(yè)焦作有限公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字H19992467，生產(chǎn)批號(hào)10110521 ；I. 3培養(yǎng)基、試劑及耗材RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco 公司，批號(hào)1313945);胎牛血清(HyClone生物化學(xué)制品(北京)有限公司，批號(hào)NVM0347);胰蛋白酶(Amresco公司)；青霉素G鈉、鏈霉素?zé)o菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)。l、5、10ml —次性吸管，200 μ I、Iml —次性槍頭(江蘇海門(mén)生物耗材公司)I. 4主要儀器隔水式恒溫CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)MC0-15AC,日本三洋公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào)Varioskan Flash,美國(guó) Thermo Scientific 公司)；
OLYMPUS倒置顯微鏡(型號(hào)CKX41，日本奧林巴斯公司)；
微量移液器(法國(guó)GILSON公司生產(chǎn))；
隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)GSV-DA-I，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠)；
水平離心機(jī)(型號(hào)LXJ-II，上海醫(yī)用分析儀器廠)；
電子天平(型號(hào)JA-2603，上海天平儀器廠)
2、試驗(yàn)方法
2. I藥物及陽(yáng)性對(duì)照的前處理
將廣藿香醇先與大豆油以2:1的體積比混合，然后加0. 5%吐溫-80助溶為白色液體制劑，其初始濃度為100mg/ml,過(guò)濾除菌后備用。
將用于柯薩奇病毒的陽(yáng)性對(duì)照藥物利巴韋林注射液用無(wú)菌水做1/10稀釋(即10mg/ml)以備用。
2. 250%組織細(xì)胞感染劑量的測(cè)定
柯薩奇病毒B3用3%胎牛血清RPMI-1640稀釋成不同濃度的病毒液。
柯薩奇病毒B3株接種Hela細(xì)胞，于37°C，5%C02孵箱中培養(yǎng)7d后觀察感染細(xì)胞
圓縮、脫落等細(xì)胞病變(cytopathiceffect，CPE)情況，以測(cè)定各病毒引起50%組織細(xì)胞病變的感染劑量(50%tissue culture infective dose, TCID5tl)。2. 3廣藿香醇的細(xì)胞毒性測(cè)定將配制好備用的廣藿香醇預(yù)先100倍稀釋，將配置好備用的廣藿香醇和陽(yáng)性對(duì)照藥利巴韋林用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液連續(xù)對(duì)倍稀釋7個(gè)濃度加入到Hela單層細(xì)胞中，不同稀釋度各藥物均重復(fù)3孔。37°C、5%C02培養(yǎng)5天，每天觀察細(xì)胞病變情況(CPE)。以引起半數(shù)細(xì)胞發(fā)生病變的藥物濃度判定為半數(shù)毒性濃度(TC5tl),以完全不引起細(xì)胞發(fā)生病變的藥物濃度判定為最大無(wú)毒濃度(TCtl)15實(shí)驗(yàn)設(shè)連續(xù)對(duì)倍稀釋的O. 5%吐溫-80和正常細(xì)胞對(duì)照。2. 4抗病毒實(shí)驗(yàn)根據(jù)病毒的復(fù)制周期，設(shè)計(jì)廣藿香醇抗病毒作用的三種途徑，每種病毒進(jìn)行三組給藥途徑實(shí)驗(yàn)，每一組都設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組。具體操作如下 2. 4. I藥物抗病毒生物合成實(shí)驗(yàn)(先上毒)將100μ 1XTCID50的相應(yīng)病毒液加入生長(zhǎng)完好的對(duì)應(yīng)單層細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C，5%C02孵育2h后，棄去病毒液，再加入不同濃度的廣藿香醇液100 μ I和細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。2. 4. 2藥物抗病毒吸附實(shí)驗(yàn)(先上藥)將不同濃度的廣藿香醇培養(yǎng)液100μ I加入生長(zhǎng)完好的單層細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C，5%C02孵育2h后，棄去含藥培養(yǎng)液，再加入100 μ I X TCID50的相應(yīng)病毒液，37°C，5%C02孵育2h后，棄去病毒液，再加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。2. 4. 3藥物直接作用實(shí)驗(yàn)(中和)將不同濃度的100μ I廣藿香醇培養(yǎng)液和100μ 1XTCID50的相應(yīng)病毒液混合，37°C，5%C02孵育2h后，再加入到生長(zhǎng)完好的對(duì)應(yīng)單層細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C，5%C02孵育2h后，棄去含藥與病毒培養(yǎng)液，再加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。
各培養(yǎng)板于37°C、5%C02繼續(xù)培養(yǎng)5d，每天顯微鏡下觀察CPE。應(yīng)用Reed-Muench法計(jì)算各藥物的50%細(xì)胞病變抑制濃度(50%inhibiting concentration, IC50),以藥物最高稀釋度出現(xiàn)的IC50值作為抗病毒效果判斷的終點(diǎn)。以上廣藿香醇的每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及藥效學(xué)指標(biāo)計(jì)算3. I 病毒的 TCID5tl 值柯薩奇病毒B3接種Hela細(xì)胞后約5天出現(xiàn)CPE?？滤_奇病毒B3的TCID5tl效價(jià)均為10_12。3. 2廣藿香醇的細(xì)胞毒性在受試時(shí)間內(nèi)，正常對(duì)照孔的細(xì)胞形態(tài)正常。廣藿香醇對(duì)三種細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表I。表I廣藿香醇和利巴韋林的細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.廣藿香醇在制備抗腸道病毒屬病毒的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述腸道病毒屬病毒是柯薩奇病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒B組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述柯薩奇病毒為柯薩奇病毒B組3型Coxsackievirus B30
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述藥物是治療柯薩奇病毒感染性疾病的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述柯薩奇病毒感染性疾病是流行性胸痛、無(wú)菌性腦炎、腦膜腦炎、心包炎或病毒性心肌炎。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述藥物是由廣藿香醇為活性成分，加入藥學(xué)上常用的輔料制備而成的制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述制劑為口服制劑、注射制劑或外用制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了廣藿香醇在制備抗柯薩奇病毒的藥物中的用途。廣藿香醇能夠有效抑制柯薩奇病毒B組3型合成，具有一定的抗柯薩奇病毒作用，可用于治療柯薩奇病毒感染性疾病，尤其是柯薩奇病毒B組3型感染性疾病；同時(shí)，廣藿香醇對(duì)宿主細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于陽(yáng)性藥物利巴韋林，毒副作用更低，為臨床用藥提供了一種安全有效的新選擇。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102920686SQ201210421298
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者彭成, 魏曉露, 熊亮, 萬(wàn)峰 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)