專利名稱：成纖維細胞生長因子-10脂質(zhì)體制備及在毛發(fā)再生中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有成纖維細胞生長因子一 10(FGF—10)蛋白的，用于治療脫發(fā)疾病的脂質(zhì)體的制備及應(yīng)用，屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
作為皮膚的附屬器官，毛發(fā)具有重要的生理學(xué)與社會學(xué)功能。毛發(fā)缺失或異常分布盡管沒有生命之憂，但因其嚴(yán)重影響患者的外觀形象，會導(dǎo)致患者心理負擔(dān)過大，使得他們在激烈的社會競爭和人才競爭中處于非常不利的地位，對社會交往和患者心理健康的影響不容否認(rèn)。隨激烈的社會競爭和環(huán)境日益惡化，毛發(fā)疾病呈上升勢態(tài)。據(jù)世界毛發(fā)再生協(xié)會發(fā)布的對全球80多 個國家的調(diào)查顯示，全球大概有27.3%的人面臨著頭發(fā)再生障礙問題困擾，發(fā)達國家高于世界平均水平。歐洲最高達到44.3%，而亞洲國家中，中國比率高達36.8%，位居亞洲各國之首。脫發(fā)治療類藥物市場分析研究報告表明在全球OTC市場上，生發(fā)劑治療用藥占皮膚外用藥總體市場份額的7%，已達4.8億美元，其年均增長率達17%，高于世界OTC藥物市場8%的年均增長率。目前國內(nèi)外用于治療脫發(fā)的藥品主要有以下三種，米諾地爾溶液劑、安體舒通乳液、非那雄胺片。其中米諾地爾是唯一被美國FDA批準(zhǔn)治療脫發(fā)的OTC藥物。該藥物經(jīng)頭皮吸收后可以擴張頭皮下血管，改善毛囊周圍的微循環(huán)，減少毛囊周圍的炎癥細胞浸潤，延緩上皮基質(zhì)細胞的衰老，從而使萎縮的毛囊肥大并促進毛發(fā)的生長，使毳毛變成終毛。但它主要是針對雄激素性脫發(fā)有較好的療效，且具有一定的副作用包括刺激皮膚、可能引致皮膚紅疹、痕癢等。其它生發(fā)產(chǎn)品包括中藥及化妝品類等治療效果不明顯，主要原因是藥物或其他產(chǎn)品透皮吸收性能差，作用物質(zhì)到達不了病灶部位或濃度極其微量，治療效果甚微甚至無效。隨基因工程技術(shù)的日益發(fā)展，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子-10(FibrOblastGrowthFactor-10, FGF-1O)等生長因子類蛋白在人體外實驗和動物體內(nèi)外實驗中對毛發(fā)的生長有明顯的調(diào)節(jié)作用，己成為該領(lǐng)域研究的熱點。成纖維細胞生長因子一 10是由成纖維細胞和其它間充質(zhì)來源的細胞分泌，能與表達于上皮細胞激酶受體FGFR2IIIb和FGFRiIIIb相結(jié)合，通過問質(zhì)上皮相互作用的旁分泌方式發(fā)揮作用。其專一靶細胞是表皮細胞，能刺激所有皮膚內(nèi)的表皮基本單位包括頭發(fā)毛囊、皮脂腺、汗腺生長。FGF — 10在人體外實驗和動物體內(nèi)外實驗中對毛發(fā)的生長有明顯的調(diào)節(jié)作用。但在應(yīng)用時，即使毛囊細胞仍然存在的情況下，生物活性物質(zhì)的作用總是不理想。主要原因是毛囊生長的關(guān)鍵部位在毛母質(zhì)和毛乳頭，但生物活性物質(zhì)穩(wěn)定性差，并在皮膚局部外用難以穿透皮膚角質(zhì)層及毛囊細胞膜到達毛囊毛球部發(fā)揮其作用。因此，如何解決蛋白類藥物的穩(wěn)定性及透皮吸收達到促毛囊生長的有效部位是開發(fā)此類藥物的關(guān)鍵性問題。毛發(fā)疾病的治療主要存在兩個重要問題，一方面病變局限于有毛部位，若全身給藥到達皮膚局部的藥物濃度極其有限，而若要使局部達到理想治療濃度，勢必會引起全身毒副作用；另一方面局部給藥，由于透皮吸收性能差，藥物到達不了病灶部位或濃度極其微量，治療效果甚微甚至無效。因此興起研究具有良好透皮性能的外用藥物制劑如脂質(zhì)體劑型，它能夠介導(dǎo)各種分子特異性進入皮膚和細胞膜，使外源蛋白直接到達病灶部位，充分發(fā)揮其功效。本研究首次將FGF-1O制備成脂質(zhì)體新劑型，用于脫發(fā)疾病的治療，不僅可以透皮吸收直接作用于毛囊生長的關(guān)鍵部位毛母質(zhì)和毛乳頭，達到治療效果，同時還延長外源蛋白的穩(wěn)定性及在體內(nèi)的作用時間。結(jié)果表明，對脫發(fā)疾病具有巨大的潛在治療價值，可開發(fā)成為針對雄激素性脫發(fā)、斑禿、脂溢性脫發(fā)及放化療后的脫發(fā)等修復(fù)治療作用的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過利用脂質(zhì)體制劑能介導(dǎo)各種分子特異性進入皮膚和細胞膜的特性，增加了脂質(zhì)體結(jié)合的生物活性蛋白FGF-1O在體內(nèi)外穩(wěn)定性及其對皮膚滲透力，提高了其在毛囊生長的關(guān)鍵部位毛母質(zhì)和毛乳頭的生物利用度。本項目旨在提供一種制備方法簡單、治療周期短、效果顯著的治療脫發(fā)疾病的方法。本發(fā)明目的是提供FGF-1O脂質(zhì)體制備方法。本發(fā)明進一步目的是在于提供FGF-1O脂質(zhì)體在脫發(fā)疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明還可應(yīng)用于生物美容及燒燙傷、難愈性潰瘍的臨床治療。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的:本發(fā)明FGF —10脂質(zhì)體成凍干粉狀態(tài)，有助于生物蛋白及脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。應(yīng)用時加緩沖溶液使其變成脂質(zhì)體溶液后涂抹，易在皮膚上滯留，并具緩釋作用。同時本產(chǎn)品對皮膚無刺激性及無毒副作用。本發(fā)明提供了一種重組人成纖維細胞生長因子一 10脂質(zhì)體的制備方法。按照發(fā)明的實施例方案， 大豆磷脂重量(g / ml) 1.0% 5.0%、膽固醇重量(g / ml)0.25%
1.25%，優(yōu)選大豆磷脂2.0%,(g / ml)膽固醇0.5% (g / ml)制備磷脂膜。低分子量肝素重量(mg / ml)0.1% 1.0%，優(yōu)選0.5% (mg / ml)作為保護細胞活性，并減緩其釋放。作為磷脂溶解劑無水乙醇體積為(ml / ml) 100% 200%,優(yōu)選100% (ml / ml)。作為凍干過程中的賦形劑和保護劑，甘露醇重量(g / ml)2% 10.0%，優(yōu)選5% (g /ml)。緩沖溶液可選擇pH6.5左右的0.9%生理鹽水或20miVlPBS溶液。在本發(fā)明的脂質(zhì)體劑型中，重組人成纖維細胞生長因子-10每IOOml含量為Img IOmg,優(yōu)選 5mg / 100ml。本發(fā)明還提供了脂質(zhì)體的制備方法，包括通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制備磷脂膜及0.9%生理鹽水或20mMPBS溶液水化洗膜后4。C孵育過夜；采用微射流法，使脂質(zhì)體粒徑均勻，并通過濾膜整粒，制備成空白脂質(zhì)體；將空白脂質(zhì)體溶液與FGF-1O、低分子量肝素混合，37°C水浴旋轉(zhuǎn)孵育，0.22社m濾膜除菌過濾加入5%甘露醇作為賦形劑混和均勻，分裝，凍干，制備成成纖維細胞生長因子-10脂質(zhì)體劑型。本發(fā)明具有以下優(yōu)點:1.本發(fā)明采用薄膜分散一凍干再水化法制備成纖維細胞生長因子-10脂質(zhì)體劑型，能夠提高大分子生物蛋白的包封率，更好地保持蛋白的穩(wěn)定性。2.本發(fā)明脂質(zhì)體制劑用緩沖液溶解后易在皮膚上滯留，并具有良好透皮性能，能夠介導(dǎo)FGF-1O蛋白特異性進入皮膚和細胞膜，使其直接到達病灶部位，充分發(fā)揮其功效，并在一定程度上起到緩釋作用，延長藥物的半衰期，使其作用更加持久。
3.本發(fā)明產(chǎn)品可直接涂抹于脫發(fā)的部位，無需進行微創(chuàng)導(dǎo)入，減輕了患者使用時的顧慮，增加患者的依從性和便于使用。4.本發(fā)明配伍合理，可達到穩(wěn)定負載FGF-1O蛋白于脂質(zhì)體中，并保持其生物活性、延緩釋放的作用，促進毛囊的生長。采用的組分均對皮膚無毒副作用、無刺激性，便于清潔。


圖1 C57BL / 6小鼠在給藥第13天毛發(fā)生長狀況圖2 C57BL / 6小鼠在給藥第18天毛發(fā)生長狀況圖3 C57BL / 6小鼠在給藥第13天脫毛區(qū)皮膚組織病理學(xué)檢查圖4C57BL/6小鼠在給藥第18天脫毛區(qū)皮膚組織病理學(xué)檢查
A:正常對照組 B:rhFGF-10 脂質(zhì)體組(50 μ g/ml) C:rhFGF_10 脂質(zhì)體組(10 μ g/ml)D:rhFGF-10 溶液組(50 μ g/ml) E:rhFGF-10 溶液(10 μ g/ml) F:陽性對照組(5%米諾地爾溶液組)
G:0.9%生理鹽水對照組H:空白脂質(zhì)體對照組I:rhFGF-10 脂質(zhì)體組(50 μ g/ml) 2:rhFGF_10 脂質(zhì)體組(10 μ g/ml)
3:陽性對照組(5%米諾地爾溶液組)4:rhFGF-10溶液組(50 μ g/ml)
5:rhFGF-10溶液(10μ g/ml)6:0.9%生理鹽水對照組7:空白脂質(zhì)體對照組
具體實施例方式 實施例1生產(chǎn)加載FGF-10的脂質(zhì)體稱取大豆卵磷脂、膽固醇，加乙醇并加熱至55。C超聲，使其充分溶解，移入茄型瓶中，55。C，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使磷脂膜均勻覆蓋在茄型瓶側(cè)壁，并使乙醇溶劑完全揮發(fā)。為將生物蛋白包裹在脂質(zhì)體中，常壓下，加一定比例的生理鹽水(或20mMPBS溶液)，通過旋轉(zhuǎn)洗膜至水合完全，并4。C孵育過夜。采用微射流法，開始時控制壓力為50-60 MPa(粒徑較大，故壓力小些)，第2次開始，壓力增加至120 MPa,反復(fù)操作，使脂質(zhì)體粒徑均勻，溶液逐漸變微藍，再依次通過0.45扯m，0.22 u m濾膜整粒、除菌。將空白脂質(zhì)體溶液與FGF-1O、低分子量肝素混合，37。C水浴旋轉(zhuǎn)孵育30min，并過0.22 p m濾膜。加入終濃度為5%的甘露醇作為賦形劑混和均勻，分裝，凍干即得。加入低分子量肝素是因為FGF-1O為肝素親和性生長因子，具有特異的糖胺聚糖一蛋白質(zhì)相互作用，可達到穩(wěn)定負載于載體材料中，并保持其生物活性、延緩釋放的作用，對細胞的生長、遷移具有調(diào)節(jié)作用。實施例2測定脂質(zhì)體的大小和粒徑分布采用透射電鏡法對脂質(zhì)體樣品進行觀察，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體形狀較規(guī)則，呈圓球形或橢圓球形顆粒，大小較均一。使用自動激光粒度分析儀，采用激光衍射法進行脂質(zhì)體粒度分析可知，粒子平均直徑約為176nm,絕大部分分布在150 200nm之間。粒徑形態(tài)與分布完全符合脂質(zhì)體的相關(guān)要求。實施例3測定脂質(zhì)體中FGF-1O的包封率采用凝膠色譜法( 葡聚糖凝膠Sephadex G5)，即利用脂質(zhì)體與游離藥物分子粒徑大小的差異進行分離，在波長280nm處測定脂質(zhì)體和游離藥物吸光度。臘質(zhì)體粒徑較大先被洗脫，游離的藥物粒徑較小后被洗脫從而達到分離效果。通過對徑高比、洗脫流速、上樣量等影響分離條件的優(yōu)化，使脂質(zhì)體達到最大程度的分離。對空白脂質(zhì)體對照液進行回收率試驗，回收率為99.5%，含藥脂質(zhì)體的回收率為100.3%，顯示該方法能準(zhǔn)確的測定游離藥物的量。計算得到樣品平均包封率為78.5% ±2.8%。實施例4測定脂質(zhì)體中FGF-1O的生物學(xué)活性采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)測定脂質(zhì)體活性。收集培養(yǎng)至對數(shù)期的NIH3T3細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，使待測細胞密度為8000—10000個/孔。37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育至細胞貼壁，換饑餓培養(yǎng)基(低糖DMEM+0.5% PBS),饑餓培養(yǎng)18 h。加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液、含藥脂質(zhì)體樣品及空白脂質(zhì)體做陰性對照，37。C,5% C02培養(yǎng)箱中孵育48小時。每孔加入25弘I MTT溶液(5 mg / ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。倒掉液體，每孔加150社I 二甲基亞砜混勻后，在酶標(biāo)儀上以630nm為參比波長，于波長570nm處測定吸光度，記錄測定結(jié)果，計算供試樣品的生物學(xué)活性。實施例5測定加載FGF-1O的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性通過測定脂質(zhì)體的Zeta電位、不同溫度及時問下包封率、生物學(xué)活性的變化情況，對脂質(zhì)體的穩(wěn)定性進行測定。表I FGF — 10脂質(zhì)體的Zeta電位測定
權(quán)利要求
1.一種含有成纖維細胞生長因子-10 (FGF — 10)的治療脫發(fā)的脂質(zhì)體制備方法。以IOOml 脂 質(zhì)體制備量計，其組成配方為: ①大豆卵磷脂1.0g 5.0g; ②膽固醇0.25 1.25 g ； ③低分子量肝素100 μ g 1000 μ g ； ④乙醇100 200ml: ⑤FGF — 10 原液 Img IOmg ； ⑥甘露醇2.0g 10.0g ⑦其余為0.9%生理鹽水(或20mMPBS溶液)。
2.根據(jù)專利要求I所述的含有成纖維細胞生長因子一10 (FGF — 10)的治療脫發(fā)的脂質(zhì)體制備優(yōu)選方法，以IOOml脂質(zhì)體制備量計，其組成配方為: ①大豆卵磷脂2.0g; ②膽固醇0.5 g ; ③低分子量肝素500yg; ④乙醇IOOml； ⑤FGF — 10 原液 5mg ； ⑥甘露醇5.0g ⑦其余為0.9%生理鹽水(或20mMPBS溶液)。
3.根據(jù)專利要求I或2說述的含有成纖維細胞生長因子一IO(FGF-1O)的治療脫發(fā)的脂質(zhì)體制備方法，其特征是所述的成纖維細胞生長因子一 10選用重組人成纖維細胞生長因子-10。
4.根據(jù)專利要求I或2所述的含有成纖維細胞生長因子一IO(FGF-1O)的治療脫發(fā)的脂質(zhì)體制備方法，其特征是，所述的FGF — 10脂質(zhì)體劑型使其具有透皮功能。
5.根據(jù)專利要求I或2所述的含有成纖維細胞生長因子-10(FGF—10)的治療脫發(fā)的脂質(zhì)體制備方法是: 磷脂膜制備:稱取大豆卵磷脂、膽固醇，加乙醇并加熱至55° C超聲，使其充分溶解，移入茄型瓶中，55。C，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使磷脂膜均勻覆蓋在茄型瓶側(cè)壁，并使乙醇溶液完全揮發(fā)； 水化:常壓下，加一定比例的生理鹽水，在一定溫度、轉(zhuǎn)數(shù)下洗膜至完全。
孵育:4°C孵育過夜。
空白脂質(zhì)體溶液制備:采用微射流法，逐步增加壓力，反復(fù)操作，使脂質(zhì)體粒徑均勻，溶液逐漸變微藍，再依次通過0.45 pm, 0.22 p.m濾膜整粒、除菌。
含藥脂質(zhì)體溶液制備:將空白脂質(zhì)體溶液與FGF — 10、低分子量肝素混合，37。C水浴旋轉(zhuǎn)孵育30min,0.22 μ μ濾膜過濾。
凍干:加入甘露醇作為賦形劑混和均勻，分裝，凍干。
6.根據(jù)專利要求I 5包含常規(guī)脂質(zhì)體或與該脂質(zhì)體相結(jié)合的成纖維細胞生長因子-10的局部用藥制劑，其中所述脂質(zhì)體包括不同含藥劑量，在毛發(fā)損傷區(qū)深處組織中提供高的成纖維細胞生長因子-10蛋白的生物利用度，并且可用于脫發(fā)疾病的治療。
7.根據(jù)專利權(quán)要求I 5所述制備的含有成纖維細胞生長因子一 lO(FGF-1O)的脂質(zhì)體，其特征是，還 可應(yīng)用于生物美容及燒燙傷、難愈性潰瘍的治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有成纖維細胞生長因子一10的脂質(zhì)體的制備方法及其在治療脫發(fā)疾病中的應(yīng)用。本法采用薄膜分散一凍干再水化法，將FGF—10包裹起來，增加了蛋白穩(wěn)定性和其對皮膚滲透力，提高其在體內(nèi)生物利用度。涂抹給藥后可透皮吸收直接作用于毛囊生長的關(guān)鍵部位達到治療效果，更有利于脫發(fā)疾病的治療。該脂質(zhì)體還可用于生物美容及燒燙傷、難愈性潰瘍的治療。
文檔編號A61K38/18GK103169658SQ20121043048
公開日2013年6月26日 申請日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日
發(fā)明者田海山, 李校堃, 姜潮, 金利泰, 王曉杰, 王澤 , 唐祿 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院, 浙江格魯斯特生物科技有限公司