專(zhuān)利名稱(chēng)：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1改構(gòu)體凝膠劑制備及在糖尿病足治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I改構(gòu)體(FGF-1135)蛋白的用于治療糖尿病足等疾病的凝膠劑制備及應(yīng)用，屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是一種多種因素引起的全身代謝性疾病，目前全世界超過(guò)1.8億人患有糖尿病，已經(jīng)成為全球性重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。糖尿病患者中約有30% 80%合并有皮膚損害，嚴(yán)重危害糖尿病病人的健康，其中最典型和危害最大的為糖尿病足。糖尿病足(DiabeticF00t，DF)是DM的常見(jiàn)慢性并發(fā)癥之一，主要是以糖代謝紊亂為前提的綜合因素作用的結(jié)果。糖尿病代謝異常引起的高血糖、高血脂及其所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物一方面可致神經(jīng)軸突、神經(jīng)鞘膜及雪旺細(xì)胞變性致使感覺(jué)神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)、自主神經(jīng)功能障礙，導(dǎo)致感覺(jué)缺失、皮膚干裂、組織抵抗力降低易于感染壞疽；另一方面可使血小板聚集力增強(qiáng)、血液粘稠度增加，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成，使血管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致肢端缺血壞死潰爛。缺血及神經(jīng)損傷又使局部組織愈合能力、抗感染能力降低因而傷口不易愈合。在病理生理方面主要表現(xiàn)為創(chuàng)面組織細(xì)胞代謝異常，免疫功能紊亂，尤其是創(chuàng)面局部巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞功能失調(diào)，并伴隨有創(chuàng)面微環(huán)境中生長(zhǎng)因子功能受損，創(chuàng)面局部微循環(huán)灌注障礙，組織缺氧等，從而造成創(chuàng)面經(jīng)久不愈從而引起難以愈合的潰瘍，往往會(huì)導(dǎo)致壞疽或截肢，大大降低了患者的生存質(zhì)量，而且治療相當(dāng)困難，周期長(zhǎng)，醫(yī)療費(fèi)用高，給患者帶來(lái)極大痛苦及沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)每年大約有3% 6%糖尿病患者發(fā)生足部潰瘍，其中70%的患者需要手術(shù)治療，歐美國(guó)家40% 70%的下肢截肢與糖尿病有關(guān)，美國(guó)每年約有5萬(wàn)例以上的糖尿病截肢手術(shù)，我國(guó)糖尿病截肢率在14% 22%。隨著現(xiàn)代糖尿病的發(fā)生率不斷上升，糖尿病足所帶來(lái)的社會(huì)問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)不斷加重。
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目前臨床上糖尿病足的治療方法主要有藥物治療、外科手術(shù)治療、自體干細(xì)胞移殖治療等。外科手術(shù)及自體干細(xì)胞移殖治療費(fèi)用高、專(zhuān)業(yè)性強(qiáng)，對(duì)病人的耐受性也有較高要求，因此開(kāi)發(fā)促進(jìn)肉芽生長(zhǎng)和創(chuàng)面愈合有效藥物，促進(jìn)糖尿病足的早期愈合、縮短病程和降低致殘率，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題之一，越來(lái)越受到研究人員和生產(chǎn)企業(yè)的重視。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I亦稱(chēng)為酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(acidic Fibroblastgrowthfactor, aFGF)是一類(lèi)對(duì)來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層的多種類(lèi)型細(xì)胞具有廣泛的生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。作為一個(gè)高度保守的功能蛋白，大量的研究己充分證實(shí)了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、潰瘍愈合、血管再生、神經(jīng)組織修復(fù)、神經(jīng)突起生長(zhǎng)等方面具有突出的功效，孕育著巨大的臨床應(yīng)用前景。由于潰瘍創(chuàng)面是細(xì)菌等微生物繁殖的溫床，創(chuàng)面自身及細(xì)菌等微生物的分泌物使創(chuàng)面這一微環(huán)境呈酸性。haFGF在這一微環(huán)境中較堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)穩(wěn)定，更有利于發(fā)揮其生物學(xué)活性。此外，與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)相比較，EGF可促進(jìn)I型膠原的合成，導(dǎo)致瘢痕疙瘩形成，而haFGF能通過(guò)對(duì)I型前膠原基因表達(dá)的下行調(diào)節(jié)作用，抑制成纖維細(xì)胞的膠原合成，減少成纖維細(xì)胞的膠原蛋白的過(guò)量沉積，有助于防止瘢痕疙瘩的產(chǎn)生。因而應(yīng)用haFGF治療糖尿病足潰瘍等慢性難愈性傷口有著廣闊的前景，可提高這類(lèi)病人的傷口愈合速度和質(zhì)量，進(jìn)而提高患者的生活質(zhì)量。目前，美國(guó)CardioVascularBioTherapeutics (CVBT)公司應(yīng)用 aFGF 治療糖尿病足為目標(biāo)的一期臨床試驗(yàn)已完成，已進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)階段，發(fā)展前景非常樂(lè)觀。國(guó)內(nèi)外也有臨床使用bFGF、EGF、G—CSF, PDGF等生長(zhǎng)因子與其他藥物配合治療糖尿病足的報(bào)道，顯示具有明顯的臨床療效。本發(fā)明中重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I改構(gòu)體(mrhFGF-1，F(xiàn)GF-1135)與美國(guó)CVBT公司相比具有以下特點(diǎn):根據(jù)FGF — I的活性結(jié)構(gòu)域位于c端，N末端部分氨基酸的缺失不影響FGF的生物學(xué)活性的特性，去除了 N末端影響蛋白表達(dá)及穩(wěn)定性的19個(gè)氨基酸，使表達(dá)量由80mg / L提升到200mg / L以上；體外細(xì)胞測(cè)活與藥效學(xué)表明，N末端缺失19個(gè)氫基酸不影響FGF — I的生物學(xué)活性:缺失后重組蛋白的N末端降解問(wèn)題與二聚體形成明顯降低。同時(shí)，也通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)FGF-1135對(duì)糖尿病性皮膚潰瘍具有較為顯著療效，并進(jìn)一步證明其用藥的安全性。

發(fā)明內(nèi)容
對(duì)目前成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I凍干粉制劑對(duì)糖尿病足等難愈性潰瘍的臨床應(yīng)用中的不足進(jìn)行改進(jìn)，提供簡(jiǎn)單實(shí)用、穩(wěn)定性及療效好的凝膠劑及其制備方法。本發(fā)明目的是提供FGF-1凝膠劑制備方法。本發(fā)明進(jìn)一步目的是在于提供FGF-1凝膠劑在糖尿病足潰瘍疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明還可應(yīng)用于燒燙傷、褥瘡等難愈性潰瘍的臨床治療。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明提供了一種重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I改構(gòu)體凝膠劑的制備方法。按照發(fā)明的實(shí)施例方案，卡波姆重量0.3% 1.0%，優(yōu)選0.5%作為凝膠基質(zhì):人血白蛋白重量0.5% 1_5%，優(yōu)選1.0%作為蛋白保護(hù)劑；低分子量肝素重量0.l%mg 0.4%mg，優(yōu)選0.5% mg作為保護(hù)細(xì)胞活性，并減緩其釋放；甘油重量2.0% 10.0%，優(yōu)選5.0%作為凝膠保濕劑。在本發(fā)明的凝膠劑中，重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I改構(gòu)體有效劑量2000Iu / g 8000Iu / g，優(yōu)選6750 Iu / g，該劑量能有效促進(jìn)I型及2型糖尿病潰瘍模型創(chuàng)面的有效愈合。本發(fā)明還提供了凝膠劑的制備方法，包括基質(zhì)溶脹及滅菌即將卡波姆940中加入甘油，攪拌充分混勻，用適量注射用水充分溶脹，調(diào)節(jié)PH值使其形成透明凝膠，121°C、30min高壓滅菌。冷卻后備用；將重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I改構(gòu)體蛋白、人血白蛋白及肝素，加入適量冷卻的注射用水中充分混勻，在無(wú)菌條件下用0.22 u m濾膜過(guò)濾除菌；在無(wú)菌條件下，將上述兩種物質(zhì)充分混合，分裝即得。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):1.本發(fā)明采用卡波姆940作為基質(zhì)材料，具有延展性好、易于涂抹和附著于皮膚，對(duì)皮膚及粘膜無(wú)刺激性并能吸收組織滲透液，有利于分泌物的排出；無(wú)油膩性，釋藥迅速，與皮膚組織耦合效果好等特性。2.本發(fā)明配伍合理，可達(dá)到穩(wěn)定負(fù)載FGF-1蛋白于凝膠劑中，并保持其生物活性、延緩釋放的作用，促進(jìn)創(chuàng)面有效愈合。采用的組分均對(duì)皮膚無(wú)毒副作用、無(wú)刺激性，便于清潔。3.本發(fā)明產(chǎn)品可直接涂抹于創(chuàng)面部位，使用方便，增加患者的依從性和臨床應(yīng)用。


圖1皮膚外傷性潰瘍模型圖2皮膚燙傷性潰瘍模型圖3FGF_1135凝膠劑對(duì)I型糖尿病SD大鼠皮膚外傷及燙傷治療愈合情況
圖4FGF_1135凝膠劑對(duì)2型糖尿病GK大鼠皮膚外傷及燙傷治療愈合情況圖5FGF_1135凝膠劑對(duì)I型糖尿病GK大鼠皮膚外傷及燙傷皮膚組織病理學(xué)檢查圖6FGF_1135凝膠劑對(duì)I型糖尿病GK大鼠皮膚創(chuàng)傷及燙傷皮膚組織病理學(xué)檢查
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1生產(chǎn)加載FGF-1135的凝膠劑基質(zhì)溶脹及滅菌:將卡波姆940中加入甘油，攪拌充分混勻，用適量注射用水充分溶脹，調(diào)節(jié)PH值使其形成透明凝膠，12rC、30min高壓滅菌。冷卻后備用；蛋白除菌過(guò)濾:將重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I改構(gòu)體蛋白、人血白蛋白及肝素，加入冷卻的注射用水中充分混勻，在無(wú)菌條件下用0.22μπι濾膜過(guò)濾除菌；凝膠劑制備:在無(wú)菌條件下，將上述兩種物質(zhì)充分混合，分裝即得。作為基質(zhì)材料卡波姆具有延展性好、易于涂抹和附著于皮膚，對(duì)皮膚及粘膜無(wú)刺激性并能吸收組織滲透液，有利于分泌物的排出；無(wú)油膩性，釋藥迅速，與皮膚組織耦合效果好等特性。加入低分子量肝素是因?yàn)镕GF-1為肝素親和性生長(zhǎng)因子，具有特異的糖胺聚糖一蛋白質(zhì)相互作用，可達(dá)到穩(wěn)定負(fù)載于載體材料中，并保持其生物活性、延緩釋放的作用，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移具有調(diào)節(jié)作用。加入人血白蛋白及甘油對(duì)蛋白的穩(wěn)定性具有良好保護(hù)作用。實(shí)施例2測(cè)定凝膠劑活性采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)測(cè)定凝膠劑活性。Balb / c3T3細(xì)胞用完全培養(yǎng)液，于37°C、5% C02培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，消化并收集細(xì)胞，力口完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，使待測(cè)細(xì)胞密度為50000-100000個(gè)/ ml，按每孔100 u I接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C、5% C02培養(yǎng)24h，換維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去維持液，加入標(biāo)準(zhǔn)品及用培養(yǎng)基溶解并按一定濃度稀釋的凝膠樣品溶液，每孔100弘1，37。C,5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)64h 72h。每孔加入20 μ I MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h。倒掉液體，每孔加100 μ I 二甲基亞砜溶液，混勻后在酶標(biāo)儀上以630nm為參比波長(zhǎng)，于波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果，計(jì)算供試樣品的生物學(xué)活性。 實(shí)施例3測(cè)定凝膠劑的穩(wěn)定性通過(guò)測(cè)定不同溫度下，凝膠劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在4°C、25。C、37。C保存12個(gè)月，凝膠劑無(wú)霉變現(xiàn)象，其外觀、PH值等理化指標(biāo)均未發(fā)生變化；載藥凝膠劑的生物學(xué)活性在室溫條件下，穩(wěn)定性差，放置3個(gè)月 后活性有較明顯降低，而低溫條件對(duì)載藥凝膠劑的的存放無(wú)明顯影響。
表I FGF-1凝膠劑在25°C穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.種含有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I改構(gòu)體的治療糖尿病足凝膠劑的制備方法。
以IOOOml即100支(IOg /支)凝膠劑制備量計(jì)，其組成配方為: ①重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一I改構(gòu)體蛋白2 X IO6IU 8 X IO6IU ②蛋白保護(hù)劑5g 15g ； ⑨低分子量肝素Img 4mg ； ④甘油20g IOOg ； ⑤凝膠基質(zhì)3g log ； ⑥注射用水，定容至1000ml。
其中所述的蛋白保護(hù)劑為人血白蛋白，凝膠劑基質(zhì)為卡波姆940。
2.根據(jù)專(zhuān)利要求I所述的含有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一I改構(gòu)體的治療糖尿病足的凝膠劑的制備優(yōu)選方法，以IOOOml凝膠劑制備量計(jì)，其組成配方為: ①重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一I改構(gòu)體蛋白6.75X IO6IU ②蛋白保護(hù)劑10.0g; ③低分子量肝素3.0mg； ④甘油50.0g; ⑤凝膠基質(zhì)4.0g ； ⑥注射用水，定容至1000ml。
其中所述的蛋白保護(hù)劑為人血白蛋白，凝膠劑基質(zhì)為卡波姆940。
3.根據(jù)專(zhuān)利要求I或2所述的含有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一I改構(gòu)體的治療糖尿病足的凝膠劑的制備方法，其特征是所述的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I改構(gòu)體選用重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I改構(gòu)體蛋白。
4.根據(jù)專(zhuān)利要求I或2所述的含有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一I改構(gòu)體蛋白凝膠劑的制備方法是: 基質(zhì)溶脹及滅菌:將卡波姆940中加入甘油，攪拌充分混勻，用適量注射用水充分溶脹，調(diào)節(jié)DH值使其形成透明凝膠，121。C、30min高壓滅菌。冷卻后備用； 蛋白除菌過(guò)濾:將重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一 I改構(gòu)體蛋白、人血白蛋白及肝素，力口入冷卻的注射用水中充分混勻，在無(wú)菌條件下用0.22μπι濾膜過(guò)濾除菌； 凝膠劑制備:在無(wú)菌條件下，將上述兩種物質(zhì)充分混合，分裝即得。
5.根據(jù)專(zhuān)利要求I 4包含不同含藥及組成劑量，在糖尿病足難愈性及慢性潰瘍組織中提供穩(wěn)定性好并具有一定緩釋效果的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一I改構(gòu)體蛋白凝膠劑，并提高蛋白的生物利用度。
6.根據(jù)專(zhuān)利權(quán)要求I 5所述制備的含有重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子一I改構(gòu)體蛋白的凝膠劑，其特征是，還可應(yīng)用于燒燙傷及其他慢性、難愈性潰瘍的治療。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-l改構(gòu)體的凝膠劑的制備方法及在糖尿病足引起的慢性皮膚潰瘍治療中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的凝膠劑的組分及用量為重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1改構(gòu)體(FGF-1135)蛋白20000～80000IU；低分子量肝素鈉為10 p g～40μg；甘油含量為O．2g～1．Og；蛋白保護(hù)劑為50mg～150mg；凝膠基質(zhì)為0．03g～0．05g；調(diào)節(jié)pH值，加注射用水至lOml。本發(fā)明中所用的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1改構(gòu)體比原序列更加穩(wěn)定，制備成凝膠劑后更方便于臨床應(yīng)用，并能達(dá)到較好的穩(wěn)定性和緩釋效果，提高了蛋白的生物利用度，更有利于糖尿病足的治療。該凝膠劑還可用于燒燙傷及其他慢性、難愈性潰瘍的治療。
文檔編號(hào)A61K9/06GK103083226SQ201210430489
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日
發(fā)明者田海山, 李校堃, 王曉杰, 金利泰, 姜潮, 唐祿 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院, 浙江格魯斯特生物科技有限公司