抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物及其制備方法。該疫苗組合物含有豬支氣管敗血波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、副豬嗜血桿菌抗原等成分，各抗原成分的菌液均采用發(fā)酵培養(yǎng)法獲得，并采用超濾濃縮技術(shù)濃縮，疫苗中抗原含量高且全面，可以為動(dòng)物提供全面有效保護(hù)。本發(fā)明采用水佐劑gel佐劑，具有吸收好，免疫局部沒有不良反應(yīng)，免疫應(yīng)答快，可以提高豬的免疫保護(hù)。本發(fā)明的疫苗組合物有效解決了混合感染時(shí)對(duì)豬只的有效全面保護(hù)的問題，簡(jiǎn)化了免疫程序，達(dá)到了一針多防，降低了多次免疫造成的副反應(yīng)，降低了防疫成本，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
【專利說明】抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物及其制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于畜牧類生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬萎縮性鼻炎(atrophic rhinitis, AR)是豬群的一種重要的呼吸系統(tǒng)傳染病，它會(huì)引起豬的慢性鼻炎、打噴嚏、流眼淚、顏部變性和鼻甲骨萎縮等癥狀，嚴(yán)重的還可以導(dǎo)致鼻吻變形并影響全身骨骼發(fā)育，從而導(dǎo)致豬生長(zhǎng)遲緩，使豬容易感染繼發(fā)性復(fù)合性肺炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。該病可感染任何年齡階段的豬，其中4周齡以內(nèi)的豬感染率最高，癥狀一般出現(xiàn)在8~12周齡。豬萎縮性鼻炎可分為進(jìn)行性豬萎縮性鼻炎(progressiveatrophic rhinitis, PAR)和非進(jìn)行性豬萎縮性鼻炎(nonprogressive atrophicrhinitis, NPAR)。進(jìn)行性豬萎縮性鼻炎主要由產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌(toxigenicPasteurellamultocida)引起,病原通常為莢膜D型(Pm-D)或A型(Pm-A),或與支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)共同感染引起。非進(jìn)行性豬萎縮性鼻炎則單純由支氣管敗血波氏桿菌引起，其通常只引起輕微的鼻甲骨萎縮，往往觀察不到鼻吻部的典型病變。進(jìn)行性豬萎縮性鼻炎給養(yǎng)豬業(yè)帶來的危害十分巨大。
[0003]當(dāng)前，我國(guó)所用的豬萎縮性鼻炎疫苗還主要是支氣管敗血波氏桿菌滅活苗或支氣管敗血波氏桿菌加有產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌的滅活苗，所使用的疫苗佐劑常常為鋁膠佐劑、弗氏佐劑、油包水型佐劑，存在著保護(hù)性抗原成分少，不能提供完全的保護(hù)，注射后吸收不完全，副反應(yīng)大等 缺點(diǎn)。
[0004]副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPs)是豬Glasser’ S病的病原體,豬上呼吸道的一種共棲菌，它可在特定條件下侵入機(jī)體而引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身性疾病。目前，我國(guó)很多省市患病豬群中均可分離獲得副豬嗜血桿菌，該菌可影響從2周齡的哺乳仔豬到4月齡的育肥豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，多見于5~8周齡的豬，發(fā)病率在10%~15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率高達(dá)50%，已成為保育豬死亡的主要原因之一，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005]豬萎縮性鼻炎感染不僅會(huì)造成豬只生產(chǎn)性能的影響，而且感染后會(huì)引起免疫機(jī)能的下降，繼發(fā)感染副豬嗜血桿菌，會(huì)造成病情加重乃至死亡的危險(xiǎn)！豬傳染性萎縮性鼻炎雖然有兩種病原，而支氣管敗血波氏桿菌是原發(fā)性主要的病原菌，它還是多殺性巴氏桿菌建立感染的重要前導(dǎo)因子。它的致病變特點(diǎn)是傳染主要來自懷孕母豬，新生仔豬感染的越早產(chǎn)生的病變?cè)絿?yán)重，因此，為了杜絕生產(chǎn)母豬把病原菌傳給所生仔豬，在免疫程序上需要在母豬產(chǎn)前4周及2周各免疫一次。而對(duì)于副豬嗜血桿菌的免疫程序則是在母豬產(chǎn)前7周及5周各免疫一次。二者免疫的不同步，造成了混合感染時(shí)，不能有效的對(duì)豬只進(jìn)行全面有效的保護(hù)！
[0006]因此，目前存在的問題是研究開發(fā)一種制備方法簡(jiǎn)單、可有效預(yù)防豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病的滅活疫苗，副反應(yīng)小，且抗原成分含量較高的抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物及其制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物及其制備方法。該疫苗組合物含有豬支氣管敗血波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、副豬嗜血桿菌抗原等成分。該疫苗組合物中抗原含量高且全面，毒力強(qiáng)，免疫原性好，可以為動(dòng)物提供全面有效的保護(hù)；該疫苗組合物免疫程序簡(jiǎn)單，防疫成本低廉，吸收好，免疫局部沒有不良反應(yīng)，免疫應(yīng)答快，實(shí)用性強(qiáng)。
[0008]為此，本發(fā)明提供了一種抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物，其包括:豬支氣管敗血波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、副豬嗜血桿菌抗原。
[0009]在本發(fā)明中，所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原包含至少一種在對(duì)豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗豬支氣管敗血波氏桿菌感染的免疫應(yīng)答的豬支氣管敗血波氏桿菌抗原。
[0010]根據(jù)本發(fā)明，所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為豬支氣管敗血波氏桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬支氣管敗血波氏桿菌，或者含有豬支氣管敗血波氏桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一種或幾種。優(yōu)選所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活形式的全菌體。進(jìn)一步優(yōu)選所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活形式的支氣管敗血波氏桿菌HN8株。并且，在所述的疫苗組合物中，所述支氣管敗血波氏桿菌HN8株滅活前含量為IO8~101QCFU/ml。
[0011]本發(fā)明中所述用語“豬支氣管敗血波氏桿菌全菌體”，是指豬支氣管敗血波氏桿菌的完整細(xì)胞體。
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的豬支氣管敗血波氏桿菌抗原可以是選自(西班牙海博萊豬萎縮性鼻炎滅活疫苗(883株)，武漢科前靜鼻(JB5株)，勃林格豬萎縮性鼻炎滅活疫苗(I相77~14株、540株))中的一種或幾種。
`[0013]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活形式的HN8株。所述支氣管敗血波氏桿菌HN8株(Bordetella bronchiseptica HN8)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M2011223，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱:CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))。保藏日期為2011年06月28日。
[0014]本發(fā)明中所述用語“支氣管敗血波氏桿菌HN8株”，也稱為“豬支氣管敗血波氏桿菌HN8株。
[0015]正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，不同的微生物野外分離株在基因序列上有微小的變異，然而，當(dāng)變異不影響其蛋白質(zhì)合成、結(jié)構(gòu)或者主要作用功能區(qū)時(shí)，該微生物之他種野外分離株即使基因序列無法百分之百相同，其基本的生理功能并不會(huì)有所改變。但是同源性比較如果針對(duì)全部的基因來進(jìn)行比對(duì)，實(shí)際上是非常巨大的工程，不太可行，目前國(guó)際上常使用16S Ribosomal RNA(16S rRNA)來進(jìn)行細(xì)菌型的分辨，因此在相似性的比較上可以用16S rRNA來進(jìn)行比對(duì)而得到其同源性。所以本發(fā)明所使用的豬支氣管敗血波氏桿菌抗原并不限定于本發(fā)明所使用的野外分離株，16s rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中。16S rRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(zhǎng)(包含約50個(gè)功能域)。
[0016]因此，本發(fā)明中，所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為與支氣管敗血波氏桿菌HN8株的16S rRNA的同源性至少為80%的菌株。優(yōu)選所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為與支氣管敗血波氏桿菌HN8株的16SrRNA的同源性至少為90%的菌株。進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為與支氣管敗血波氏桿菌HN8株的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株。更為優(yōu)選的是，所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為與支氣管敗血波氏桿菌HN8株的16S rRNA的同源性為98%~99%的菌株。即在不改變豬支氣管敗血波氏桿菌16S rRNA的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過簡(jiǎn)單的篩選或誘變本發(fā)明的豬支氣管敗血波氏桿菌，獲得與本發(fā)明豬支氣管敗血波氏桿菌16S rRNA高度同源的菌株，并獲得相應(yīng)地具有相同或相似免疫原性的抗原組合物。
[0017]同樣，在本發(fā)明中，所述豬多殺性巴氏桿菌抗原包含至少一種在對(duì)豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗多殺性巴氏桿菌的免疫應(yīng)答的多殺性巴氏桿菌抗原。
[0018]根據(jù)本發(fā)明，所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為豬多殺性巴氏桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬多殺性巴氏桿菌，或者含有豬多殺性巴氏桿菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合細(xì)菌，或者含有豬多殺性巴氏桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一種或幾種。優(yōu)選所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為滅活形式的全菌體。進(jìn)一步優(yōu)選所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為滅活形式的多殺性巴氏桿菌A型HN5株和/或多殺性巴氏桿菌D型HB4株。并且，在所述的疫苗組合物中，所述多殺性巴氏桿菌A型HN5株滅活前含量為IO8~101QCFU/ml，多殺性巴氏桿菌D型HB4株滅活前含量為IO8~10lclCFU/ml。
[0019]本發(fā)明中所述用語“豬多殺性巴氏桿菌全菌體”，是指豬多殺性巴氏桿菌的完整細(xì)胞體。
[0020]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的豬多殺性巴氏桿菌抗原可以是選自(勃林格豬萎縮性鼻炎滅活疫苗(D型B3669株)，西班牙海博萊喜必安(D型637株))中的一種或幾種。
[0021]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為滅活形式的A型HN5株、D型HB4株。所述多殺性巴氏桿菌A型HN5株(Pasteurella multocidaA Type HN5)的保藏編號(hào)為:CCTCCN0:M 2011222 ;所述多殺性巴氏桿菌D型HB4株(Pasteurellamultocida D Type HB4)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011221 ;上述菌種均保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))。保藏日期均為2011年06月28日。
[0022]本發(fā)明中所述用語“多殺性巴氏桿菌A型HN5株”，也稱為“豬多殺性巴氏桿菌A型HN5 株”。
[0023]本發(fā)明中所述用語“多殺性巴氏桿菌D型HB4株”，也稱為“豬多殺性巴氏桿菌D型HB4 株”。
[0024]本發(fā)明中，所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為與多殺性巴氏桿菌A型HN5株的16SrRNA的同源性至少為80%的菌株或/和多殺性巴氏桿菌D型HB4株的16S rRNA的同源性至少為80%的菌株。優(yōu)選所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為與多殺性巴氏桿菌A型HN5株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株和/或多殺性巴氏桿菌D型HB4株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株。進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為與多殺性巴氏桿菌A型HN5株的16S rRNA的同源性至少為95 %~99 %的菌株和/或多殺性巴氏桿菌D型HB4株的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株。更為優(yōu)選的是，所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為與多殺性巴氏桿菌A型HN5株的16S rRNA的同源性至少為98%~99%的菌株和/或多殺性巴氏桿菌D型HB4株的16S rRNA的同源性至少為98%~99%的菌株。
[0025]同樣，在本發(fā)明中，所述副豬嗜血桿菌抗原包含至少一種在對(duì)豬給藥后能誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗副豬嗜血桿菌的免疫應(yīng)答的副豬嗜血桿菌抗原。
[0026]根據(jù)本發(fā)明，所述副豬嗜血桿菌抗原為副豬嗜血桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的副豬嗜血桿菌，或者含有副豬嗜血桿菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合細(xì)菌，或者含有副豬嗜血桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一種或幾種。優(yōu)選所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活形式的全菌體。進(jìn)一步優(yōu)選所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活形式的副豬嗜血桿菌4型JS株和/或副豬嗜血桿菌5型ZJ株。并且，在所述的疫苗組合物中，所述副豬嗜血桿菌4型JS株滅活前含量為IO8~101(lCFU/ml，副豬嗜血桿菌5型ZJ株滅活前含量為IO8~101(lCFU/ml。
[0027]本發(fā)明中所述用語“副豬嗜血桿菌全菌體”，是指副豬嗜血桿菌的完整細(xì)胞體。
[0028]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的副豬嗜血桿菌抗原可以是選自(武漢科前副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(血清4型MD0322+血清5型SH0165)，勃林格茵格發(fā)副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(Z-1517株)，西班牙海博萊豬副豬嗜血桿菌滅活疫苗(血清I型SVl+血清6型SV6)中的一種或幾種。
[0029]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活形式的血清4型JS株、血清5型ZJ株。所述副豬嗜血桿菌血清4型JS株(Haemophilus ParasuisSerotype 4，Strain JS)的保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011172 ;所述副豬嗜血桿菌血清5 型 ZJ 株(Haemo philus Parasuis Serotype 5, Strain ZJ)的保藏編號(hào)為:CCTCCN0:M2011173 ;上述菌種均保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))。保藏日期均為2011年05月18日。
[0030]本發(fā)明中，所述副豬嗜血桿菌抗原為與副豬嗜血桿菌4型JS株的16S rRNA的同源性至少為80%的菌株或/和副豬嗜血桿菌5型ZJ株的16S rRNA的同源性至少為80%的菌株。優(yōu)選所述副豬嗜血桿菌抗原為與副豬嗜血桿菌4型JS株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株和/或副豬嗜血桿菌5型ZJ株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株。進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述副豬嗜血桿菌抗原為與副豬嗜血桿菌4型JS株的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株和/或副豬嗜血桿菌5型ZJ株的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株。更為優(yōu)選的是，所述副豬嗜血桿菌抗原為與副豬嗜血桿菌4型JS株的16SrRNA的同源性至少為98%~99%的菌株和/或副豬嗜血桿菌5型ZJ株的16S rRNA的同源性至少為98%~99%的菌株。
[0031]在本發(fā)明中，所述疫苗組合物還包括其它豬的病原體的附加抗原，其選自豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的抗原、豬瘟病毒抗原、豬偽狂犬病毒(PRV)抗原、豬圓環(huán)病毒抗原(PCV)、豬肺炎支原體抗原、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原、豬流感病毒(SIV)抗原中的一種或幾種。
[0032]根據(jù)本發(fā)明，所述疫苗組合物還包括獸醫(yī)學(xué)上可接受的疫苗佐劑，并且，在所述疫苗組合物中，所述疫苗佐劑含量為10wt%~ 15wt%。所述疫苗佐劑選自Gel佐劑、氫氧化鋁膠、蜂膠、礦物油、ISA206、ISA760VG、ISA15A、CP934、CP940。
[0033]本發(fā)明還提供了一種制備抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物的方法，所述方法包括分別將所述豬支氣管敗血波氏桿菌株、所述豬多殺性巴氏桿菌株及所述副豬嗜血桿菌株進(jìn)行增殖后，再分別進(jìn)行濃縮、滅活，并加入疫苗佐劑，乳化或攪拌均勻制備。所述豬支氣管敗血波氏桿菌株、所述豬多殺性巴氏桿菌株及所述副豬嗜血桿菌株在上述增殖過程中獲得大量增殖。
[0034]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述制備抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物的方法包括:
[0035]步驟A，采用超濾濃縮技術(shù)分別將支氣管敗血波氏桿菌HN8株、多殺性巴氏桿菌A型HN5株和多殺性巴氏桿菌D型HB4株菌種、副豬嗜血桿菌4型JS株和副豬嗜血桿菌5型ZJ株的滅活菌液進(jìn)行濃縮，分別獲得其各自的滅活濃縮液；
[0036]步驟B，將支氣管敗血波氏桿菌HN8株、多殺性巴氏桿菌A型HN5株和多殺性巴氏桿菌D型HB4株菌種、副豬嗜血桿菌4型JS株和副豬嗜血桿菌5型ZJ株的滅活濃縮液混合，并加入疫苗佐劑,乳化,制得抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物。
[0037]根據(jù)本發(fā)明方法，在步驟A中，所述滅活支氣管敗血波氏桿菌HN8株、多殺性巴氏桿菌A型HN5株和多殺性巴氏桿菌D型HB4株菌種、副豬嗜血桿菌4型JS株和副豬嗜血桿菌5型ZJ株的菌液經(jīng)過濃縮后所獲得的滅活濃縮液中滅活前各抗原含量均為I X IO11CFU/ml ο
[0038]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，在步驟B中，將各組分抗原按1:1:1:1的體積比混合，再加入抗原量10wt%或15wt%的Gel佐劑進(jìn)行乳化，制得抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物。
[0039]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在步驟A之前還包括:
[0040]步驟(1)，分別將支氣管敗血波氏桿菌菌種、多殺性巴氏桿菌A型和D型菌種、副豬嗜血桿菌4型和5型菌種接種于固體培養(yǎng)基進(jìn)`行活化，培養(yǎng)24h，分別作為其各自的一級(jí)種子;
[0041]步驟(2)分別挑取支氣管敗血波氏桿菌菌種、多殺性巴氏桿菌A型和D型菌種、副豬嗜血桿菌4型和5型菌種平板單克隆接種于適宜液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12~16h，以1%的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)12~16h作為其各自的二級(jí)種子；
[0042]步驟(3)分別將支氣管敗血波氏桿菌菌種、多殺性巴氏桿菌A型和D型菌種、副豬嗜血桿菌4型和5型菌種二級(jí)種子轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)16~24h，收獲其各自的菌液，滅活后獲得其各自的滅活菌液。
[0043]在上述步驟(3)中，滅活過程，是按菌液總量加入0.2%~0.4%的甲醛水溶液，滅活時(shí)間為24~48小時(shí)。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物含有豬支氣管敗血波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、副豬嗜血桿菌抗原。這些菌株由普萊柯生物工程股份有限公司分離鑒定，具有毒力強(qiáng)，免疫原性好的特點(diǎn)。該疫苗組合物中各抗原成分的菌液均采用發(fā)酵培養(yǎng)法獲得，并采用超濾濃縮技術(shù)進(jìn)行濃縮，疫苗中抗原含量高且全面，從而可以為動(dòng)物提供全面的有效保護(hù)。尤其是，本發(fā)明采用水佐劑gel佐劑，具有吸收好，免疫局部沒有不良反應(yīng)，免疫應(yīng)答快，可以提高豬的免疫保護(hù)等優(yōu)點(diǎn)。
[0045]與現(xiàn)有技術(shù)相比，根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0046]I)解決了現(xiàn)有技術(shù)的困難，改變了人們對(duì)豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌同時(shí)感染時(shí)的認(rèn)識(shí)偏見，首次將豬支氣管敗血波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、副豬嗜血桿菌抗原按照合適的比例聯(lián)合使用，而在本發(fā)明之前，一直沒有人認(rèn)為兩種病可以同時(shí)進(jìn)行預(yù)防進(jìn)而這兩種疫苗可以聯(lián)合使用；
[0047]2)本發(fā)明中含有豬支氣管敗血波氏桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌抗原的預(yù)防和治療豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌感染的疫苗組合物，不僅不會(huì)產(chǎn)生幾種抗原成份的相互免疫干擾或影響，而且意外發(fā)現(xiàn)豬支氣管敗血波氏桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌的抗原混合后，豬支氣管敗血波氏桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌的抗原組合物不僅能產(chǎn)生的保護(hù)性免疫應(yīng)答的同時(shí)，還意外發(fā)現(xiàn)豬支氣管敗血波氏桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌抗原有相互增強(qiáng)免疫效果的作用，而且如本發(fā)明后續(xù)實(shí)施例所證明的，特別是存在其中一種抗原的情況下，另一種抗原量減半仍能維持本抗原的免疫效果，而這出乎本領(lǐng)域普通技術(shù)人員預(yù)料的。
[0048]3)上述預(yù)防和治療豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌感染的疫苗組合物與豬萎縮性鼻炎或副豬嗜血桿菌的單疫苗的效力相比，在對(duì)豬注射免疫過程中，豬體的應(yīng)激反應(yīng)出人預(yù)料地小，因此，本發(fā)明的二聯(lián)疫苗安全性更佳，可以避免多次接種免疫出現(xiàn)的不良反應(yīng)。
[0049]4)含有兩種或兩種以上抗原、可以預(yù)防兩種或兩種以上疾病的疫苗組合物以其方便、多效、低成本成為新一代疫苗研究的特點(diǎn)。與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存乃至全部使用過程均需在較低溫度下進(jìn)行，即所謂的“冷鏈”，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運(yùn)作，費(fèi)用極高，使疫苗成本居高不下，而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運(yùn)作的費(fèi)用，因此具有顯著的優(yōu)越性。
[0050]5)此外，本發(fā)明預(yù)防和治療豬萎縮性鼻炎相關(guān)疾病和副豬嗜血桿菌相關(guān)疾病的疫苗組合物，制備方法簡(jiǎn)單 ，疫苗的效價(jià)含量高，免疫方便快捷，與現(xiàn)有技術(shù)中的多次免疫，至少需要打2針或3針才能防治以上二種疾病的疫苗及其免疫方法相比，本發(fā)明僅免疫I次就能夠預(yù)防豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌幾種病原感染，降低了免疫成本，節(jié)約了免疫程序，更加經(jīng)濟(jì)可靠。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物不僅方便、多效、低成本，與單一疫苗相比，還可以減少疫苗接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運(yùn)輸、存貯、銷售乃至全部使用過程均需在較低溫度下進(jìn)行，即所謂的“冷鏈”，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運(yùn)作，費(fèi)用極高，使疫苗成本居高不下，而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運(yùn)作的費(fèi)用，因此具有顯著的優(yōu)越性。
[0052]因此，根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物有效解決了混合感染時(shí)對(duì)豬只的有效全面保護(hù)的問題，簡(jiǎn)化了免疫程序，達(dá)到了一針多防，并降低了多次免疫造成的副反應(yīng)，降低了防疫成本，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
[0053]菌種保藏
[0054]支氣管敗血波氏桿菌HN8株(Bordetella bronchiseptica HN8),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏。保藏日期為2011年06月28日。保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011223。
[0055]多殺性巴氏桿菌D型HB4株(Pasteurella multocida D Type HB4),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏。保藏日期為2011年06月28日。保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011221。
[0056]多殺性巴氏桿菌A型HN5株(Pasteurella multocida A Type HN5),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏。保藏日期為2011年06月28日。保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2011222。
[0057]副豬嗜血桿菌血清4 型 JS 株(Haemophilus Parasuis Serotype 4, Strain JS),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱=CCTCC ；地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏。保藏日期為2011年05月18日。的保藏編號(hào)為=CCTCC NO:M 2011172。
[0058]副豬嗜血桿菌血清5 型 ZJ 株(Haemophilus Parasuis Serotype 5, Strain ZJ)，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱=CCTCC ；地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏。保藏日期為2011年05月18日。的保藏編號(hào)為=CCTCC NO:M 2011173。
【具體實(shí)施方式】
[0059]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0060]實(shí)施例
[0061]實(shí)施例1:豬支氣管敗血波氏桿菌抗原、多殺性巴氏桿菌抗原和副豬嗜血桿菌抗原的制備
[0062]1.菌株來源
[0063]制造及檢驗(yàn)本品用的支氣管敗血波氏桿菌HN8株(CCTCC NO:M2011223)、多殺性巴氏桿菌 A 型 HN5 株(CCTCC NO:M2011222)和 D 型 HB4 株(CCTCC NO:M2011221)、副豬嗜血桿菌4型JS株(CCTCC M 2011172)和5型ZJ株(CCTCC M 2011173)，均由普萊柯生物工程股份有限公司從河南發(fā)病豬場(chǎng)分離鑒定，在湖北省武漢市中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。
[0064]制造及檢驗(yàn)本品用的菌種為支氣管敗血波氏桿菌HN8株、多殺性巴氏桿菌A型HN5株和D型HB4株、副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株，均為凍干保存。
[0065]2.疫苗半成品的制備及檢驗(yàn)
[0066](I)生產(chǎn)用種子的制備
[0067]①支氣管敗血波氏桿菌和多殺性巴氏桿菌
[0068]一級(jí)種子的繁殖
[0069]將支氣管敗血波氏桿菌HN8株接種于改良鮑姜氏血平板，與37°C培養(yǎng)48h，作為一級(jí)種子；將多殺性巴氏桿菌A型HN5株，多殺性巴氏桿菌D型HB4株的菌種分別接種于TSA(大豆酪蛋白瓊脂)培養(yǎng)基平板，與37°C培養(yǎng)24h作為一級(jí)種子。在2~8°C保存，保存期不超過5天。在培養(yǎng)基上傳代，不超過5代。[0070]二級(jí)種子繁殖
[0071]挑取支氣管敗血波氏桿菌HN8株平板上溶血環(huán)明顯的菌落于含5ml BHI (腦心浸液)的試管中，于150~220rpm，37°C振蕩培養(yǎng)16h ;分別挑取多殺性巴氏桿菌A型HN5株，多殺性巴氏桿菌D型HB4株平板菌落于含5mlBHI的試管中，于150~220rpm，37°C振蕩培養(yǎng)16h。以上菌液分別以I %的接種量接種于100ml相應(yīng)培養(yǎng)基，于150~220rpm，37°C振蕩培養(yǎng)12h，按《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，合格后作為二級(jí)種子，在2~8°C保存，不超過8h。
[0072]②副豬嗜血桿菌
[0073]一級(jí)種子的繁殖
[0074]將副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株的菌種分別接種于TSA平板，與37°C培養(yǎng)24h作為一級(jí)種子。在2~8°C保存，保存期不超過5天。在培養(yǎng)基上傳代，不超過5代。
[0075]二級(jí)種子繁殖
[0076]分別挑取副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株菌落于5ml含NAD (氧化型輔酶I)的TSB(胰胨大豆胨肉湯)試管中，于150~220rpm，37°C振蕩培養(yǎng)16h。以上菌液分別以I %的接種量接種于100ml相應(yīng)培養(yǎng)基，于150~220rpm，37°C振蕩培養(yǎng)12h，按《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，合格后作為二級(jí)種子，在2~8°C保存，不超過8h。
[0077](2)制苗用囷液制備
[0078]①支氣管敗血波氏桿菌和多殺性巴氏桿菌
[0079]采用生物發(fā)酵罐分別進(jìn)行支氣管敗血波氏桿菌HN8株、多殺性巴氏桿菌A型HN5株和多殺性巴氏桿菌D型HB 4株菌液的制備。將鑒定合格的二級(jí)種子以I %的接種量接種于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C，200rpm，通過不斷增大通氣量和流加補(bǔ)料的方式發(fā)酵培養(yǎng)16~24h，收獲菌液。取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。
[0080]②副豬嗜血桿菌
[0081]采用生物發(fā)酵罐分別進(jìn)行副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株菌液的制備。將鑒定合格的二級(jí)種子以I %的接種量接種于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基，370C，200rpm,通過不斷增大通氣量和流加補(bǔ)料的方式發(fā)酵培養(yǎng)16_24h，收獲菌液。取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。
[0082](3)菌液的滅活
[0083]純粹檢驗(yàn)合格的支氣管敗血波氏桿菌HN8株、多殺性巴氏桿菌A型HN5株和D型HB4株、副豬嗜血桿菌4型和5型菌液，按菌液總量的0.2~0.5%加入甲醛溶液(v/v)，37°C滅活48h，其間不斷搖動(dòng)。然后取樣按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，應(yīng)無菌落生長(zhǎng)。
[0084](4)菌液的濃縮
[0085]將滅活檢驗(yàn)合格的菌液采用超濾濃縮技術(shù)分別進(jìn)行濃縮，濃縮后各抗原含量見表
I。取樣做無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長(zhǎng)。
[0086]表1抗原濃縮后含量
【權(quán)利要求】
1.一種抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物，其包括:豬支氣管敗血波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原、副豬嗜血桿菌抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為豬支氣管敗血波氏桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬支氣管敗血波氏桿菌，或者含有豬支氣管敗血波氏桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一種或幾種； 所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為豬多殺性巴氏桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬多殺性巴氏桿菌，或者含有豬多殺性巴氏桿菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合細(xì)菌，或者含有豬多殺性巴氏桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一種或幾種； 所述副豬嗜血桿菌抗原為副豬嗜血桿菌全菌體，其選自滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的副豬嗜血桿菌，或者含有副豬嗜血桿菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合細(xì)菌，或者含有副豬嗜血桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽成分中一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活形式的全菌體； 所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為滅活形式的全菌體； 所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活形式的全菌體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述豬支氣管敗血波氏 桿菌抗原為滅活形式的支氣管敗血波氏桿菌HN8株； 在所述的疫苗組合物中，所述支氣管敗血波氏桿菌HN8株滅活前含量為IO8~IOltlCFU/ml ； 所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為滅活形式的多殺性巴氏桿菌A型HN5株和/或多殺性巴氏桿菌D型HB4株； 在所述的疫苗組合物中，所述多殺性巴氏桿菌A型HN5株滅活前含量為IO8~IOltlCFU/ml，多殺性巴氏桿菌D型HB4株滅活前含量為IO8~101(lCFU/ml ； 所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活形式的副豬嗜血桿菌4型JS株和/或副豬嗜血桿菌5型ZJ株； 在所述的疫苗組合物中，所述副豬嗜血桿菌4型JS株滅活前含量為IO8~101(lCFU/ml，副豬嗜血桿菌5型ZJ株滅活前含量為IO8~101(lCFU/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為與支氣管敗血波氏桿菌HN8株的16S rRNA的同源性至少為80%的菌株； 所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為與多殺性巴氏桿菌A型HN5株的16S rRNA的同源性至少為80%的菌株或/和多殺性巴氏桿菌D型HB4株的16S rRNA的同源性至少為80%的菌株; 所述副豬嗜血桿菌抗原為與副豬嗜血桿菌4型JS株的16S rRNA的同源性至少為80%的菌株或/和副豬嗜血桿菌5型ZJ株的16S rRNA的同源性至少為80%的菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗組合物，其特征在于:所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為與支氣管敗血波氏桿菌HN8株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株；所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為與多殺性巴氏桿菌A型HN5株的16S rRNA的同源性至少為90 %的菌株和/或多殺性巴氏桿菌D型HB4株的16S rRNA的同源性至少為90 %的菌株; 所述副豬嗜血桿菌抗原為與副豬嗜血桿菌4型JS株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株和/或副豬嗜血桿菌5型ZJ株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在于:所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為與支氣管敗血波氏桿菌HN8株的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株； 所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為與多殺性巴氏桿菌A型HN5株的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株和/或多殺性巴氏桿菌D型HB4株的16S rRNA的同源性至少為95%~99%的菌株； 所述副豬嗜血桿菌抗原為與副豬嗜血桿菌4型JS株的16S rRNA的同源性至少為95 %~99 %的菌株和/或副豬嗜血桿菌5型ZJ株的16SrRNA的同源性至少為95 %~99 %的菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，其特征在于:所述豬支氣管敗血波氏桿菌抗原為與支氣管敗血波氏桿菌HN8株的16S rRNA的同源性為98%~99%的菌株； 所述豬多殺性巴氏桿菌抗原為與多殺性巴氏桿菌A型HN5株的16S rRNA的同源性至少為98 %~99 %的菌株和/或多殺性巴氏桿菌D型HB4株的16S rRNA的同源性至少為98%~99%的菌株； 所述副豬嗜血桿菌抗原為與副豬嗜血桿菌4型JS株的16S rRNA的同源性至少為98%~99%的菌株和/或副豬嗜血桿菌5型ZJ株的16SrRNA的同源性至少為98%~99%的菌株?！?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求1~8中任意一項(xiàng)所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述疫苗組合物還包括其它豬的病原體的附加抗原，其選自豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抗原、豬瘟病毒抗原、豬偽狂犬病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原、豬肺炎支原體抗原、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原、豬流感病毒抗原中的一種或幾種； 所述疫苗組合物還包括獸醫(yī)學(xué)上可接受的疫苗佐劑，并且，在所述疫苗組合物中，所述疫苗佐劑含量為IOwt %~15wt%。
10.一種制備抗豬萎縮性鼻炎和副豬嗜血桿菌病疫苗組合物的方法，所述方法包括分別將所述豬支氣管敗血波氏桿菌株、所述豬多殺性巴氏桿菌株及所述副豬嗜血桿菌株進(jìn)行增殖后，再分別進(jìn)行濃縮、滅活，并加入疫苗佐劑，乳化或攪拌均勻制備。
【文檔編號(hào)】A61K39/10GK103816536SQ201210462390
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月16日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司