一種血清 12 型副豬嗜血桿菌疫苗株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種血清12型副豬嗜血桿菌疫苗株，其分類命名為副豬嗜血桿菌(Haemophi lus parasuis)，菌株名稱為SHCM10，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC NO：M 2014261，保藏日期：2014年6月15日；還涉及了所述的血清12型副豬嗜血桿菌疫苗株在制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的血清12型副豬嗜血桿菌SHCM10株生物學(xué)穩(wěn)定，對仔豬具有很強(qiáng)的致病性，滅活后接種仔豬，具有很好的免疫原性。將其作為疫苗候選株制成的單價疫苗安全性好，能夠?qū)ψ胸i產(chǎn)生較高的抗體，持續(xù)期長，具有很好的免疫效力，能夠抵抗同型野毒株的攻擊。免疫后豬群發(fā)病率和死亡率明顯降低，減少豬場的經(jīng)濟(jì)損失，其免疫效果達(dá)到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有商品化疫苗。
CCTCC NO:M 2014261
20140615
【專利說明】一種血清12型副豬嗜血桿菌疫苗株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品中副豬嗜血桿菌滅活疫苗領(lǐng)域，特別是涉及一種血清12 型副豬嗜血桿菌疫苗株，還涉及該疫苗株在制備滅活疫苗中的應(yīng)用以及制備滅活疫苗的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS)是一種G-球桿菌，是豬的一種條件 性病原菌，可引起副豬嗜血桿菌病。該病于1910年由德國學(xué)者Glasser首先報(bào)道，現(xiàn)已在 全世界范圍內(nèi)廣泛分布。目前，副豬嗜血桿菌感染是引起豬場仔豬高死亡率的主要病因之 一。該病目前給中國豬群帶來很大威脅，隨著豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS，藍(lán)耳?。┑牧餍校?副豬嗜血桿菌病給豬群造成的損失比以往更為嚴(yán)重。副豬嗜血桿菌只感染豬，具有很強(qiáng)的 宿主特異性，可以影響2周齡?4月齡的豬，主要在斷奶前后和保育舍階段發(fā)病，發(fā)病率一 般為10 %?15%，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)50%。
[0003] Hps是一種細(xì)小桿菌，在顯微鏡下呈多形態(tài)，非溶血性，不運(yùn)動，無芽孢，無鞭 毛，革蘭氏陰性。新分離的菌株多呈球桿狀或雙球狀，有時可呈短鏈狀，在陳舊培養(yǎng)物中 多呈多形態(tài)，有長桿狀和絲狀。Hps培養(yǎng)條件嚴(yán)格，生長依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD 或V因子），不需要X因子。目前認(rèn)為胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA培養(yǎng)基）和胰蛋白胨大豆 (TSB)培養(yǎng)基是最適培養(yǎng)基。在添加了 NAD和血清的TSA培養(yǎng)基上生長的菌落呈圓形，隆 起，表面光滑，邊緣整齊，灰白色半透明，針尖大小。
[0004] 副豬嗜血桿菌至少有15種血清型，但臨床分離菌中約20%無法定型。不同血清 型的毒力不同，其中血清1、5、10、12、13、14型毒力最強(qiáng)，2、4、8、112型具有中等毒力，3、6、 7、9、11型不能引起臨床感染。從世界范圍內(nèi)看，血清4、5、12、13型最為流行，日本、德國、 美國、西班牙、加拿大和中國以血清4型和12型最常見，澳大利亞和丹麥分離的菌株主要 為血清12型和13型，但最新的研宄結(jié)果表明，危害北美各豬場的Hps流行血清型發(fā)生了 改變，在美國的豬場中血清型5不再廣泛流行，而以血清4型（39% )和不能分型的分離 株（27% )最為流行。HPS在我國普遍流行，目前，在河北、河南、湖北、安徽、上海、廣東、江 西、江蘇等省市均有HPS病的發(fā)生報(bào)道。我國當(dāng)前Hps流行的優(yōu)勢血清型主要為4、5、12、13 型。
[0005] 目前以副豬嗜血桿菌病為代表的細(xì)菌病對養(yǎng)豬業(yè)的危害正日益加重，從而導(dǎo)致大 量使用抗生素進(jìn)行治療，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，尤其是副豬嗜 血桿菌，非常容易耐藥，導(dǎo)致治療效果不好，從而養(yǎng)殖戶加大抗生素用量，造成惡性循環(huán)。研 宄表明，用同血清型的菌株制成的滅活疫苗能夠有效抵抗野毒株的感染，是預(yù)防和控制副 豬嗜血桿菌病最有效的措施。近年來，國內(nèi)也開展了滅活疫苗的研宄，顯示了很好的防治效 果。因此，在了解本我國主要流行菌的血清型的基礎(chǔ)上，采用滅活疫苗進(jìn)行接種，可以有效 預(yù)防本病的發(fā)生。同一血清型的Hps毒力可能不同，免疫原性也不同，所以，篩選一株毒力 強(qiáng)、免疫原性好的菌株是制備Hps滅活疫苗的關(guān)鍵，也是預(yù)防控制本病的重中之重。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種血清12型副豬嗜血桿菌疫苗株 (SHCM10)，該菌株是一株強(qiáng)毒株，具有很好的免疫原性，利用該菌株可以制備出效果良好的 副豬嗜血桿菌滅活疫苗。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種血清12型副豬嗜血桿菌疫苗株， 其分類命名為副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis)，菌株名稱為SHCM10,已保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢、武漢大學(xué)，保藏編號：CCTCC NO :M 2014261，保藏日 期：2014年6月15日。
[0008] 該菌株由2010年5月在上海市崇明區(qū)一豬場發(fā)病豬分離獲得的，具有較強(qiáng)的毒力 和很好的免疫原性。經(jīng)瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)證明，該菌株為血清12型。
[0009] 利用該菌株通過常規(guī)方法制成不同佐劑的滅活疫苗，佐劑可以是白油佐劑、鋁膠 佐劑或206佐劑中的一種，分別得到的白油佐劑滅活疫苗含菌量為2. 5 X 109CFU/mL、鋁膠 佐劑滅活疫苗含菌量為2. OX 109CFU/mL、206佐劑滅活疫苗含菌量為2. 5X 109CFU/mL，可 預(yù)防由血清12型副豬嗜血桿菌引起的副豬嗜血桿菌病。從而表明，該菌株是一株具有很好 免疫原性。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種副豬嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：
[0011] ⑴菌種選擇血清12型副豬嗜血桿菌分離株SHCM10,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，地址：中國武漢、武漢大學(xué)，保藏編號：CCTCC N0:M2014261，保藏日期：2014年6月 15日；
[0012] (2)生產(chǎn)種子的制備，取凍干的SHCM10株，加無菌生理鹽水溶解后，劃線接種于 TSA培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h，挑取三個典型菌落，分別接種到3. OmLTSB液體培養(yǎng)基中，37°C 振蕩培養(yǎng)20?22h，收獲培養(yǎng)物，進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)，合格后按1 %比例接種到TSB液體培養(yǎng) 基中（即加入TSB液體培養(yǎng)基體積1 %的液體菌種），37°C振蕩培養(yǎng)20?22h，收獲培養(yǎng)物， 進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后，作為生產(chǎn)種子，置4°C，保存不超過1日；
[0013] (3)疫苗菌液的制備，取新鮮制備的生產(chǎn)種子，按1%比例接種到含有TSB培養(yǎng)基 的發(fā)酵罐中，37°C振蕩培養(yǎng)20?22h，收獲并取樣，進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)，并測量菌液0D值，每 批疫苗菌液應(yīng)無雜菌生長，且活菌數(shù)達(dá)到2. OX 109CFU/mL ;
[0014] (4)菌液的滅活，向檢驗(yàn)合格的菌液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液，使甲醛 最終的質(zhì)量濃度百分比為〇. 2%，于37°C滅活18h，每3?4h搖動一次；
[0015] (5)滅活疫苗的制備，將滅活檢驗(yàn)合格的菌液采用常規(guī)方法制備成白油佐劑滅活 疫苗、錯膠佐劑滅活疫苗或206佐劑滅活疫苗。
[0016] 上述步驟中的純粹性檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的血清12型副豬嗜血桿菌SHCM10株生物學(xué)穩(wěn)定，對 仔豬具有很強(qiáng)的致病性，滅活后接種仔豬，具有很好的免疫原性。將其作為疫苗候選株制成 的單價疫苗安全性好，能夠?qū)ψ胸i產(chǎn)生較高的抗體，持續(xù)期長，具有很好的免疫效力，能夠 抵抗同型野毒株的攻擊。免疫后豬群發(fā)病率和死亡率明顯降低，減少豬場的經(jīng)濟(jì)損失，其免 疫效果達(dá)到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有商品化疫苗。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限 定本發(fā)明的范圍。
[0019] 實(shí)施例1 :血清12型副豬嗜血桿菌的分離、鑒定及生物學(xué)特性
[0020] 一、副豬嗜血桿菌的分離
[0021] 1、培養(yǎng)基的配制
[0022] (l)TSA的配制，向1000mL蒸餾水中加入TSA 40g，充分溶解后，經(jīng)過121°C 30min 高壓滅菌后，放置室溫，待溫度降至50°C左右，分別向TSA中添加滅活的犢牛血清和NAD (煙 酰胺二嘌呤），使血清和NAD最終的質(zhì)量濃度百分比分別達(dá)到5%和0. 01%，然后倒入一次 性平皿中，待冷卻凝固后，包裝放置4°C備用。TSA平皿在4°C中保存最好不要超過30日，以 免平皿中的培養(yǎng)基干固，影響效果。
[0023] (2)TSB的配制，向1000mL蒸餾水中加入TSB 30g，充分溶解后，經(jīng)過121°C 30min 高壓滅菌后，放置室溫，待溫度降至50°C左右，分別向TSB中添加滅活的犢牛血清和NAD (煙 酰胺二嘌呤），使血清和NAD最終的質(zhì)量濃度百分比分別達(dá)到5%和0. 01 %，放置4°C備用。 TSB平皿在4°C中保存最好不要超過30日，以免影響培養(yǎng)效果。
[0024] 2、病原菌的分離
[0025] 2010年5月，在上海崇明區(qū)某養(yǎng)豬場出現(xiàn)臨床疑似副豬嗜血桿菌污染的病豬，解 剖后，表現(xiàn)出胸膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)腫脹。用無菌接種環(huán)從疑似病豬新鮮的心包積液、關(guān)節(jié)液 中取樣，在TSA培養(yǎng)基（含質(zhì)量濃度百分比5%血清和0.001 %的NAD)上劃線接種，37°C培 養(yǎng)24h?48h。挑取單個半透明隆起的小菌落，在TSA固體培養(yǎng)基上采取分區(qū)劃線法，進(jìn)行 2次單菌落純化培養(yǎng)，直至無任何雜菌為止。
[0026] 二、副豬嗜血桿菌的鑒定
[0027] 1、鏡檢
[0028] 挑取上述純化培養(yǎng)的單菌落在事先滴有生理鹽水的載玻片上涂菌，按照常規(guī)革蘭 氏染色法進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡觀察。在顯微鏡下可見，細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，具 有多種不同的形態(tài)，從單個的球桿菌到長的、細(xì)長的、甚至有細(xì)絲狀的菌體。
[0029] 2、NAD依賴性試驗(yàn)
[0030] 用接種環(huán)挑取上述純化的單菌落，水平劃線于無NAD的TSA平皿上，同時挑取金黃 色葡萄球菌垂直于水平劃線，37°C培養(yǎng)24h?48h，觀察是否出現(xiàn)"衛(wèi)星生長現(xiàn)象"，即在葡 萄球菌苔附近的的菌落較大，遠(yuǎn)側(cè)的菌落較小甚至沒有菌落存在。如果為副豬嗜血桿菌應(yīng) 該出現(xiàn)"衛(wèi)星生長現(xiàn)象"。
[0031] 3、生化鑒定試驗(yàn)
[0032] 挑取分離純化的疑似副豬嗜血桿菌的單菌落，水平劃線于TSA培養(yǎng)基上，于37°C 培養(yǎng)14h?16h，然后分別接種含NAD的微量生化管，于37°C培養(yǎng)48h，結(jié)果為發(fā)酵半乳糖、 葡萄糖、麥芽糖、果糖、和木糖，不發(fā)酵蔗糖和甘露醇。硝酸鹽還原試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)陽性，吲 哚試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)陰性。生化結(jié)果表明該菌符合副豬嗜血桿菌的生化特征。
[0033] 4、16S rRNA基因序列測定與分析
[0034] (1)引物設(shè)計(jì)，參照Olveira S等發(fā)表的副豬嗜血桿菌16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引 物，目的片段為822bp。

【權(quán)利要求】
1. 一種血清12型副豬嗜血桿菌疫苗株，其特征在于，其分類命名為副豬嗜血桿菌 (Haemophilus parasuis)，菌株名稱為SHCM10,已保藏于位于中國武漢的中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，保藏編號：CCTCC NO :M 2014261，保藏日期：2014年6月15日。
2. -種如權(quán)利要求1所述血清12型副豬嗜血桿菌疫苗株在制備副豬嗜血桿菌滅活疫 苗中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗為白油佐劑 滅活疫苗、鋁膠佐劑滅活疫苗或206佐劑滅活疫苗。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述白油佐劑滅活疫苗中含菌量為 2. 5X109CFU/mL〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鋁膠佐劑滅活疫苗中含菌量為 2. 0X109CFU/mL〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述206佐劑滅活疫苗中含菌量為 2. 5X109CFU/mL〇
7. -種副豬嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 菌種選擇血清12型副豬嗜血桿菌分離株SHCM10,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，地址：中國武漢、武漢大學(xué)，保藏編號：CCTCC NO :M2014261，保藏日期：2014年6月15 曰； (2) 生產(chǎn)種子的制備，取凍干的SHCM10株，加無菌生理鹽水溶解后，劃線接種于TSA培 養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h，挑取三個典型菌落，分別接種到3. OmLTSB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩 培養(yǎng)20?22h，收獲培養(yǎng)物，進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)，合格后按1 %比例接種到TSB液體培養(yǎng)基中， 37°C振蕩培養(yǎng)20?22h，收獲培養(yǎng)物，進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后，作為生產(chǎn)種子，置4°C， 保存不超過1日； (3) 疫苗菌液的制備，取新鮮制備的生產(chǎn)種子，按1 %比例接種到含有TSB培養(yǎng)基的發(fā) 酵罐中，37 °C振蕩培養(yǎng)20?22h，收獲并取樣，進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)，并測量菌液0D值，每批疫苗 菌液應(yīng)無雜菌生長，且活菌數(shù)達(dá)到2. OX 109CFU/mL ; (4) 菌液的滅活，向檢驗(yàn)合格的菌液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液，使甲醛最終 的質(zhì)量濃度百分比為〇. 2%，于37°C滅活18h，每3?4h搖動一次； (5) 滅活疫苗的制備，將滅活檢驗(yàn)合格的菌液采用常規(guī)方法制備成白油佐劑滅活疫苗、 錯膠佐劑滅活疫苗或206佐劑滅活疫苗。
【文檔編號】C12N1/20GK104450556SQ201410528780
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】錢鐘, 李甜甜, 王鄭, 徐萍, 商俊 申請人:揚(yáng)州優(yōu)邦生物制藥有限公司