專利名稱：樺褐孔菌液體發(fā)酵產(chǎn)物氯仿提取物在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥食用真菌提取物，特別具體涉及樺褐孔菌液體發(fā)酵產(chǎn)物氯仿提取物在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
樺褐孔菌o/WiijTOAS」屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬，是一種寄生在多種樹木(白樺、銀 樺、榆樹、赤楊等)樹皮上的白腐菌，主要分布于俄羅斯西伯利亞和遠(yuǎn)東地區(qū)、北歐、波蘭、我國(guó)大小興安嶺以及長(zhǎng)白山地區(qū)、日本北海道及北美北部等北緯45° 50°的寒冷地區(qū)。樺褐孔菌是一種珍稀的藥食用真菌，具有多種藥用價(jià)值，早在16世紀(jì)，北歐多個(gè)國(guó)家的民間就開始食用樺褐孔菌子實(shí)體，用來防治胃癌、腸癌、心臟病、糖尿病等多種疾病。由于樺褐孔菌野生資源匱乏，深層發(fā)酵技術(shù)逐漸被應(yīng)用于樺褐孔菌的生產(chǎn)。近幾年的研究表明，樺褐孔菌提取物表現(xiàn)出多種生物活性，主要有抗癌、抗氧化、降血糖、抗病毒、抗真菌、保肝作用等。越來越多的活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，其中主要包括多糖、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、多種氧化三萜類化合物、羊毛留醇型三萜類化合物、木質(zhì)素以及黑色素類等。二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidaseIV, DPP-1V)是一種跨膜的絲氨酸蛋白酶，屬于脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase, POP)家族,其廣泛分布于腎臟、胃腸道、結(jié)締組織、淋巴結(jié)等組織中，具有多種活性。DPP-1V是由兩個(gè)亞基組成的一種II型跨膜糖基化蛋白，分子質(zhì)量為240kD，由766個(gè)氨基酸組成。DPP-1V的活性中心細(xì)胞膜外部分C末端區(qū)域，凡是N末端第二位上存在脯氨酸(Pro)殘基或丙氨酸(Ala)殘基的多肽多是其底物，胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)就是其中之一。GLP-1是由小腸中L細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性激素，主要是通過促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素的釋放、延緩胃排空以及胰島β細(xì)胞保護(hù)作用來實(shí)現(xiàn)控制血糖的目的。GLP-1是由36個(gè)氨基酸組成的多肽，其N段第二位為Ala，能夠被DPP-1V識(shí)別，故其在分泌后很快便被DPP-1V剪切而失去降血糖的活性。因此，抑制DPP-1V的活性，可以減少GLP-1的降解，延長(zhǎng)其半衰期，增加其在血液中的濃度，進(jìn)而起到降血糖的作用。默克公司的sitagliptin于2006年8月獲FDA批準(zhǔn)在墨西哥上市，是第一個(gè)獲準(zhǔn)上市的DPP-1V抑制劑類藥物，該藥也是目前唯一在我國(guó)上市的此類藥物。諾華公司的vildagliptin與百時(shí)美施貴寶公司的saxagliptin分別在歐盟及歐美上市，日本武田公司的alogliptin已在日本獲準(zhǔn)，目前正在申請(qǐng)?jiān)诿绹?guó)上市，目前還有很多正處于待批和臨床階段。利用此類藥物降糖無低血糖風(fēng)險(xiǎn)、避免了體重增加等副作用，與其他藥物(如二甲雙胍)聯(lián)用效果更佳穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供樺褐孔菌液體發(fā)酵產(chǎn)物的氯仿提取物在制備DPP-1V抑制劑和制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明研究了樺褐孔菌的發(fā)酵特性，并采用深層發(fā)酵技術(shù)制備了樺褐孔菌的發(fā)酵產(chǎn)物，50 L發(fā)酵罐對(duì)樺褐孔菌進(jìn)行規(guī)模化發(fā)酵，第9 d生物量達(dá)到最大(8. 6 g/L);得到樺褐孔菌菌粉201. 96 g，得率6. 73 g/L。采用不同溶劑對(duì)樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行提取，得到10種提取物，對(duì)各提取物抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中菌粉氯仿提取物活性較高，200 mg/L濃度下對(duì)DPP-4的抑制率分別為38. 1%和31. 2%。本發(fā)明采用娃膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析、大孔樹脂柱層析、制備型HPLC等多種現(xiàn)代分離純化技術(shù)對(duì)菌粉氯仿提取物及發(fā)酵液甲醇提取物進(jìn)行分離純化，200 mg/L濃度下活性組分抑制率分別升高至47. 1%和51. 7%，分離得到了活性部位。本發(fā)明利用UPLC-Q-T0F-MS對(duì)活性部位的化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷，推斷出19個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中生物堿類物質(zhì)10個(gè)，留類、三萜類及其他物質(zhì)9個(gè)。本發(fā)明利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)化合物與酶分子的相互作用進(jìn)行模擬，通過與已上市藥物Sitagliptin比較，結(jié)果顯示化合物5、8、9、14、15與DPP-1V分子親和力較強(qiáng)，是活性 物質(zhì)。以下通過實(shí)例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1以DPP-4抑制活性為導(dǎo)向從樺褐孔菌菌粉中分離活性部位。黑色柱狀為陽性對(duì)照IIe-Pro-1Ie ;灰色柱狀為活性最高部位； water :水提物；Hexane :正己燒提取物；Chlf :氯仿提取物；
EthOAc :乙酸乙酯提取物；Methanol :甲醇提取物。圖2、圖3UPLC-MS和化合物1-19結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1樺褐孔菌液體發(fā)酵工藝。1.菌種以樺褐孔菌(中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏號(hào)cfcc 60260)的菌株作為出發(fā)菌種。2.斜面培養(yǎng)將樟芝菌絲體轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)288小時(shí)。斜面培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然。3.種子搖瓶培養(yǎng)斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有100 mL搖瓶培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，26°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 rpm,培養(yǎng)5天。搖瓶培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨3，硫酸鎂O. 5，磷酸二氫鉀1，pH自然。4.發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)樺褐孔菌發(fā)酵液按10%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL發(fā)酵搖瓶中，25°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 rpm，培養(yǎng)10天。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖25，蛋白胨3，硫酸鎂1. 5，磷酸二氫鉀3，pH4。5. 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵搖瓶發(fā)酵完成后取出10%發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入另一裝有新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)速150 rpm，通氣量控制在L 67 vvm，25°C條件下培養(yǎng)10天。實(shí)施例2樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物制備。
發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物自發(fā)酵罐中取出，6層紗布過濾，將發(fā)酵液與菌絲體進(jìn)行初步分離，發(fā)酵液6000 rpm/min離心10 min,取上清,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 °C下減壓濃縮，于冷凍干燥機(jī)上凍干，研磨成粉，過100目篩，即得樺褐孔菌發(fā)酵液凍干粉；將過濾得到的菌絲體及離心后沉淀合并，用去離子水清洗3次，然后于冷凍干燥機(jī)上凍干，研磨成粉，過100目篩，即得樺褐孔菌菌粉。分別稱取150 g菌粉及90 g發(fā)酵液凍干粉置于3 L燒杯中(內(nèi)置磁力攪拌轉(zhuǎn)子)，加入I L正己烷，室溫下攪拌提取12 h，過濾，將濾渣轉(zhuǎn)移回?zé)?，再加入I L正己烷，繼續(xù)提取12 h，如此連續(xù)提取3次，收集3次的正己烷提取液；待菌粉中的正己烷揮發(fā)干凈，往燒杯中加入I L氯仿，按照上述正己烷提取的方法，連續(xù)提取3次，得到氯仿提取液；如此依次得到乙酸乙酯提取液及甲醇提取液；待甲醇揮發(fā)盡以后，往燒杯中加入I L蒸餾水，90 °C下攪拌提取30 min, 6000 rpm/min離心10 min，取上清，連續(xù)提取3次，收集3次上清液即得菌粉/發(fā)酵液凍干粉的水提液。正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，稱重，計(jì)算得率。水提液旋蒸濃縮，再用冷凍干燥機(jī)凍干，磨粉，稱重。五種提取物總質(zhì)量為46. 26 g，提取總得率為30. 84% ;菌粉正己烷提取物·10. 29g，得率6. 86% ;菌粉氯仿提取物2. 75g，得率1. 83% ;菌粉乙酸乙酯提取物1. 70g，得率1.13% ;菌粉甲醇提取物15. 22g，得率 10. 15% ;菌粉水提物16. 30g，得率10. 87%。實(shí)施例3發(fā)酵產(chǎn)物提取物DPP-1V抑制活性評(píng)價(jià)的方法。酶促反應(yīng)體系(見表I)共分為4組(陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組以及陽性空白組)，陰性對(duì)照組由酶、緩沖液以及底物組成；空白對(duì)照組只有酶和緩沖液；陽性對(duì)照組由酶、陽性對(duì)照物、緩沖液和底物組成；陽性空白組由陽性對(duì)照物、緩沖液和底物組成。加樣將底物、酶、緩沖液于37 °C下預(yù)熱30 min，然后按照酶、緩沖液、底物的順序依次加入96孔板，每個(gè)孔內(nèi)樣品的總體積均為100 μ L,震蕩，37 °C反應(yīng)2h，于405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。表I酶促反應(yīng)體系組成
權(quán)利要求
1.樺褐孔菌粉氯仿提取物在二肽基肽酶IV抑制劑和治療糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征為，所述氯仿提取物由以下19種化合物中的I種或多種構(gòu)成化合物I.3，3 - 二甲基-9 -(丙氨基)_3，4 - 二氫-1 (2H)-吖啶酮(I) (3，3-Dimethyl_9-(propylamino)-3, 4-dihydro-l(2H)-acridinone)；化合物2.2 - 丁基-3 - (3 -甲基苯基)-4 (3H)-喹唑啉酮(2_Butyl_3-(3-methylphenyl)-4(3H)-quinazolinone)；化合物3.1-(4-甲基-1 -哌嗪基)-2 - {[3 - (2 -甲基-1 -哌啶基)丙基]氨基} 乙 SM (1-(4-Methyl-l-piperazinyl)~2~{[3-(2-methyl-l-piperidinyl)propyl]amino} ethanone)；化合物41- {[2 - (二乙氨基)乙基]氨基} -3-(4-甲基-1 -哌嗪基)_2 -丙醇 (1-((2-(Diethylamino) ethyl)amino)-3-(4-methyl-l-piperazinyl)-2-propanol)； 化合物5N-{ (1S，2S)-1 -芐基-3 - [1-1 -(環(huán)己基甲基)肼基]-2 -羥基丙基}_N 2 -[(2-甲氧基乙氧基)羰基]-L-繳氨酰胺(N-{(IS, 2S) -l-benzyl-3-[1-1-(cyclohexyImet hyl)hydrazino]-2-hydroxypropyl}_N2_[(2-methoxyethoxy)carbonyl]_L_valinamide)； 化合物6I,1-乙基-3，3 -雙(2，2，6，6 -四甲基-1 -丙-2 -烯-1 -基哌啶_4 -基) 服(I, l-dim-ethyl-3, 3-bis(2, 2, 6, 6-tetramethyl-l-prop-2-en-l-ylpiperidin-4-yl) urea)；化合物71- (3, 6 - 二氧批P定-1 (2H)-基)-3 - [3 - (二甲基氛基)丙基]服(l-(3，6_dih ydropyridin-1(2H)-yl)-3-[3-(dimethylamino)propyl]urea)；化合物8(2R，4S，5S，7S)-5-氨基-丁基 _7_ {4 - [4 - (二甲基氨基)丁氧基]-3-(3-甲氧基丙氧基)芐基}-4 -羥基-2，8-二甲基戊酰胺((21 ，45，55，75)-5-&1^110-^131^71-7-{4-[4-(dimethylamino)-but-oxy]_3_(3-meth-oxypropoxy)benzyl}-4-hydroxy-2, 8-dim -ethylnonanamide)；化合物9.2，2-雙[2，2, 6, 6 -四甲基-1 -(羊氧基)哌唳-4 -基]己燒-二酸鹽(2，2-bis [ 2, 2, 6, 6-tetramethyl-l-(octyloxy)piperidin-4-yl]hexane-dioate)；化合物10.3-(4-環(huán)己基丁基)-6，ll - 二甲基-1，2，3，4，5，6 -六氫 _2，6 -亞甲基-3 -苯并吖辛因(3-(4_cyclohexylbutyl)-6, 11-dimethyl-l, 2, 3, 4, 5, 6-hexahydro-2, 6-methano-.3_benzazocine)；化合物11[(3R，5S，8R，9S，10S，`13S，14S，17S)-17 - (1-羥基丙 _`2 -炔基)-10，13 - 二甲基-2，3, 4，5，6，7，8，9，`11，12，14，15，16，17-tetradecahydro-lH-環(huán)戍 _ a]菲 _3- 醇([(3R, 5S, 8R, 9S, 10S, 13S, 14S, 17S) -17- (l-hydroxyprop-2-ynyl) -10，13-dimethyl-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, `11, 12, 14, 15, 16, 17-tetradecahydro-lH-cyclopent-a[a]phenanthren-3-oI ])； 化合物12(2S，4aR, 10bR)-l, I`, 4a, IOb-四甲基-1，2，3，4，4a, 4b, 5，6，10b, 11，12，12a_ 十二氫chrysen-2-醇((2S, 4aR, IObR) -1, I, 4a, 10b-tetra-methyl-l, 2, 3, 4, 4a, 4b, `5`, 6, 10b, 11,`12,12a-dodecahydrochrysen-2-ol)； 化合物13 (3β，5α，9β，16α，205)-3，20_ 雙(二甲基氨基)_4_ (羥甲基)_4，14 -二甲基-9, 19-cyclopreg -正 _6 _ 稀-16-醇((3 β，5 α，9 β，16 a，20S) -3，20-bis (dimethylamino)~4~(hydroxymethyl)-4, 14-dimethyl_9，19-cyclopreg-n-6-en-16_ol)； 化合物14 (22E)-stigmasta_7, 22，`25 -三烯_3 -基乙酸酯((22E)-stigmasta-7，22，25_trien-3-yl acetate)； 化合物15 (3 β ) - olean -12 -烯-3 -基-(4-輕基苯基)丙酸乙酯 ((3 β)-olean-12-en-3-yl-(4-hydroxyphenyl)propanoate)； 化合物16 (2S)-2 - [ (IS)-1 -苯乙基]-`3，6-1 - 二氫-2H-吡喃((2S)-2-[(lS)-l-phenylethyl]-3, 6-l-dihydro-2H-pyran)； 化合物17` 齒葉棄吾醇(Ligudentatol)； 化合物18 ` 1,6- 二脫氧-3，4-0- (1，`5，9_trime-thyldecylidene)-D 甘露糖醇(1，6_dideoxy-3,4-0-(1, 5, 9-trime-thyldecylidene)-Dmannitol)； 化合物19 (15，4&1 ，51 ，8&5)-5-氫-父￥-1-2，5- 二甲基己基]_4a_ 甲基十氫萘-1 -醇((lS，4aR,5R, 8aS)-5-[(IR)-5-hydro-xy-l, 5-dimethylhexyl]-4a-methyldecahydronaphthalen-l_ol )0
2.權(quán)利要求1中所述的19種化合物中的I種或多種，在制備二肽基肽酶IV抑制劑和治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及樺褐孔菌發(fā)酵菌粉氯仿提取物及其中化合物在治療糖尿病藥物中的應(yīng)用，該提取物包含19種化合物，19中化合物中的1種或幾種組合，可用于制備二肽基肽酶IV抑制劑和治療糖尿病藥物。
文檔編號(hào)A61K31/496GK103006655SQ20121053034
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者許正宏, 史勁松, 陸震鳴, 耿燕, 李恒, 許泓瑜, 徐國(guó)華, 王英燕, 錢建瑛 申請(qǐng)人:江南大學(xué), 江蘇神華藥業(yè)有限公司