適于治療或預(yù)防結(jié)核的脂質(zhì)體制劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了包含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株之片段的脂質(zhì)體制劑，還提供了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株，其片段可摻入選定的所述脂質(zhì)體制劑的實(shí)施方案中。本發(fā)明還提供了包含所述脂質(zhì)體制劑的懸液和藥物組合物。此外，公開(kāi)了脂質(zhì)體制劑的用途，其用于治療人或動(dòng)物體的方法，特別是用于治療或預(yù)防結(jié)核的方法，例如預(yù)防潛伏期結(jié)核或預(yù)防結(jié)核，并任選地用于聯(lián)合治療中。本發(fā)明的制劑含有蔗糖并且/或者平均粒度低于結(jié)核治療的基于脂質(zhì)體的常規(guī)藥劑，導(dǎo)致更高的生物利用度和效力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】適于治療或預(yù)防結(jié)核的脂質(zhì)體制劑
[0001]引言和【背景技術(shù)】【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明提供了包含來(lái)自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)復(fù)合菌株的脂質(zhì)體制劑，以及包含這些制劑的懸液和藥物組合物及其在治療方法(特別是治療或預(yù)防結(jié)核)中的相應(yīng)用途。本發(fā)明的制劑含有蔗糖和/或平均顆粒尺寸低于結(jié)核治療的基于脂質(zhì)體的常規(guī)藥劑，導(dǎo)致更高的生物利用度和效力。
【背景技術(shù)】 [0003]結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosis-complex, MTB-C,其包括分枝桿菌M.tuberculosis、M.bovis、M.microti和M.africanum)桿菌導(dǎo)致的慢性感染性疾病。分枝桿菌細(xì)胞包膜的主要獨(dú)特特征是厚且為蠟質(zhì)的細(xì)胞壁。細(xì)胞壁屏障的特性還促進(jìn)該生物的胞內(nèi)存活，這是通過(guò)作為宿主與MTB-C桿菌之間免疫反應(yīng)的直接調(diào)節(jié)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。包膜由兩個(gè)不同部分組成:質(zhì)膜，及其周?chē)谋?。?xì)胞壁是由共價(jià)連接的肽聚糖結(jié)構(gòu)形成的骨架，具有通過(guò)磷酸二酯鍵附著的支鏈多糖——阿拉伯半乳聚糖。阿拉伯半乳聚糖的遠(yuǎn)端被高分子量脂肪酸(分枝菌酸，具有分枝菌的獨(dú)特大小和結(jié)構(gòu))酯化。
[0004]據(jù)世界衛(wèi)生組織稱(chēng)，全世界每年有9，000, 000例人感染該疾病的新病例記錄在案，約2，000, 000人死亡。全世界的感染人數(shù)被認(rèn)為超過(guò)2，700, 000, 000，每年又產(chǎn)生九百萬(wàn)至一千萬(wàn)的新感染。
[0005]本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了多種基于有毒力或無(wú)毒力分枝桿菌菌株細(xì)胞壁片段的針對(duì)結(jié)核的疫苗。目前用于對(duì)結(jié)核進(jìn)行預(yù)防性處理的疫苗是基于稱(chēng)為BCG (卡介苗，M.bovis的一種減毒變體)菌株的細(xì)菌。還已知，疫苗組合物中使用的佐劑能極大地影響其有效性。
[0006]海藻糖分枝菌酸酯(特別是海藻糖二分枝菌酸酯)是結(jié)核分枝桿菌提取物中最具生物活性的脂質(zhì)，其誘導(dǎo)影響肉芽腫形成的促炎性級(jí)聯(lián)。應(yīng)該指出，關(guān)于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中這些化合物的存在量，并沒(méi)有生物學(xué)數(shù)據(jù)。來(lái)自該物種的任何樣品都具有高度生物復(fù)雜性。因此，為了實(shí)施定量分析，將需要激進(jìn)的、復(fù)雜的并且漫長(zhǎng)的純化步驟，導(dǎo)致用于進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析的純化化合物的量過(guò)低。這正是沒(méi)有關(guān)于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中每種化合物確切百分比的已公開(kāi)數(shù)據(jù)的原因。一些糖脂是MTB-C細(xì)胞的典型組分，例如脂阿拉伯甘露聚糖。脂阿拉伯甘露聚糖與MTB-C毒力有關(guān)。
[0007]E.Ribi et al.，Naturel963, 198，1214-1215 頁(yè)描述了用包含無(wú)毒力卡介苗(BCG)菌株細(xì)胞壁片段和礦物油的組合物進(jìn)行的免疫測(cè)定。所述片段通過(guò)在礦物油中對(duì)所述菌株的培養(yǎng)物進(jìn)行勻漿而獲得。該組合物比常規(guī)疫苗(BCG)更有效。盡管如此，同一文章中還描述了所述細(xì)胞壁片段當(dāng)在水中勻漿并且不存在礦物油時(shí)不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0008]D.P.Pal et al., Indian J.Med.Res.1977，65，340-345 頁(yè)描述了用有毒力的H37Rv菌株的細(xì)胞壁片段和礦物油制備的疫苗。在這種情況下，細(xì)胞壁片段通過(guò)在水相中對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行勻漿而獲得，然后向組合物中加入礦物油。還描述了，在水相中勻漿的細(xì)胞壁片段無(wú)免疫原性，必須存在礦物油才能使疫苗有效。
[0009]G.K.Khuller et al.，F(xiàn)olia Microbiol.，1992，37，407-412 頁(yè)描述了結(jié)核分枝桿菌的無(wú)毒力H37Ra菌株的細(xì)胞壁的不同級(jí)分的保護(hù)性效力，所述級(jí)分與弗氏不完全佐劑(也包括礦物油)配制在一起。
[0010]E.M.Agger et al.，Scand.J.1mmunol.，2OO2, 56，443_447 頁(yè)描述了包含有毒力的H37Rv菌株的細(xì)胞壁片段的疫苗，其在包含陽(yáng)離子型表面活性劑二甲基雙十八烷基溴化銨作為佐劑的情況下有效。還描述了，用不包含所述佐劑的勻漿結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行的測(cè)定在小鼠模型中不產(chǎn)生針對(duì)結(jié)核的抗性水平。
[0011]1.M.0rme Vaccine，2006，24，2-19頁(yè)是一篇結(jié)核疫苗的綜述文章，其描述了，基于常規(guī)卡介苗(BCG)的疫苗在為成年人提供針對(duì)結(jié)核的保護(hù)中基本無(wú)效。
[0012]可能受益于涉及結(jié)核的治療或預(yù)防的個(gè)體可分為以下亞組:
[0013](I)未接觸該疾病的個(gè)體。預(yù)防性疫苗接種可防止這些個(gè)體發(fā)生感染。
[0014](II)已接觸該疾病但尚未感染的個(gè)體。皮膚結(jié)核菌素測(cè)試(TST)為陰性。初級(jí)預(yù)防(primary prophylaxis)能防止這些個(gè)體發(fā)生感染。
[0015](III)具有潛伏期結(jié)核的未發(fā)病的個(gè)體?？赏ㄟ^(guò)施用化學(xué)治療來(lái)降低疾病爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。化學(xué)治療還提供了使這些個(gè)體基本停止作為高風(fēng)險(xiǎn)感染源的優(yōu)點(diǎn)。
[0016](IV)患病個(gè)體，即患有該疾病，通常是該疾病的原發(fā)形式，但沒(méi)有或基本沒(méi)有傳染性?；瘜W(xué)治療避免這些個(gè)體變成傳染性。
[0017]感染開(kāi)始后，本領(lǐng)域描述了多種用于在感染個(gè)體(即具有潛伏期結(jié)核的個(gè)體)中防止發(fā)生活動(dòng)性結(jié)核的治療。
[0018]例如，在專(zhuān)利申請(qǐng)EP2196473A1中描述了，為了治療感染個(gè)體中的結(jié)核可以在長(zhǎng)至數(shù)月的時(shí)間中向尚未發(fā)病以及已經(jīng)發(fā)病的個(gè)體施用多種藥物，包括異煙肼。
[0019]在專(zhuān)利申請(qǐng)ES2231037A1中描述了免疫治療劑，其包含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)的有毒力菌株的細(xì)胞片段，用于制備與其他藥物(如異煙肼或利福霉素)聯(lián)合用于治療感染個(gè)體中的結(jié)核的藥物。該專(zhuān)利申請(qǐng)還描述了用于制備包含MTB-C菌株之細(xì)胞壁片段的免疫治療劑的方法。
[0020]如W02010/031883A1所指出，潛伏期結(jié)核感染的傳播主要通過(guò)吸入被結(jié)核分枝桿菌感染的氣溶膠而發(fā)生。因此，與患肺結(jié)核并因此能夠散播感染氣溶膠的患者直接接觸的人(例如與他們住在一起或者有任何類(lèi)型的充分或頻繁接觸的人)被認(rèn)為是風(fēng)險(xiǎn)群體。
[0021]因此，通常向1組個(gè)體(見(jiàn)上文)施用的感染初級(jí)預(yù)防是基于每天施用5mg/kg劑量的異煙肼(不超過(guò)300mg/天)的初級(jí)化學(xué)預(yù)防。該處理適用于與感染個(gè)體住在一起和/或任何類(lèi)型密切接觸的任何年齡的所有TST陰性個(gè)體。在這種情況下，化學(xué)預(yù)防需要在停止接觸感染源后或感染源不具感染性后維持三個(gè)月。然而，化學(xué)預(yù)防在一些情況下可導(dǎo)致繼發(fā)性的不良效果，如 Martinez et al., Arch.Bronchoneumo1., 2005, 41 (I), 27-33 所述。
[0022]包含有毒力結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)片段的藥物已經(jīng)描述于例如EP1690549BUEP2090318A1 和 PCT/ES2009/000436。EP2090318A1 和 PCT/ES2009/000436 描述了包含有毒力結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)片段的藥物組合物，其作為適于預(yù)防性防止結(jié)核(任選地與其他藥物組合)的藥物。另一方面，EP1690549B1描述了適于治療結(jié)核的藥物組合物，其包含任選地與其他藥物組合的MTB-C片段。[0023]專(zhuān)利申請(qǐng)EP2090318A1中報(bào)道，施用包含基于有毒力MTB-C菌株細(xì)胞壁片段之藥劑的藥物能夠誘導(dǎo)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的產(chǎn)生干擾素-Y的Thl型應(yīng)答。所述抗原包括Ag85B和Ag85A，它們是復(fù)合體Ag85的部分，后者由一系列低分子量蛋白組成，這些蛋白在細(xì)胞壁的生物合成中發(fā)揮決定作用，并且在細(xì)菌培養(yǎng)處于指數(shù)生長(zhǎng)(log)期時(shí)以可觀(guān)的量產(chǎn)生。EP2090318A1還報(bào)道了，基于常規(guī)卡介苗(BCG)的疫苗不產(chǎn)生針對(duì)復(fù)合體Ag85的免疫保護(hù)應(yīng)答。特定淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-Y發(fā)揮關(guān)鍵作用:它使得感染的巨噬細(xì)胞能夠終止桿菌的生長(zhǎng)(North&Young, Ann.Rev.Tmmunol., 2004, 22:599-623)。
[0024]世界衛(wèi)生組織認(rèn)識(shí)到，與無(wú)HIV感染的人相比，患有HIV的人發(fā)生結(jié)核(TB)的風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)要高 20-37 倍?！癎uidelines for intensifiedtuberculosis case-finding andisoniazid preventive therapy for people living withHIV in resource-constrainedsettings^ffHO Guidelines2011, ISBN:9789241500708)中給出了概況。然而，異煙肼預(yù)防性治療不是會(huì)為HIV陽(yáng)性個(gè)體提供持久保護(hù)的疫苗接種。相反，異煙肼必須定期施用，并且異煙肼抗性也降低了該療法。因此，仍然需要提供用于HIV陽(yáng)性人受試者的強(qiáng)有力的預(yù)防和治療性處理。
[0025]發(fā)明目的
[0026]本發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的藥劑，其在HIV陽(yáng)性和HIV陰性人受試者中都適于預(yù)防或治療結(jié)核，例如預(yù)防潛伏期結(jié)核、初級(jí)預(yù)防和/或治療潛伏期或活動(dòng)性結(jié)核。另一個(gè)目的是提供適于制備所述藥劑的MTB-C菌株。制備該藥劑的方法是本發(fā)明的另一個(gè)目的。
[0027]定義
[0028]“FCMtb”代表來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株的片段。
[0029]如果沒(méi)有另外指明，則“顆粒尺寸”(亦稱(chēng)“粒度”)指顆粒的直徑。當(dāng)顆粒尺寸無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定時(shí)，則指近似顆粒尺寸。
[0030]“z-平均”是如“材料和方法”章節(jié)中所述測(cè)定的平均顆粒尺寸。
[0031]纏H
[0032]AIDS 獲得性免疫缺陷綜合征
[0033]BCG卡介苗
[0034]CFU 集落形成單位
[0035]DP藥物產(chǎn)品
[0036]DS藥物物質(zhì)
[0037]ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定
[0038]ELISP0T酶聯(lián)免疫點(diǎn)測(cè)定
[0039]EMEA 歐洲藥品管理局
[0040]FCMtb 結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞的片段
[0041]FIM 首次在人中
[0042]HIV 人免疫缺陷病毒
[0043]IFN- Y 干擾素 Y
[0044]IGTIP Germ ans Trias i Pujol 的衛(wèi)生科學(xué)研究所
[0045]IMP 研究性藥物產(chǎn)品
[0046]IPC過(guò)程控制(In process controls)[0047]LCS 脂質(zhì)體濃縮物懸液
[0048]LTBI潛伏期結(jié)核感染
[0049]LPS脂多糖
[0050]Mtb結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)
[0051]Mtb結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis-complex)
[0052]NZB新西蘭黑
[0053]NZff新西蘭白
[0054]PPD蛋白純化衍生物
[0055]q.s.適量
[0056]TB結(jié)核
[0057]TST結(jié)核皮膚測(cè)試
[0058]WHO世界衛(wèi)生組織
[0059]w/v重量/體積
[0060]w/w重量/重量`
【發(fā)明內(nèi)容】
[0061]本發(fā)明提供了脂質(zhì)體制劑，其包含來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株的片段(FCMtb)和脂質(zhì)體形成劑。
[0062]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，顆粒的Z-平均尺寸(通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定)為120nm或更小，優(yōu)選IlOnm或更小,更優(yōu)選95nm或更小,最優(yōu)選80nm或更小。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑包含1-20% (w/v)的鹿糖,優(yōu)選2-12% (w/v)的鹿糖,更優(yōu)選3-8% (w/v)的鹿糖，最優(yōu)選4-6%(w/v)的蔗糖。重要的是要注意，盡管這兩個(gè)實(shí)施方案的每一個(gè)都可以獨(dú)立實(shí)現(xiàn)，但這些實(shí)施方案不視為互斥的，而是完全可以組合。
[0063]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑的Z-平均顆粒尺寸為40_120nm，優(yōu)選50-1 IOnm,更優(yōu)選 55_95nm,最優(yōu)選 55_80nm。
[0064]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑的平均顆粒尺寸可以更小，使得該脂質(zhì)體制劑為乳劑，即，該具體實(shí)施方案中顆粒的Z-平均尺寸優(yōu)選小于40nm。
[0065]在上述實(shí)施方案中任何一種或更多種的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑是顆粒多分散性指數(shù)為0.4或更小(優(yōu)選0.3或更小)的脂質(zhì)體制劑。
[0066]在任何上述實(shí)施方案的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株是有毒力的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株。
[0067]在任何上述實(shí)施方案中，還優(yōu)選(a)所述來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株的片段與(b)所述脂質(zhì)體形成劑之間的比例為0.01:1至1:1，優(yōu)選0.06:1至0.1:1。
[0068]在任何上述實(shí)施方案的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑還包含:(d)表面活性物質(zhì)(tensioactive agent)。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含(d)表面活性物質(zhì)的脂質(zhì)體制劑是這樣的脂質(zhì)體制劑，其中(a)與(d)的比值為0.1:1至10:1 (w/w)，優(yōu)選 0.5:1 至 2:1 (w/w),最優(yōu)選 0.6:1 至 0.8:1 (w/w)。
[0069]在上述實(shí)施方案的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑中的脂質(zhì)體形成劑是磷月旨，優(yōu)選卵磷脂，更優(yōu)選選自蛋卵磷脂或大豆卵磷脂，最優(yōu)選大豆卵磷脂，其中每一種都可以是氫化的，部分氫化的或非氫化的。
[0070]在含有表面活性劑的脂質(zhì)體制劑的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表面活性物質(zhì)選自膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、膽固醇和膽固醇琥拍酸單酯(cholesterol hemisuccinate)。
[0071]在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑是這樣的脂質(zhì)體制劑，其中MTB-C細(xì)胞的片段是細(xì)胞壁片段或者包含細(xì)胞壁片段。
[0072]在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑包含MTB-C菌株NCTC13536的片段，該菌株在2010年保藏于倫敦的NCTC。該菌株也稱(chēng)為511，因此NCTC13536和511這兩種名稱(chēng)可互換使用。
[0073]在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑包含以下的至少兩項(xiàng)，優(yōu)選三項(xiàng)，更優(yōu)選四項(xiàng)，最優(yōu)選全部:
[0074](i)第一多肽，其分子量為約70kDa，與結(jié)核分枝桿菌HSP70蛋白(Rv0350)的質(zhì)量指紋圖譜相似，
[0075](ii)第二多肽，其分子量為約38kDa，與結(jié)核分枝桿菌38kDa蛋白(Rv0934)的質(zhì)量指紋圖譜相似，
[0076](iii)第三多肽，其分子量為約30kDa，與結(jié)核分枝桿菌Ag85B蛋白(Rvl866c)的質(zhì)量指紋圖譜相似，和
[0077](iv)第四多肽，其分子量為約IOkDa,與結(jié)核分枝桿菌CFPlO蛋白(Rv3874)的質(zhì)量指紋圖譜相似，和
[0078](V)第五多妝,其分子量為約6kDa,與結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白(Rv3875)的質(zhì)量指紋圖譜相似。`
[0079]在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑包含分子量約19kDa的脂多肽，其與與結(jié)核分枝桿菌19kDa脂蛋白抗原前體LpqH (Rv3763)的質(zhì)量指紋圖譜相似。
[0080]甚至更優(yōu)選地，上述脂質(zhì)體的特征還在于存在以下結(jié)核分枝桿菌抗原的至少一種或其片段:HSP70、38kDa蛋白和Ag85B。這里的“片段”是指任何這些多肽的任何部分，例如降解產(chǎn)物。
[0081]在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑包含通?？梢?jiàn)于結(jié)核分枝桿菌中的脂質(zhì)或其衍生物，例如綴合產(chǎn)物如糖綴合脂質(zhì)。還優(yōu)選的是，包含一種或更多種分枝菌酸，優(yōu)選1、III或IV型中的任何一種或更多種。作為替代或補(bǔ)充，該制劑中可包含糖綴合的分枝菌酸酯，優(yōu)選海藻糖二分枝菌酸酯。作為替代或補(bǔ)充，還優(yōu)選的是，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑中存在至少一種MTB-C衍生糖脂，一種優(yōu)選的糖脂是脂阿拉伯甘露聚糖。
[0082]上述脂質(zhì)體制劑還可包含一種或更多種表面活性劑，其優(yōu)選來(lái)自非離子型表面活性劑組。
[0083]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，前述任一權(quán)利要求的脂質(zhì)體制劑還包含一種或更多種鹽或其溶液，其中優(yōu)選的鹽是氯化鈉。
[0084]在任何上述實(shí)施方案的一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑是凍干的。
[0085]本發(fā)明還提供懸液，其中任一前述權(quán)利要求的脂質(zhì)體制劑重構(gòu)于溶劑中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該懸液的的溶劑是含水溶劑，優(yōu)選是生理血清或者包含生理血清。
[0086]本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含上述任何一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案所述的脂質(zhì)體制劑或者上述任何一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案所述的懸液，以及可藥用載體或稀釋劑或賦形劑，其中可以施用任何適于作為載體、稀釋劑或賦形劑的物質(zhì)。在其一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該藥物組合物還包含可藥用佐劑。
[0087]本發(fā)明還提供用于治療人或動(dòng)物體的方法中的產(chǎn)品。即，提供上述任何一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的脂質(zhì)體制劑、上述任何一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的懸液或上述任何一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的藥物組合物，其用于治療人或動(dòng)物體的方法中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于注射的該脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于結(jié)核治療或預(yù)防方法中的該脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物。這些具體實(shí)施方案可以單獨(dú)或組合實(shí)現(xiàn)。
[0088]在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上文就其在人體治療方法中的用途描述的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物，其特征還在于，其用于以包含I至1000、優(yōu)選3至250、更優(yōu)選4至80、最優(yōu)選約5、約25或約50 μ g/劑FCMtb的劑量施用于人體。
[0089]在又三個(gè)具體實(shí)施方案中(a)至(C)中，上文就其在人體治療方法中的用途描述的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物是(a)用于在具有潛伏期結(jié)核感染的個(gè)體中預(yù)防活動(dòng)性結(jié)核的方法中，(b)用于結(jié)核初級(jí)預(yù)防方法中，以防止已接觸疾病單尚未感染的個(gè)體發(fā)生感染，或(C)用于治療或預(yù)防潛伏期結(jié)核的方法中。
[0090]上述脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物用于人或動(dòng)物體治療方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是其用于聯(lián)合治療或輔助治療(adjunctive therapy)中。輔助治療是與首要治療(primary treatment)結(jié)合的額外治療或第二治療,其提高治療疾病的有效性。聯(lián)合治療的一個(gè)具體實(shí)施方案是這樣的，其中所述聯(lián)合治療包含抗生素，優(yōu)選異煙肼和利福霉素中的一種或更多種，其中安沙霉素是最優(yōu)選的利福霉素。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，輔助治療適用于HIV陽(yáng)性人受試 者，優(yōu)選25 μ g FCMtb的單劑量。
[0091]本發(fā)明還提供用于制備任何所述藥劑(所述脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物)的方法。
[0092]本發(fā)明還提供2010年保藏于倫敦NCTC的MTB-C菌株NCTC13536。
[0093]發(fā)明詳沭
[0094]本發(fā)明提供脂質(zhì)體制劑，其包含來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株的片段(FCMtb)和脂質(zhì)體形成劑。
[0095]除非另外指明，否則本申請(qǐng)上下位中使用的術(shù)語(yǔ)“包含”均表示除了以“包含”引入的成員列表之外還可任選地包含其他成員。但是，作為本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，術(shù)語(yǔ)“包含”也包括不存在其他成員的可能性，即對(duì)于該實(shí)施方案而言，“包含”應(yīng)理解成具有“由……組成”的含義。
[0096]本發(fā)明詳述公開(kāi)了本發(fā)明各個(gè)特征的具體和/或優(yōu)選變化方案。作為特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明還考慮通過(guò)將針對(duì)本發(fā)明兩個(gè)或更多特征描述的兩個(gè)或更多個(gè)具體和/或優(yōu)選變化方案組合而產(chǎn)生的那些實(shí)施方案。
[0097]公認(rèn)的是,脂質(zhì)體形成(Iiposoformation)過(guò)程產(chǎn)生脂質(zhì)環(huán)境,提高溶解度并產(chǎn)生物質(zhì)(如FCMtb)的懸液。本發(fā)明意義上的脂質(zhì)體可以是單層的、多層的或其組合。
[0098]FCMtb可以是來(lái)自MTB-C菌株的任何類(lèi)型的物質(zhì)，其中來(lái)自蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)的片段是優(yōu)選的。本申請(qǐng)意義上的FCMtb通常是來(lái)自MTB-C細(xì)胞的不同蛋白質(zhì)抗原和脂質(zhì)的混合物。細(xì)胞片段可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適于破碎微生物或細(xì)菌細(xì)胞(例如特別是MTB-C細(xì)胞)的方法(如勻漿)來(lái)獲得。勻漿可通過(guò)超聲處理來(lái)進(jìn)行，或通過(guò)將直徑約0.1mm的小珠(例如二氧化硅或氧化鋯/ 二氧化硅珠)與機(jī)械勻漿機(jī)一起使用來(lái)進(jìn)行。可以使用的機(jī)械勻漿機(jī)例如BioSpec BeadBeater?型。通過(guò)這種勻漿過(guò)程破碎mtb-c細(xì)胞，從而獲得小的細(xì)胞片段，通常包括小細(xì)胞壁片段。細(xì)胞片段制造中的特別重要的特征是通過(guò)脫脂作用對(duì)細(xì)胞壁片段進(jìn)行“脫毒”，脫脂作用是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的允許除去內(nèi)毒素樣分子的方法。因此，優(yōu)選對(duì)FCMtb進(jìn)行脫毒和巴氏消毒，其后所得的脂質(zhì)體制劑是無(wú)菌并無(wú)內(nèi)毒素的。細(xì)胞片段在緩沖液中的分散體可以任選地凍干，以利于其保存。為此，將分散體分配到瓶中并在約-15°C至-120°c的溫度(例如-45°c)下以真空(例如0.1至0.5mbar)凍干。
[0099]本發(fā)明的脂質(zhì)體的尺寸分布通常為至少99.9% (以數(shù)量計(jì))小于I μ m。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，顆粒的Z-平均尺寸(通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的)為120nm或更小,優(yōu)選IlOnm,更優(yōu)選IlOnm或更小,更優(yōu)選95nm或更小,最優(yōu)選80nm或更小。在動(dòng)態(tài)光散射中，z_平均參數(shù)被認(rèn)為是可通過(guò)該技術(shù)獲得的穩(wěn)定且重要的數(shù)字，以及優(yōu)選用于質(zhì)量控制目的的尺寸數(shù)字。優(yōu)選地，本發(fā)明制劑中的脂質(zhì)體是單峰(monomodal)的，即，它們?cè)趧?dòng)態(tài)光散射測(cè)定中僅顯示一個(gè)峰。更優(yōu)選地，本發(fā)明制劑中的脂質(zhì)體是球狀的，這可通過(guò)對(duì)該脂質(zhì)體制劑的冷凍破碎制備物進(jìn)行電子顯微術(shù)來(lái)測(cè)試，如實(shí)施例9所示。由此，球狀是指對(duì)于至少90%的脂質(zhì)體顆粒(以數(shù)目計(jì))而言，各個(gè)顆粒的所有表面點(diǎn)距離脂質(zhì)體的中心都具有相似或相同的距離，即，這種顆粒的最小半徑與同一顆粒的最大半徑相比關(guān)系為0.6或更高，0.7或更高，0.8或更高或0.9或更高。本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可包含多層或單層脂質(zhì)體或其混合物。與本領(lǐng)域技術(shù)人員的標(biāo)準(zhǔn)知識(shí)一致，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量應(yīng)在合適的緩沖液(即本身不導(dǎo)致脂質(zhì)體破碎、崩解或融合以任何方式使它們顯著不穩(wěn)定的緩沖液)中進(jìn)行。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，任何緩沖液都可以是合適的，只要離子強(qiáng)度和PH值都與形成所述脂質(zhì)體的緩沖液相當(dāng)。優(yōu)選地，使用與形成所述脂質(zhì)體的緩沖液在組成上相似或相同的緩沖液。
[0100]在另一實(shí)施方案中，脂質(zhì)體制劑還包含1-20%(w/v)的蔗糖，優(yōu)選2-12%(w/v)的蔗糖，更優(yōu)選3-8%(w/v)的鹿糖 ,最優(yōu)選4-6%(w/v)的鹿糖。約5%的鹿糖是特別優(yōu)選的。
[0101]重要的是要注意，盡管這些實(shí)施方案(一個(gè)涉及具體的顆粒尺寸，另一個(gè)涉及蔗糖的存在情況)的每一個(gè)都可以獨(dú)立實(shí)現(xiàn)，但這些實(shí)施方案不視為互斥的，而是完全可以組
口 O
[0102]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑的Z-平均顆粒尺寸為40_120nm，優(yōu)選50-1 IOnm,更優(yōu)選55_95nm,最優(yōu)選55_80nm。z_平均顆粒尺寸優(yōu)選通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定,如上文的一般描述和下文“材料和方法”章節(jié)中的詳細(xì)描述。
[0103]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑的Z-平均顆粒尺寸可以更小，使得該脂質(zhì)體制劑為乳劑，即，該具體實(shí)施方案中顆粒的Z-平均尺寸優(yōu)選小于40nm。
[0104]在上述實(shí)施方案中任何一種或更多種的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明制劑中的脂質(zhì)體還是單分散的，這意味著觀(guān)察不到顯著的尺寸分布寬度。這在技術(shù)上通過(guò)以動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的低多分散性指數(shù)(PDI)來(lái)測(cè)試，如0.4或更小，優(yōu)選0.3或更小。因此，所述脂質(zhì)體制劑是這樣的脂質(zhì)體制劑，其中通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的顆粒多分散性指數(shù)為0.4或更小，優(yōu)選0.3或更小，最優(yōu)選0.25或更小。[0105]來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株的片段可通過(guò)包含上游方法和下游方法的方法獲得。出于舉例目的，本文簡(jiǎn)要描述了五個(gè)主要步驟，實(shí)施該方法的具體模式在下文實(shí)施例2和3給出。
[0106]上游方法(實(shí)施例2):
[0107]步驟1:培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，
[0108]步驟2:收獲結(jié)核分枝桿菌并冷凍粗提取物。
[0109]下游方法(實(shí)施例3):
[0110]步驟3:細(xì)胞破碎和脫脂，
[0111]步驟4:巴氏消毒，
[0112]步驟5:凍干(任選的)。
[0113]在任何上述實(shí)施方案的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株是有毒力的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株。毒力是指致病性和/或桿菌侵入宿主組織的能力。所述有毒力菌株可以是屬于MTB-C物種的任何有毒力菌株，但屬于結(jié)核分枝桿菌的菌株是優(yōu)選的。本發(fā)明的MTB-C菌株可通過(guò)接種在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基(如Middlebrook7H10或7H11瓊脂、Sauton’ s培養(yǎng)基或Proskauer-Beck培養(yǎng)基)中來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。所述有毒力菌株的培養(yǎng)優(yōu)選在長(zhǎng)時(shí)間中進(jìn)行，例如等于或大于3周的時(shí)間，優(yōu)選3周至4周。培養(yǎng)溫度優(yōu)選維持在34°C至38°C。培養(yǎng)結(jié)束后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)(如專(zhuān)利申請(qǐng)ES2231037-A1中描述的那些)收獲和分離細(xì)胞。
[0114]脂質(zhì)體制劑中的脂質(zhì)體劑優(yōu)選是氫化的、部分氫化的或非氫化的磷脂。所用磷脂可以是(或包含)例如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲`氨酸和磷脂酰肌醇。最典型的是磷脂酰膽堿，它可以是合成的或分離自多種天然來(lái)源。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體形成劑是(或包含)卵磷脂(lecithin),其選自蛋卵磷脂(egg lecithin)和大豆卵磷脂(soy lecithin)。大豆卵磷脂是磷脂(尤其是包括磷脂酰膽堿)的混合物，并且是特別優(yōu)選的。還可包含在所述制劑中(作為脂質(zhì)體形成劑本身或者作為其他組分)的典型脂質(zhì)是磷酸二鯨蠟酯(DCP)、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(DMPG)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPc)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰絲氨酸(DOPS)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、磷脂酰膽堿(PC)和/或磷脂酰絲氨酸(PS)，其中每種脂質(zhì)可以是氫化的，部分氫化的或者非氫化的。所述脂質(zhì)體可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的輔助脂質(zhì)(auxiliary lipids)和技術(shù)(如專(zhuān)利申請(qǐng)ES2231037-A1中所述)形成。
[0115]還優(yōu)選的是，在任何上述實(shí)施方案中，(a)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株的片段與(b)脂質(zhì)體形成劑的比值為0.01:1至1:1，優(yōu)選0.06:1至0.1:1。
[0116]在任何上述實(shí)施方案的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑還包含:(d)表面活性物質(zhì)。通常，所有類(lèi)型的能夠改變表面張力值的試劑都可用作本發(fā)明意義上的表面活性物質(zhì)，但要排除的是落入上文給出的脂質(zhì)體形成劑定義之中的化合物。有多種類(lèi)型的表面活性物質(zhì)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并可用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，表面活性物質(zhì)通常是具有極性-非極性結(jié)構(gòu)的化合物。不希望受限于任何特定理論，表面活性物質(zhì)通常具有定位于顆粒表面的傾向，由此在界面上產(chǎn)生降低表面張力值的單分子層。在含有表面活性劑的脂質(zhì)體制劑的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，表面活性物質(zhì)選自固醇及其衍生物，例如膽固醇，和或膽汁鹽(biIe salt),例如膽酸鹽(cholate)。特別優(yōu)選的實(shí)施方案是其中表面活性物質(zhì)選自膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、膽固醇和膽固醇琥珀酸單酯。實(shí)施本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)良(但非限制性)的模式是其中制劑的脂質(zhì)體同時(shí)包含大豆衍生的卵磷脂和膽酸鈉。
[0117]在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含(d)表面活性物質(zhì)的脂質(zhì)體制劑是這樣的脂質(zhì)體制劑，其中(a)與(d)之間的比值為0.05:1至3:5(?/?)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，可以使用多種類(lèi)型的脂質(zhì)體形成劑。
[0118]脂質(zhì)體可任選地含有提高其穩(wěn)定性的添加劑，例如維生素E，其據(jù)信發(fā)揮脂質(zhì)體抗氧化劑作用。
[0119]在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑是這樣的脂質(zhì)體制劑，其中MTB-C細(xì)胞的片段是(或包括)細(xì)胞壁片段。 [0120]可以使用任何屬于MTBC的菌株,優(yōu)選任何屬于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的菌株。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑包含2010年保藏于倫敦NCTC的MTB-C菌株NCTC13536的片段(實(shí)施例1)。另一個(gè)可以使用(因此在脂質(zhì)體制劑中包含其片段)的菌株稱(chēng)為H37Rv，其可得自例如英國(guó)倫敦國(guó)家典型培養(yǎng)物中心(NCTC)(保藏號(hào)NC007416)，并且經(jīng)常為本領(lǐng)域研究者使用。還可以使用多于一種菌株，即，脂質(zhì)體制劑包含多種(例如兩種、三種或多于三種)菌株的片段。
[0121]考慮到結(jié)核分枝桿菌包含約4000種推定抗原，針對(duì)全部這些蛋白來(lái)分析藥物物質(zhì)是不可能的。盡管如此，某些MTB-C蛋白已經(jīng)顯示出與期望的免疫應(yīng)答相關(guān)。它們是近似大小為6、10、30、38和70kDa的五個(gè)蛋白質(zhì)條帶(Renshaw, et al.，2005，EMBOJournal24, 2491-2498;Singh, et al., 2005, Clin.Diagn.Lab.Tmmunol.12(2), 354-358)。因此，在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑包含以下的至少兩項(xiàng)，優(yōu)選三項(xiàng)，更優(yōu)選四項(xiàng)，最優(yōu)選全部:
[0122](i)第一多肽，其在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量的分子量為約70kDa,其中所述第一多肽的質(zhì)量指紋圖譜(massfingerprint)與結(jié)核分枝桿菌HSP70蛋白(Rv0350)的質(zhì)量指紋圖譜相似，
[0123](ii)第二多肽，其在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量的分子量為約38kDa，其中所述第二多肽的質(zhì)量指紋圖譜與結(jié)核分枝桿菌38kDa蛋白(Rv0934)的質(zhì)量指紋圖譜相似，
[0124](iii)第三多肽，其在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量的分子量為約30kDa，其中所述第三多肽的質(zhì)量指紋圖譜與結(jié)核分枝桿菌Ag85B蛋白(Rvl866c)的質(zhì)量指紋圖譜相似，和
[0125](iv)第四多肽，其在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量的分子量為約IOkDa,其中所述第四多肽的質(zhì)量指紋圖譜與結(jié)核分枝桿菌CFPlO蛋白(Rv3874)的質(zhì)量指紋圖譜相似，和
[0126](V)第五多肽，其在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量的分子量為約6kDa，其中所述第五多肽的質(zhì)量指紋圖譜與結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白(Rv3875)的質(zhì)量指紋圖譜相似。
[0127]在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑還包含分子量(在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量)約19kDa的脂多肽，其中所述脂多肽與結(jié)核分枝桿菌19kDa脂蛋白抗原前體LpqH (Rv3763)的質(zhì)量指紋圖譜相似。相應(yīng)條帶可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法(如銀染)來(lái)顯現(xiàn)。本發(fā)明的研究者意想不到地發(fā)現(xiàn)，該多肽誘導(dǎo)高全I(xiàn)gG體液應(yīng)答，其可以是制劑的全部抗原中最高的體液應(yīng)答。
[0128]如何鑒定多肽或脂多肽的實(shí)例在實(shí)施例4中給出。
[0129]甚至更優(yōu)選地，上述脂質(zhì)體制劑的特征還在于存在以下結(jié)核分枝桿菌抗原的至少一種或其片段:HSP70、38kDa蛋白和Ag85B，最優(yōu)選HSP70、38kDa和Ag85B中至少之一。這里的“片段”是指任何這些多肽的任何部分，例如降解產(chǎn)物?？梢允褂枚喾N方法獲得這些片段，例如化學(xué)或酶水解，由此，破碎是否有意發(fā)生、在脂質(zhì)體形成之前或之后發(fā)生并不重要。優(yōu)選的是，相應(yīng)片段可以歸因于其相應(yīng)來(lái)源，例如由于氨基酸序列顯著重疊，例如至少5、至少10、至少20個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0130]本發(fā)明的片段優(yōu)選得自在饑餓、低氧和低pH脅迫條件下培養(yǎng)的桿菌。低氧是由于在培養(yǎng)期(例如21天)中密封在氣密袋中的平板上細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致微氧環(huán)境。低pH的解釋如下:培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)PH值為7.0-6.8，結(jié)束時(shí)(通常在培養(yǎng)21天后)，pH值為6.4-6.5。在這些條件下，細(xì)菌的代謝較慢，導(dǎo)致穩(wěn)定生長(zhǎng)。應(yīng)該理解，這使得桿菌對(duì)脅迫的抗性更高。在這些條件下，培養(yǎng)的桿菌產(chǎn)生與LTBI (潛伏期結(jié)核感染)中體內(nèi)潛伏期桿菌相似的特征。因此，預(yù)計(jì)FCMtb中存在的抗原會(huì)觸發(fā)針對(duì)潛伏期桿菌之抗原(所謂的“結(jié)構(gòu)”抗原)以及脅迫應(yīng)答相關(guān)的抗原的新免疫應(yīng)答。
[0131]分枝桿菌糖脂長(zhǎng)期以來(lái)就被認(rèn)為具有免疫調(diào)節(jié)活性，特別是誘導(dǎo)肉芽腫應(yīng)答和發(fā)揮強(qiáng)佐劑樣效應(yīng)。因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑包含通?？梢?jiàn)于結(jié)核分枝桿菌中的脂質(zhì)或其衍生物，例如綴合脂質(zhì)如糖綴合脂質(zhì)。已經(jīng)在結(jié)核分枝桿菌樣品中鑒定出一些免疫原性脂質(zhì)組分(Brennan, Tuberculosis (Edinburgh), 2003, 83 (1-3), 91-97)，并開(kāi)發(fā)了用于其測(cè)定的分析方法(電泳、SDS-PAGE、薄層層析)。盡管每種脂質(zhì)組分的分離將需要如此激進(jìn)的處理以致于很難獲得MTB-C提取物或脂質(zhì)體制劑中每種可檢測(cè)組分的定量數(shù)據(jù)或百分比，但定量表征將用于表征本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方案。根據(jù)這一優(yōu)選實(shí)施方案，包含一種或更多種分枝菌酸，優(yōu)選屬于1、III或IV型中的任何一種或更多種。作為替代或補(bǔ)充，制劑中可包含糖綴合分枝菌酸酯，優(yōu)選海藻糖二分枝菌酸酯。作為替代或補(bǔ)充，制劑中可包含脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)這種糖脂。此外，相信所述片段的多抗原性性質(zhì)(多抗原性蛋白質(zhì)混合物加脂質(zhì)，而不是僅有純化的抗原)是有利的，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠改動(dòng)細(xì)胞破碎過(guò)程以允許獲得最佳細(xì)胞抗原混合物。
[0132]MTB-C細(xì)胞的勻漿在一種或更多種表面活性劑(優(yōu)選非離子型表面活性劑)存在下進(jìn)行。因此，上述脂質(zhì)體制劑還可包含一種或更多種這些表面活性劑。大量這種表面活性劑在本領(lǐng)域技術(shù)人員的標(biāo)準(zhǔn)知識(shí)中。優(yōu)選地，所用的非離子型表面活性劑選自乙氧基化烷基酚和乙氧基化山梨糖醇酯。更優(yōu)選地，所述非離子型表面活性劑選自乙氧基化辛基酚。甚至更優(yōu)選地，使用具有包含7至8摩爾環(huán)氧乙烷含量的乙氧基辛基酚，該表面活性劑以Triton X-114?這一名稱(chēng)銷(xiāo)售。對(duì)含有細(xì)胞壁片段的勻漿物進(jìn)行常規(guī)處理以分離并移除未破碎細(xì)胞和溶解組分。ES223 1037-A1描述了例如可以使用不同速度的離心和用緩沖液進(jìn)行的洗滌。進(jìn)行上述純化過(guò)程后獲得含有細(xì)胞壁片段的沉淀。將所述沉淀分散在磷酸鹽緩沖液(PBS)中并進(jìn)行常規(guī)處理，以確保在破碎和純化過(guò)程后可能仍保留活力的MTB-C細(xì)胞完全失活。所述處理可以是化學(xué)處理，例如用甲醛處理，或者是物理處理，例如高壓滅菌或巴氏消毒處理。下文實(shí)施例5給出了脂質(zhì)表征的實(shí)例。
[0133]在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，上述脂質(zhì)體制劑還包含一種或多種鹽或其溶液，其中優(yōu)選的鹽是氯化鈉。
[0134]在任何上述實(shí)施方案的一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑是凍干的?？梢詫?duì)所述脂質(zhì)體進(jìn)行凍干以由此獲得凍干脂質(zhì)體形式的免疫治療劑。為此，可將分散體分配到瓶中并在低溫(如約_15°C至_120°C的溫度，例如_45°C)下以真空(例如0.1至0.5mbar)凍干。凍干后得到的瓶中含有適于作為免疫治療劑的脂質(zhì)體制劑，它們優(yōu)選保存在極低的溫度下，例如_70°C。
[0135]本發(fā)明還提供懸液，其中任一前述權(quán)利要求的脂質(zhì)體制劑重構(gòu)在溶劑中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該懸液的溶劑是含水溶劑，更優(yōu)選并且最優(yōu)選是(或包含)生理血清。將脂質(zhì)體制劑懸浮在溶劑中的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明制劑的一個(gè)特別有利的特性是，其能夠比包含MTB-C片段的常規(guī)脂質(zhì)體制劑更快地懸浮(見(jiàn)實(shí)施例9)。
[0136]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于制備藥物組合物的包含MTB-C菌株細(xì)胞壁片段的藥劑，其中所述藥劑是(或包含)上文任何所述實(shí)施方案中所述的脂質(zhì)體制劑或其組合。藥物物質(zhì)的藥物制劑/蓋倫制劑(galenic formulation)的主要范圍是獲得懸液,其有效性和穩(wěn)定性足以被細(xì)胞充分識(shí)別，并具有在人或動(dòng)物體中觸發(fā)相關(guān)細(xì)胞免疫應(yīng)答的潛力。為此，本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含上述任何一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案中描述的脂質(zhì)體制劑或懸液，以及可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。多種這樣的載體、賦形劑和稀釋劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，它們絕不受限于本公開(kāi)內(nèi)容。相反，任何適于作為載體、賦形劑或稀釋劑的物質(zhì)均可使用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該藥物組合物還包含可藥用佐劑。由此，佐劑應(yīng)理解為本發(fā)明該實(shí)施方案中包含的一種物質(zhì)，其中所述佐劑是能夠在適用于人或動(dòng)物體時(shí)刺激免疫系統(tǒng)應(yīng)答于靶抗原的物質(zhì)，其中所述佐劑本身不賦予免疫力。不限于任何具體的佐劑物質(zhì)，優(yōu)選的實(shí)施方案是其中佐劑是鋁鹽例如氯化鋁，或者礦物油或含有礦物油的組合物例如弗氏不完全佐劑(IFA)或弗氏完全佐劑(CFA)，或者鹵化銨如溴化烷基銨，例如溴化二甲基雙十八烷基銨。
[0137]本發(fā)明還提供用于人或動(dòng)物體治療方法的產(chǎn)品。即，提供用于人或動(dòng)物體治療方法的任何上述一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的脂質(zhì)體制劑、任何所述一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的懸液或任何上述一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的藥物組合物。
[0138]所述藥物可在粘膜中施用，例如眼、鼻內(nèi)、口、胃、腸、陰道或尿道的粘膜，或者腸胃外施用，例如皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。優(yōu)選腸胃外施用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于注射的該脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物。
[0139]在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于結(jié)核治療或預(yù)防方法中的該脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物。這些具體實(shí)施方案可以單獨(dú)或組合實(shí)現(xiàn)。本研究的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的制劑導(dǎo)致提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，還控制常見(jiàn)的再感染過(guò)程(否則這可在潛伏期結(jié)核感染中發(fā)生)，這是通過(guò)加強(qiáng)針對(duì)生長(zhǎng)中桿菌的免疫力和誘導(dǎo)針對(duì)非復(fù)制桿菌的免疫力來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
[0140]上文就其在人或動(dòng)物體治療方法中的用途描述的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物的合適劑量取決于若干參數(shù)，包括施用方法和受治者。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，其用于對(duì)人體施用。在其一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這以I至1000、優(yōu)選3至250、更優(yōu)選4至80、最優(yōu)選約5、約25或約50 μ g/劑FCMtb的劑量實(shí)現(xiàn)。特別優(yōu)選25 μ g的劑量。
[0141]在又三個(gè)具體實(shí)施方案中(a)至(C)中，上文就其在人或動(dòng)物體治療方法中的用途描述的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物是(a)用于在具有潛伏期結(jié)核感染的個(gè)體中預(yù)防活動(dòng)性結(jié)核的方法中。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，(b)用于結(jié)核初級(jí)預(yù)防方法中，以防止已接觸疾病單尚未感染的個(gè)體發(fā)生感染，或(C)用于治療或預(yù)防潛伏期結(jié)核的方法中。
[0142]用于人或動(dòng)物體治療方法中的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物可以單劑量形式施用，或者同以某時(shí)間間隔重復(fù)而以多劑量(如2、3、4、5或多于5)施用。優(yōu)選地，以2至5周(優(yōu)選3至4周)的間隔分開(kāi)使用兩劑。
[0143]實(shí)施例8、10和12是怎樣將本發(fā)明脂質(zhì)體制劑施用于人或動(dòng)物受試者的實(shí)例。
[0144]上述物質(zhì)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是用于聯(lián)合治療或輔助治療的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物。醫(yī)學(xué)從業(yè)者經(jīng)常使用輔助治療以獲得更好的治愈率或針對(duì)首要治療更快的應(yīng)答。聯(lián)合治療或輔助治療包括使用多于一種藥物來(lái)治療人或動(dòng)物體。聯(lián)合治療的第一個(gè)具體實(shí)施方案是其中所述聯(lián)合治療包含抗生素，優(yōu)選異煙肼和安沙霉素，其中所述安沙霉素最優(yōu)選是利福霉素。其第二個(gè)具體實(shí)施方案是其中所述聯(lián)合治療包含其他針對(duì)結(jié)核的預(yù)防性疫苗，例如 S.H.E.Kaufmann, Nature Rev.Tmmunol., 2006, 6, 699-704 頁(yè)中提到的那些,例如卡介苗(BCG)疫苗、亞單位疫苗或重組BCG疫苗。第一個(gè)和第二個(gè)具體實(shí)施方案可以組
八 [0145]在聯(lián)合治療或輔助治療中，這兩種(或更多種)物質(zhì)的施用可以是同時(shí)的，或者可以以在時(shí)間上分開(kāi)的兩次(或更多次)接種中完成。接種之間的時(shí)間甚至可以是若干年。在聯(lián)合治療的情況中，接種在時(shí)間上分開(kāi)進(jìn)行，首先優(yōu)選施用針對(duì)結(jié)核的預(yù)防性疫苗，隨后施用包含有毒力MTB-C菌株之細(xì)胞壁片段的藥物，其作為先接種疫苗的再刺激劑(加強(qiáng)劑)。在一個(gè)實(shí)施方案中，僅對(duì)人受試者施用單劑量，該劑量?jī)?yōu)選為25 μ g FCMtb。
[0146]或者，在輔助治療中同時(shí)使用若干不同治療策略或處置類(lèi)型。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，將輔助治療施用于免疫系統(tǒng)受損的人受試者(例如患HIV的個(gè)體),或者任何由于其他原因而易于感染結(jié)核和/或需要這種治療的個(gè)體。輔助治療中也可以施用異煙肼。此外，輔助治療可包括施用治療受損免疫系統(tǒng)(例如治療HIV感染)的任何藥物或藥物組合。治療HIV感染的典型藥物是抗病毒藥,其非限制性綜述可見(jiàn)于“Antiretroviraltherapy for HIV infection in adults and adolescents Recommendations for apublic health approach:2010 年版”，作者:World Health Organization, ISBN:9789241599764。
[0147]因此，本發(fā)明人為向HIV陽(yáng)性人受試者提供有效結(jié)核保護(hù)(如疫苗接種)的需求提供了解決方案。
[0148]可以通過(guò)允許檢測(cè)待測(cè)個(gè)體體液中人免疫缺陷病毒(HIV)——導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的病毒一存在情況的任何測(cè)試來(lái)測(cè)試個(gè)體是被認(rèn)為HIV陽(yáng)性或否(SPHIV陰性)，其中體液通常是選自血清、唾液或尿中的任何一種。這種測(cè)試可檢測(cè)抗體、抗原或 RNA。合適的篩查測(cè)試的概況在 Chou et al., Ann.1ntern.Med.2005Jul5; 143 (I): 55-73中給出。
[0149]本發(fā)明的發(fā)明人意想不到地發(fā)現(xiàn)，對(duì)HIV陽(yáng)性人受試者施用的25 μ gFCMtb單劑量提供了強(qiáng)應(yīng)答。[0150]25 μ g FCMtb單劑量在施用于HIV陰性人受試者時(shí)也是強(qiáng)有力的。本發(fā)明人顯示，這在患有潛伏期結(jié)核的受試者中特別有用(實(shí)施例12)。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是要向HIV陽(yáng)性或HIV陰性個(gè)體施用的25 μ g FCMtb單劑量。
[0151]本發(fā)明還提供制造方法，其特征在于，該方法適于獲得任何上述一個(gè)或更多個(gè)實(shí)施方案的脂質(zhì)體制劑以及懸液和包含它們的藥物組合物。一個(gè)非限制性實(shí)例在下文實(shí)施例11中給出。
[0152]本發(fā)明還提供2010年保藏于倫敦NCTC的MTB-C菌株NCTC13536。該菌株具有低遺傳多態(tài)性。因此，包含NCTC13536之片段的制劑由于這種低遺傳多態(tài)性而具有可重復(fù)性極聞的優(yōu)點(diǎn)。
[0153]實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選模式
[0154]優(yōu)選的是，使用50 μ g FCMtb/劑或25 μ g FCMtb/劑或5 μ g FCMtb/劑的具體劑量。例如，劑量為50 μ g FCMtb時(shí)，在一瓶制劑中存在表1中給出的量/物質(zhì):
[0155]
【權(quán)利要求】
1.脂質(zhì)體制劑，其包含: (a)來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株的片段， (b)脂質(zhì)體形成劑， I至20% (w/v)的鹿糖,優(yōu)選2至12% (w/v)的鹿糖,更優(yōu)選3至8% (w/v)的鹿糖,最優(yōu)選4至6% (w/v)的鹿糖,其中顆粒的Z-平均尺寸為120nm或更小。
2.權(quán)利要求1的脂質(zhì)體制劑，其中所述顆粒的Z-平均尺寸為40至llOnm，更優(yōu)選55至 95nm。
3.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其中所述脂質(zhì)體制劑為乳劑，并且其中顆粒的Z-平均尺寸優(yōu)選小于40nm。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其中顆粒的多分散性指數(shù)為0.4或更小，優(yōu)選 0.3。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其中所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株是有毒力的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB-C)菌株，優(yōu)選為2010年保藏于倫敦NCTC的MTB-C菌株 NCTC13536。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其還包含 Cd)表面活性物質(zhì)， 和/或 Ce) 一種或更多種非離子型表面活性劑。`
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其中所述MTB-C細(xì)胞的片段是細(xì)胞壁片段或者包含細(xì)胞壁片段。
8.權(quán)利要求6的脂質(zhì)體制劑，其中(a)與(d)的比值為0.05:1至l:5(w/w)。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其中所述脂質(zhì)體形成劑是氫化的、部分氫化的或非氫化的磷脂，優(yōu)選卵磷脂，最優(yōu)選大豆卵磷脂。
10.權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其中所述表面活性物質(zhì)選自膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、膽固醇和膽固醇琥珀酸單酯。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其中所述MTB-C細(xì)胞的片段是細(xì)胞壁片段或者包含細(xì)胞壁片段。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其包含2010年保藏于倫敦NCTC的MTB-C菌株NCTC13536的片段。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其包含以下的至少兩項(xiàng)，優(yōu)選三項(xiàng)，更優(yōu)選四項(xiàng)，最優(yōu)選全部: (i)第一多肽，其在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量的分子量為約70kDa，其中所述第一多肽的質(zhì)量指紋圖譜與結(jié)核分枝桿菌HSP70蛋白(Rv0350)的質(zhì)量指紋圖譜相似， (ii)第二多肽，其在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量的分子量為約38kDa，其中所述第二多肽的質(zhì)量指紋圖譜與結(jié)核分枝桿菌38kDa蛋白(Rv0934)的質(zhì)量指紋圖譜相似， (iii)第三多肽，其在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量的分子量為約30kDa，其中所述第三多肽的質(zhì)量指紋圖譜與結(jié)核分枝桿菌Ag85B蛋白(Rvl866c)的質(zhì)量指紋圖譜相似，和 (iv)第四多肽，其在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量的分子量為約IOkDa,其中所述第四多肽的質(zhì)量指紋圖譜與結(jié)核分枝桿菌CFPlO蛋白(Rv3874)的質(zhì)量指紋圖譜相似，和 (i)第五多肽，其在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后測(cè)量的分子量為約6kDa，其中所述第五多肽的質(zhì)量指紋圖譜與結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白(Rv3875)的質(zhì)量指紋圖譜相似。
14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其中存在以下結(jié)核分枝桿菌抗原的至少一種或其片段:HSP70、38kDa蛋白和Ag85B。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其包含一種或更多種分枝菌酸和/或糖綴合分枝菌酸酯優(yōu)選海藻糖二分枝菌酸酯，和/或糖脂優(yōu)選脂阿拉伯甘露聚糖。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其還包含一種或更多種非離子型表面活性劑。
17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其還包含一種或更多種鹽或其溶液，其中所述鹽優(yōu)選為氯化鈉。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑，其中所述脂質(zhì)體制劑是凍干的。
19.懸液，其中前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑重構(gòu)于溶劑中，其中所述溶劑優(yōu)選為含水溶劑，更優(yōu)選為生理血清或包含生理血清。
20.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的制劑或權(quán)利要求19的懸液，以及可藥用載體或稀釋劑，和/或可藥用佐劑。
21.權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑、權(quán)利要求19的懸液或權(quán)利要求20的藥物組合物，其用于治療人或動(dòng)物體的方法中。
22.權(quán)利要求21的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物，其用于治療或預(yù)防結(jié)核的方法中。
23.權(quán)利要求22的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物，其選自以下: a)用于在具有潛伏期結(jié)核感染的個(gè)體中預(yù)防活動(dòng)性結(jié)核的方法中； b)用于結(jié)核的初級(jí)預(yù)防方法中，以防止接觸過(guò)該疾病但尚未感染的個(gè)體發(fā)生感染，或 c)用于治療或預(yù)防潛伏期結(jié)核的方法中。
24.權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物，其用于以包含I至1000、優(yōu)選3至250、更優(yōu)選4至80、最優(yōu)選約5、約25或約50 μ g/劑FCMtb的劑量施用于人體。
25.權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物，其用于以25μ gFCMtb的單次接種劑量施用于人體。
26.權(quán)利要求21至25中任一項(xiàng)的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物，其用于聯(lián)合治療中，所述聯(lián)合治療優(yōu)選包含抗生素，更優(yōu)選異煙肼和安沙霉素中的一種或更多種，其中所述安沙霉素最優(yōu)選是利福霉素。
27.權(quán)利要求125的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物，其用于輔助治療中。
28.權(quán)利要求27的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物，其用于在輔助治療中施用于HIV陽(yáng)性人受試者。
29.權(quán)利要求25的脂質(zhì)體制劑、懸液或藥物組合物，其用于施用于HIV陰性人受試者。
【文檔編號(hào)】A61K31/06GK103796640SQ201280011787
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月4日
【發(fā)明者】佩爾·喬娜·卡唐娜·伊杰勒塞斯, 伊莎貝爾·艾瑪特·里拉, 布蘭卡·雷耶斯, 艾瑞德納·瑟格, 梅爾斯·艾瑪特 申請(qǐng)人:阿爾西維爾法爾瑪公司