自身凝膠化核酸的制作方法
【專利摘要】本申請發(fā)明旨在提供制備基本上僅由核酸構(gòu)成的水凝膠的方法。本申請發(fā)明提供由選自一部分互相互補的，與核酸、核酸衍生物、修飾型核酸、核酸互補地結(jié)合的化合物、及它們的混合物的2個以上的核酸單體構(gòu)成，一個核酸單體含構(gòu)成粘性突出末端的部分、可與1個以上的別的核酸單體形成雙鏈的互補性堿基序列部，并且不含有核酸連結(jié)酶的，用于不使用核酸連結(jié)酶制成核酸凝膠的核酸溶膠狀組合物及使用其制成的核酸凝膠。
【專利說明】自身凝膠化核酸
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及自身凝膠化核酸。具體而言，本發(fā)明涉及不使用連接酶等的核酸連結(jié)酶，制備基本上僅由核酸組成的水凝膠的方法。
【背景技木】
[0002]核酸、特別是，使用DNA制備凝膠的嘗試已經(jīng)有報告(非專利文獻I)。在非專利文獻I中公開的方法中，將DNA單體的末端使用DNA連接酶共有結(jié)合。更具體而言，在非專利文獻I中，合成具有與末端互補的序列的各DNA鏈，使用T4連接酶制備X型DNA、Y型DNA、T型DNA，及使用這些DNA制備水凝膠已有報告。但是，在使用非專利文獻I中公開的DNA制備的凝膠中，由于凝膠化中使用的酶(DNA連接酶)殘留，安全性及抗原性成為問題。
[0003]另外，在非專利文獻I中公開的方法中，由于凝膠化中酶反應(yīng)是必要的，從而在向活體施用凝膠之時，不得不預(yù)先在活體外制備凝膠，以得到的凝膠的形狀施用，施用上、這成為大的限制。再者，對比文件I中公開的凝膠化反應(yīng)由于是使用酶的反應(yīng)，為了將比較大的物質(zhì)封入凝膠之中，有在凝膠化、即連接反應(yīng)時加封入物質(zhì)的必要，而這損害封入物質(zhì)的功能的危險性高。另外，在使用連接酶制備的凝膠中，得不到充分高度的粘弾性。
[0004]此外，制成以DNA作為構(gòu)成要素的水凝膠的嘗試也多，有化學(xué)交聯(lián)或熱*pH依賴性等多的報告(非專利文獻2、3及專利文獻I)。
[0005]例如，在非專利文獻2中報告，將從鮭魚精巢提取的DNA化學(xué)(通過使用乙二醇二縮水甘油基醚)交聯(lián)之后，添加IM NaOH和TEMED，加熱(50°C ) 2小時左右而制成凝膠。但是，在涉及的方法中，除核酸外，由于使用對活體的安全性受到質(zhì)疑的有機化合物，從而向活體的施用其安全性受到在疑。再者，由于在凝膠化中加熱是必要的，無法含有易變性的物質(zhì)。
[0006]另外,非專利文獻3涉及pH依賴性的Y型DNA制備。涉及的方法利用依賴于pH變化的，DNA分子的狀態(tài)的變化。在此方法中，可向DNA溶液添加HCl而使成為酸性來凝膠化，一旦凝膠化的則也可通過添加NaOH使其回到溶液的狀態(tài)。但是，為了維持凝膠狀態(tài)，不得不便環(huán)境維持在酸性，從而有凝膠對周圍的環(huán)境不穩(wěn)定的問題。
[0007]專利文獻1公開了提供不伴隨化學(xué)反應(yīng)或聚合反應(yīng)，在人的體溫(37°C)附近，在生理的條件下簡便、迅速地得到充分的強度的水凝膠的合成水凝膠的方法。但是，由該方法得到的凝膠由于是將多糖類等的水溶性高分子與核酸混合而制成的水凝膠，溫度依賴性地凝膠-溶膠轉(zhuǎn)移是可能的，但由于大量地含多糖類等，很難說是由核酸組成的水凝膠。
[0008]另ー方面，利用明膠或合成聚合物等開發(fā)了各種各樣的水凝膠制劑。由這些制備的凝膠的情況也是施用前凝膠化，施用后，凝膠化的系統(tǒng)少。注射可能的凝膠也有報告，但這是通過注射針的亞微米~微米尺寸的凝膠。從而，在通過注射等的施用的情況中，使用微細化的凝膠，在此時緩慢釋放化等的凝膠特性被大幅地損害。
[0009]另外，多處報告了利用由溫度的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)移的水凝膠(專利文獻2等)。但是，使用的化合物利用一部分化學(xué)修飾，不是由核酸等的純粹的天然原料構(gòu)成的凝膠。[0010]再有，進行多個以CpG DNA作為佐劑的嘗試。也報告了由膽甾醇修飾或硫代化的活化能的增強。但是，在這時，佐劑(CpG DNA)和抗原即使同時施用，在活體內(nèi)的行為也被懷疑是獨立的。另外，在硫代型DNA的情況中，由高的蛋白結(jié)合性的組織障礙是問題。
[0011]【現(xiàn)有技術(shù)文獻】
[0012]【專利文獻】
[0013]專利文獻1:特開2002-18270號公報
[0014]專利文獻2:特開2005-239860號公報
[0015]【非專利文獻】
[0016]非專利文獻1:Nat.Mater.5:797-801, 2006
[0017]非專利文獻2: J Phys Chem B.2007Sep20 ；111 (37): 10886-96
[0018]非專利文獻3:Angew Chem Int Ed Engl.2009 ；48 (41):7660-3
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0019]【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】
[0020]使水凝膠等的生理活性物質(zhì)緩慢釋放化的受控的釋放系統(tǒng)對于得到持續(xù)的的治療效果或副作用的減輕有效。本發(fā)明的目的是提供通過以DNA或RNA的核酸単體作為基本単位，制備各種結(jié)構(gòu)的核酸単位，將其不使用DNA連接酶等的酶連接來制備基本上僅由核酸構(gòu)成，并且，比使用連接酶的凝膠粘彈性高的水凝膠的方法。
[0021]【解決課題的技術(shù)方案】
[0022]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)鹽濃度和核酸濃度一核酸單位中的突出末端的堿基數(shù)，可提供基本上僅由核酸構(gòu)成的粘弾性高的水凝膠。即，由本發(fā)明提供不使用連接酶等的酶而制備基本上僅由核酸構(gòu)成的粘彈性高的水凝膠的方法。
[0023]以往的方法取將在末端結(jié)合磷酸基的寡核苷酸用DNA連接酶結(jié)合的方法。對此，在本發(fā)明的方法中，通過調(diào)節(jié)突出末端的堿基數(shù)或鹽濃度、核酸濃度等，可無需酶反應(yīng)而制備水凝膠。由本發(fā)明的方法，不僅不使用酶，不利用熱或pH變化等，所以可在溶膠狀態(tài)下施用，施用后可在活體內(nèi)凝膠化。另外，通過設(shè)計多種核酸単體，可通過混合構(gòu)建凝膠化的系統(tǒng)。此時，在凝膠化中由于不需要酶或熱等，化學(xué)一物理不穩(wěn)定的物質(zhì)的內(nèi)包也可能。
[0024]即，本發(fā)明，在第一實施方式中，提供以下技術(shù)方案:
[0025](1-1):用于不使用核酸連結(jié)酶制成核酸凝膠的核酸溶膠狀組合物，其由選自一部分互相互補的，與核酸、核酸衍生物、修飾型核酸、核酸互補地結(jié)合的化合物、及它們的混合物的2個以上的核酸單體構(gòu)成，ー個核酸單體含構(gòu)成粘性突出末端的部分、可與1個以上的別的核酸単體形成雙鏈的互補性堿基序列部，并且不含有核酸連結(jié)酶。 [0026](1-2):(1-1)所述的溶膠狀組合物，其用于在活體內(nèi)制成凝膠。
[0027](1-3):(1-1)或(1-2)記載的溶膠狀組合物，其中核酸單體包括在互補性堿基序列部中互補地結(jié)合，并且以粘性突出末端在生理的條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的序列結(jié)構(gòu)。
[0028](1-4):不使用核酸連結(jié)酶制成核酸凝膠的方法，其包括提高上述(1-1)~(1-3)任何的核酸溶膠狀組合物的核酸濃度及/或鹽濃度。
[0029](1-5):用于不使用核酸連結(jié)酶制成核酸凝膠的試劑盒，其為用于制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的試劑盒，其分別包括:
[0030]含上述(1-1)所述的第I核酸単體，不含有核酸連結(jié)酶的第I溶膠狀組合物 '及
[0031]含(1-1)中記載的第2核酸単體，不含有核酸連結(jié)酶的第2溶膠狀組合物；
[0032]其中
[0033]該第I核酸單體中的粘性突出末端含第I序列，
[0034]該第2核酸單體中的粘性突出末端含第2序列，并且
[0035]該第I序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。
[0036](1-6):制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的方法，其包括通過混合上述(1-5)所述的試劑盒中的第I溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物來形成凝膠。
[0037](1-7):用于不使用核酸連結(jié)酶制成核酸凝膠的試劑盒，其為用于制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的試劑盒，其分別包括:
[0038]含上述(1-1)所述的核酸単體，不含有核酸連結(jié)酶的第I溶膠狀組合物 '及
[0039]含有在兩末端具有包括粘性單鏈的突出末端的雙鏈核酸，不含有核酸連結(jié)酶的第2溶膠狀組合物；
[0040]其中
`[0041]該第I核酸單體中的粘性突出末端含第I序列，
[0042]該雙鏈核酸的兩末端的突出末端含第2序列，并且
[0043]該第I序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。
[0044](1-8):制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的方法，其包括通過混合上述(1-7)所述的試劑盒中的第I溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物，形成凝膠。
[0045](1-9):不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠，其通過上述(1-4)、(1-6)及(1-8)所述的任何方法制成。
[0046](1-10):封入內(nèi)封物質(zhì)，并且制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的方法，其包括在上述(1-4)、( 1-6)及(1-8)所述的任何方法中，將要在凝膠形成前封入凝膠的內(nèi)封物質(zhì)添加到溶膠狀組合物中。
[0047](1-11): (1-10)所述的方法，其中內(nèi)封物質(zhì)選自:低分子量化合物、蛋白質(zhì)及細胞。
[0048](1-12):含有內(nèi)封物質(zhì)，并且不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠，其由上述(1-10)或(1-11)記載的方法制成。
[0049]另外，本發(fā)明也可提供以下技術(shù)方案:
[0050](1-13):(1-1)或(1-2)記載的溶膠狀組合物，其中核酸單體在互補性堿基序列部中互補地結(jié)合，并且，粘性突出末端含回文序列結(jié)構(gòu)。
[0051]本發(fā)明，在再第二的實施方式中，也可提供以下技術(shù)方案:
[0052](2-1):用于制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的溶膠狀組合物，其在組合物中以核酸濃度0.3mM+l.6/x (突出末端部堿基數(shù))mM以下含有由粘性突出末端部和互補性堿基序列部組成的2個以上的寡核苷酸的混合物，不含有核酸連結(jié)酶，鹽濃度以NaCl濃度換算在80mM/x (突出末端部堿基數(shù))以下，
[0053][其中，[0054]粘性突出末端部是4~12個核苷酸長，以與至少I個別的寡核苷酸中的粘性突出末端部在生理條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的單鏈核酸部分，
[0055]與別的寡核苷酸互補地結(jié)合的互補性堿基序列部是8~45個核苷酸長，以與別的寡核苷酸中的互補性堿基序列部在生理條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補]。
[0056](2-2):(2-1)所述的溶膠狀組合物，其用于在活體內(nèi)制成凝膠。
[0057](2-3):(2-1)記載的溶膠狀組合物，其中粘性突出末端含回文序列結(jié)構(gòu)。
[0058](2-4):制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的方法，其包括通過分別將上述(2-3)所述的溶膠狀組合物中的核酸濃度提高到3.2/x (突出末端部堿基數(shù))mM以上、鹽濃度以NaCl濃度換算提高到640mM/x (突出末端部堿基數(shù))-60mM以上來形成凝膠。
[0059](2-5):用于制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的試劑盒，其分別包括:
[0060]含有上述(2-1)所述的寡核苷酸的混合物，不含有核酸連結(jié)酶的第I溶膠狀組合物；及
[0061]含有(2-1)所述的寡核苷酸的混合物，不含有核酸連結(jié)酶的第2溶膠狀組合物；
[0062]其中
[0063]該第I寡 核苷酸的粘性突出末端部含第I序列，
[0064]該第2寡核苷酸的粘性突出末端部含第2序列，并且
[0065]該第I序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。
[0066](2-6):制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的方法，其包括通過將上述(2-5)所述的試劑盒中的第I溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物在核酸濃度成3.2/x (突出末端部堿基數(shù))mM以上、鹽濃度成以NaCl濃度換算640mM/x (突出末端部堿基數(shù))-60mM以上的條件下混合來形成凝膠。
[0067](2-7):用于制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的試劑盒，其分別包括:
[0068]含有上述(2-1)所述的寡核苷酸的混合物，不含有核酸連結(jié)酶的第I溶膠狀組合物；及
[0069]含有在兩端具有包括粘性的單鏈的突出末端部，其間具有由雙鏈構(gòu)成的互補性堿基序列部的核酸，不含有核酸連結(jié)酶的第2溶膠狀組合物；
[0070][在第2溶膠狀組合物中，
[0071]突出末端部是4~12個核苷酸長，以與該第I溶膠狀組合物中的寡核苷酸中的粘性突出末端部在生理條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的單鏈核酸部分，
[0072]互補性堿基序列部是8~45個核苷酸長，以與第I溶膠狀組合物中的寡核苷酸中的互補性堿基序列部在生理條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的雙鏈核酸部分]
[0073]其中
[0074]該第I溶膠狀組合物中的寡核苷酸的粘性突出末端部含第I序列，
[0075]該由雙鏈構(gòu)成的互補性堿基序列部的兩端的突出末端部含第2序列，并且[0076]該第I序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。[0077](2-8):制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的方法，其包括通過將上述(2-7)所述的試劑盒中的第I溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物在核酸濃度成3.2/x (突出末端部堿基數(shù))mM以上、鹽濃度成以NaCl濃度換算640mM/x (突出末端部堿基數(shù))-60mM以上的條件下混合來形成凝膠。[0078](2-9):不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠，其由上述(2-4)、(2-6)及(2-8)所述的任何方法制成。[0079](2-10):封入內(nèi)封物質(zhì)，并且制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的方法，其包括在上述(2-4)、(2-6)及(2-8)所述的任何方法中，將要在凝膠形成前封入凝膠的內(nèi)封物質(zhì)添加到溶膠狀組合物中。[0080](2-11): (2-10)所述的方法，其中內(nèi)封物質(zhì)選自:低分子量化合物、蛋白質(zhì)及細胞。[0081](2-12):含有內(nèi)封物質(zhì)，并且不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠，其由上述(2-10)或(2-11)記載的方法制成。[0082](3-1):(1-12)及(2-12)之任一項所述的核酸溶膠狀組合物、方法、試劑盒、或者核酸凝膠，其中核酸単體含CpG基序。[0083](3-2):(1-12)、(2_12)及(3-1)之任一項所述的核酸溶膠狀組合物、方法、試劑盒、或者核酸凝膠，其中核酸単體的種類數(shù)是3~8。[0084](3-3):(1-1)~(1-3)、及(2-1)~(2-3)之任一項所述的溶膠狀組合物，其中核酸単體含CpG基序，所述核酸溶膠狀組合物用于制成免疫佐劑。[0085](3-4):免疫佐劑，其是含(1-9)、(1-12)、(2-9)、及(2-12)之任一項所述的核酸凝膠的免疫佐劑，核酸單體含CpG基序。[0086]【發(fā)明效果】[0087]由本發(fā)明，因為可不添加連接酶等的核酸連結(jié)酶，通過調(diào)節(jié)鹽濃度一核酸濃度或突出末端的堿基數(shù)來凝膠化各種序列的核酸，從而可制成添加物含有量少的水凝膠。另外，在本發(fā)明中，沒必要使用給凝膠制成帶來安全性隱患的有機化合物。再者，也克服了由連接酶等的酶的使用所至的安全性一抗原性的問題。另外發(fā)現(xiàn)，通過使用連接酶的以往的方法，難以制備粘彈性優(yōu)良的核酸凝膠，但通過本發(fā)明的方法，可制備示優(yōu)良的粘彈性的核酸凝膠。[0088]再者，DNA或RNA可為以人為首的哺乳類細胞中表達的Toll-樣受體(TLR)的配體，如水凝膠ー樣的微粒子易攝取入表達TLR的免疫活性細胞，所以基于核酸形成的本發(fā)明的系統(tǒng)除了生理活性物質(zhì)的緩慢釋放化之外，作為有效活化免疫活性細胞的免疫佐劑發(fā)揮功能。再者由本發(fā)明也可克服佐劑和抗原的在活體內(nèi)的行為獨立的問題。另外，通過本發(fā)明的方法的凝膠化，例如，由CpG基序的使用，導(dǎo)入活體內(nèi)時可得到示高的細胞的免疫刺激性的核酸制備物。而且，由本發(fā)明可制備副作用少的免疫佐劑。[0089]一般而言，施用凝膠制劑時有必要切開等成為問題，但在本發(fā)明的系統(tǒng)中，在溶膠狀態(tài)下施用后，在體內(nèi)的凝膠化也可能。由此，由注射或噴霧、滴下、涂布的施用也可能。另外，與微細化凝膠不同，由于在溶膠狀態(tài)下施用后，在體內(nèi)凝膠化，無損害緩慢釋放化等的凝膠特性的擔(dān)憂。另外，本發(fā)明的凝膠有觸變性，通過注射器施用也能在體內(nèi)再度凝膠化，所以不損害緩慢釋放化等的凝膠特性。
[0090]另外，隨著核酸濃度或鹽濃度的變化進行凝膠化，在凝膠化中無需加熱等，所以對于熱或化學(xué)反應(yīng)弱的物質(zhì)、例如抗原蛋白質(zhì)或細胞之內(nèi)封也可能，內(nèi)封不穩(wěn)定的物質(zhì)時變性的可能性也少。從而，將比較大的物質(zhì)封入凝膠之中，損害封入物質(zhì)的功能的危險也少。再者，本發(fā)明的凝膠對周圍環(huán)境也穩(wěn)定。
[0091]再者，將反義DNA或siRNA、CpG DNA等的核酸醫(yī)藥摻入構(gòu)造中也可能。關(guān)于免疫活化，也可通過選擇適當?shù)膲A基序列而構(gòu)建不活化免疫的系統(tǒng)。凝膠的強度可通過核酸單位的結(jié)構(gòu)、突出末端數(shù)控制，可通過調(diào)節(jié)核酸濃度、鹽濃度、突出末端堿基數(shù)來控制凝膠化。由這些的調(diào)節(jié)，也可控制凝膠內(nèi)部的結(jié)構(gòu)、凝膠強度、內(nèi)封物質(zhì)的釋放速度。另外，也可向核酸単位的末端之一部分插入各種功能性分子，由此可更大幅度改變性質(zhì)。也可利用各種修飾核酸。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0092]【圖1】是根據(jù)本發(fā)明從寡核苷酸形成水凝膠的推定模式圖。
[0093]【圖2】是示由本發(fā)明形成的水凝膠的概觀的照片。
[0094]【圖3】是由本發(fā)明形成的水凝膠的掃描型電子顯微鏡像。
[0095]【圖4】是通過混合可形成兩種核酸単位的核酸単體的組形成凝膠的推定模式圖。
[0096]【圖5】是內(nèi)包內(nèi)封物質(zhì)的水凝膠的形成的流程及涉及的凝膠的掃描型電子顯微鏡像。
[0097]【圖6】是示由寡核苷酸制成的Y型単位及連結(jié)Y型単位制備的樹狀聚體樣DNA的模式圖及它們的TNF-a釋放活·性及由細胞的攝取的坐標圖。
[0098]【圖7】是示施用本發(fā)明的溶膠狀組合物之后，在活體內(nèi)形成凝膠的照片。
[0099]【圖8-1】是示施用溶膠狀組合物之后，在活體內(nèi)形成凝膠的照片及在活體內(nèi)形成的凝膠的掃描型電子顯微鏡像。
[0100]【圖8-2】是示在注射器內(nèi)、及從注射器的壓出后的DNA溶液或DNA水凝膠的照片(A)、將這些皮內(nèi)施用的部位的照片(C)、以及注射器通過前(B左)及注射器通過后(B右)的水凝膠的粘彈性的坐標圖(B)。
[0101]【圖9】是示含或不含CpG基序的，免疫學(xué)有活性或免疫學(xué)無活性的寡核苷酸的序列及使用它們得到的凝膠的樹突細胞的刺激活性的照片。
[0102]【圖10】示各種序列的寡核苷酸的例。
[0103]【圖11】是示通過混合兩種四足DNA形成凝膠的推定模式圖和通過混合形成的水凝膠的概觀的照片。
[0104]【圖12】是示通過混合四足DNA和雙鏈DNA(dsDNA)形成凝膠的推定模式圖和通過混合形成的水凝膠的概觀的照片。
[0105]【圖13】是含誘餌DNA及siRNA的四足DNA的設(shè)計圖。
[0106]【圖14】是示由免疫學(xué)有活性的四足DNA用OVA刺激的免疫應(yīng)答的增強的流程及坐標圖。
[0107]【圖15】是本發(fā)明的凝膠的推定立體結(jié)構(gòu)。
[0108]【圖16】是示使用各種核酸単位得到的凝膠之內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異的掃描型電子顯微鏡像。
[0109]【圖17】是示由DNA濃度、粘性突出末端的長度及鹽濃度控制凝膠的特性的坐標圖。
[0110]【圖18】是示由四足DNA的突出末端的性質(zhì)及鹽濃度控制從凝膠釋放內(nèi)封物質(zhì)的特性的坐標圖。
[0111]【圖19】是示使用膽甾醇修飾寡核苷酸的凝膠的細胞攝取及組織遷移性的増大的模式圖、坐標圖及照片。
[0112]【圖20】是示在活體外將溶膠狀的溶液施用到小鼠的鼻腔內(nèi)的結(jié)果，變成凝膠的照片。[0113]【圖21】是示DNA水凝膠中摻入GFP標記骨髓來源細胞(BMDC)的熒光顯微鏡圖像。
[0114]【圖22】是對比使用連接酶制備的DNA水凝膠和不使用連接酶制備的DNA水凝膠的凝膠粘彈性的坐標圖。
[0115]【圖23】是示對有3~12個足的多足DNA制備物的PAGE分析的結(jié)果的照片。
[0116]【圖24】是示DNA制備物的⑶光譜的坐標圖。
[0117]【圖25】是示小鼠血清中的多足DNA制備物的分解的照片(A及B)及坐標圖(C及D)。
[0118]【圖26】是示向小鼠注入的32P-DNA水凝膠的注入部位或排出淋巴節(jié)中的檢測量的經(jīng)時變化的坐標圖。
[0119]【圖27】是示小鼠血清中的DNA水凝膠的經(jīng)時分解(左上圖)、從內(nèi)包DXR的DNA水凝膠的DXR釋放的經(jīng)時變化(左下圖)、及內(nèi)包DXR的Cp⑶NA水凝膠的腫瘤增殖抑制效果的坐標圖(右圖)。
[0120]【圖28】是示由Cp⑶NA水凝膠的IL-6釋放誘導(dǎo)效果的坐標圖。
[0121]【圖29】是示由含有CpG的多足DNA制備物的TNF-a(A)及IL_6 (B)釋放誘導(dǎo)的坐標圖。
[0122]【圖30】是示由含有CpG的多足DNA制備物的TNF-a釋放誘導(dǎo)的坐標圖。
[0123]【圖31】是示含有CpG的多足DNA制備物的向細胞內(nèi)的攝取的坐標圖。
[0124]【圖32】是示由多足DNA制備物的IL_6釋放的活化以TLR9依賴性地進行的坐標圖。
[0125]【圖33】是示單核細胞進行多足DNA制備物的向細胞內(nèi)的攝取的坐標圖。
[0126]【圖34】是示含有CpG的DNA水凝膠持續(xù)強カ地誘導(dǎo)IL_6mRNA表達的坐標圖。
[0127]【圖35】是示內(nèi)包OVA的Cp⑶NA水凝膠強誘導(dǎo)適應(yīng)免疫反應(yīng)的坐標圖。
[0128]【圖36】是將注入部位中的免疫細胞的浸潤(左圖)、及脾腫重量(右圖)以各種佐劑對比的照片及坐標圖。
[0129]【實施方式】
[0130]1.定義
[0131]在專利權(quán)利要求中，“體溫”是指37°C，“生理條件下”是指鹽濃度以NaCl濃度換算150mM的條件下。
[0132]在本說明書及專利權(quán)利要求中，“核酸単體”是指選自與核酸、核酸衍生物、修飾型核酸、核酸互補地結(jié)合的化合物、及它們的混合物，可形成接下來定義的“核酸単位”的化合物。具體而言，一個“核酸単體”含構(gòu)成粘性突出末端的部分(下述模式圖中的X部分)及可與別的核酸単體形成雙鏈的互補性堿基序列部(下述模式圖中的I部分)。
[0133]在本說明書及專利權(quán)利要求中，“核酸単位”是指構(gòu)成將含上述核酸單體的水溶液中的核酸單體濃度及鹽濃度升高到一定濃度以上時形成的水凝膠(以下簡稱為凝膠)的推定結(jié)構(gòu)単位，有以下的模式圖所示的結(jié)構(gòu)(n=2~12)。但是，由本發(fā)明得到的凝膠之內(nèi)部結(jié)構(gòu)不是實際確認的，是在估計形成的凝膠內(nèi)推測各核酸單體經(jīng)取以下的結(jié)構(gòu)的核酸單位的形成而成為凝膠的。再有，“核酸単位”為方便起見、如下述模式圖以平面顯示，但實際推測為取如圖10之下部所示的復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)。這些“核酸単位”由構(gòu)成其的核酸單體中的粘性突出末端的相互之間的互補性連結(jié)，推定形成有如圖15所示的復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)的凝膠。
[0134]【核酸單位的模式圖】
[0135]【化I】
【權(quán)利要求】
1.用于不使用核酸連結(jié)酶制成核酸凝膠的核酸溶膠狀組合物，其由選自一部分互相互補的，與核酸、核酸衍生物、修飾型核酸、核酸互補地結(jié)合的化合物、及它們的混合物的2個以上的核酸單體構(gòu)成，ー個核酸單體含構(gòu)成粘性突出末端的部分、可與I個以上的別的核酸単體形成雙鏈的互補性堿基序列部，并且不含有核酸連結(jié)酶。
2.權(quán)利要求1所述的溶膠狀組合物，其用于在活體內(nèi)制成凝膠。
3.權(quán)利要求1或2所述的溶膠狀組合物，其中核酸單體包括在互補性堿基序列部中互補地結(jié)合，并且以粘性突出末端在生理的條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補的序列結(jié)構(gòu)。
4.不使用核酸連結(jié)酶制成核酸凝膠的方法，其包括提高權(quán)利要求1~3之任一項的核酸溶膠狀組合物的核酸濃度及/或鹽濃度。
5.用于不使用核酸連結(jié)酶制成核酸凝膠的試劑盒，其為用于制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的試劑盒，其分別含: 含權(quán)利要求1所述的第I核酸単體，不含有核酸連結(jié)酶的第I溶膠狀組合物；及 含權(quán)利要求1所述的第2核酸単體，不含有核酸連結(jié)酶的第2溶膠狀組合物； 其中 該第I核酸單體中的粘性突出末端含第I序列， 該第2核酸單體中的粘性突出末端含第2序列，并且 該第I序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補?！?br> 6.制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的方法，其包括通過混合權(quán)利要求5所述的試劑盒中的第I溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物來形成凝膠。
7.用于不使用核酸連結(jié)酶制成核酸凝膠的試劑盒，其為用于制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的試劑盒，其分別包括: 含權(quán)利要求1所述的核酸単體，不含有核酸連結(jié)酶的第I溶膠狀組合物；及 含有在兩末端具有包括粘性單鏈的突出末端的雙鏈核酸，不含有核酸連結(jié)酶的第2溶膠狀組合物； 其中 該第I核酸單體中的粘性突出末端含第I序列， 該雙鏈核酸的兩末端的突出末端含第2序列，并且 該第I序列和該第2序列以互相在生理條件下形成表現(xiàn)出體溫以上的融解溫度的雙鏈序列的程度互補。
8.制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的方法，其包括通過混合權(quán)利要求7所述的試劑盒中的第I溶膠狀組合物和第2溶膠狀組合物來形成凝膠。
9.不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠，其通過權(quán)利要求4、6及8之任一項所述的方法制成。
10.封入內(nèi)封物質(zhì)，并且制成不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠的方法，其包括在權(quán)利要求4、6及8之任一項所述的方法中，將要在凝膠形成前封入凝膠的內(nèi)封物質(zhì)添加到溶膠狀組合物中。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中內(nèi)封物質(zhì)選自:低分子量化合物、蛋白質(zhì)及細胞。
12.含有內(nèi)封物質(zhì)，并且不含有核酸連結(jié)酶的核酸凝膠，其通過權(quán)利要求10或11所述的方法制成。
13.權(quán)利要求1~12之任一項所述的核酸溶膠狀組合物、方法、試劑盒、或者核酸凝膠，其中核酸単體含CpG基序。
14.權(quán)利要求1~13之任一項所述的核酸溶膠狀組合物、方法、試劑盒、或者核酸凝膠，其中核酸單體的種類數(shù)是3~8。
15.權(quán)利要求1~3之任一項所述的溶膠狀組合物，其中核酸単體含CpG基序，所述核酸溶膠狀組合物用于制成免疫佐劑。
16.免疫佐劑，其特 征在干，是含權(quán)利要求9或12所述的核酸凝膠的免疫佐劑，核酸單體含CpG基序。
【文檔編號】A61K47/30GK103596594SQ201280027322
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月19日
【發(fā)明者】西川元也, 高橋有己, 高倉喜信 申請人:國立大學(xué)法人京都大學(xué)