專利名稱：用于檢測人免疫缺陷病毒-1型的引物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和核酸化學領域。特別涉及檢測人類免疫缺陷性病毒1型(HIV-1)的方法和試劑，因此本發(fā)明可用于一般醫(yī)學領域，特別是醫(yī)學診斷學領域和分子生物學領域。
擴增核酸特定序列方法的發(fā)明，即聚合酶鏈反應(PCR)，為快速檢測樣品中存在的過去曾認為是不可檢測的微量核酸提供了可能(見美國專利4,683,195、4,683,202、4,965,188)。PCR技術(shù)的發(fā)展和應用在文獻中有詳細報道，例如關于PCR相關課題范圍的資料可見于“PCR技術(shù)-DNA擴增原理和應用”，1989，(HA.Erlich編)Stockton Press，New York，NY；“PCR手冊方法和應用指南”，1990，(M.A.Innis等編)Academic Press，San Diego，CA；以及PCR技術(shù)，1995，(M.A.Innis等編)Academic Press，San Diego，CA。由銷售商，例如Perkin Elmer(Norwalk，CT)，出售PCR試劑并出版PCR技術(shù)手冊。
應用PCR和探針雜交技術(shù)擴增并檢測HIV-1核酸的報道見于Kwok，1992，醫(yī)學年鑒(Ann.Med.)24211-214；及Coutlee等，1991，分子細胞學探針(Mo1.cell.Probes)5241-259。以PCR技術(shù)為基礎的HIV-1檢測鑒定方法見于美國專利號5,008,182.和5,176,775；Kellogg and Kwok，1990，PCR手冊-方法和應用指南(Innis等編)，Academic Press，San Diego，CA337-347，Holodniy，1991，傳染病雜志(J.Inf.Dis.)163802-865；Jackson，1991，艾滋病51463-1467；Mulder，1994，臨床微生物學雜志(J.Clin.Microbiol.)32(2)292-300。
用于擴增和檢測HIV-1的商品試劑盒可以從Hoffmann-LaRoche(Nutley，NJ)購得，AmplicorTMHIV-1實驗是檢測HIV-1原病毒DNA的體外實驗方法，AMPLICOR HIV-1 MONITORTM實驗是HIV-1 RNA定量的體外實驗方法。兩種Amplicor實驗都使用SK462(SEQ ID NO5)和SK4321(SEQ ID NO6)引物擴增HIV-1核酸，在Mulder等，1994，臨床微生物學雜志(J.Clin.Microbiol)，32(2)292-300中有敘述，本文特稱為Amplicor HIV-1引物。
HIV-1具有相當?shù)幕蚪M序列多變性。對HIV-lgag及eiv基因核酸序列的多基因分析見Myers等，1993，人類反轉(zhuǎn)錄病毒和艾滋病1993，Los AlamosNational Laboratory，Los Alamos，NM.已明確M族存在A-J亞型。
現(xiàn)有技術(shù)中的分子生物和核酸生化的傳統(tǒng)技術(shù)，可見有關文獻的解釋，例如，Sambook 1989，分子克隆-實驗手冊，(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)Cold Spring Harbor，New York；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait，1984)；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames andS.J.Higgins.編，1984)；以及叢書，酶學方法(Academic Press，Inc.).
已鑒定明確了許多HIV-1 M族分離物(毒株)應用上述gag基因擴增引物，特別是Amplicor HIV-1引物SK462(SEQ ID NO5)及SK431(SEQ IDNO6)，是不可擴增或者是不可有效擴增的。這些毒株以前在AmplicorHIV-1引物結(jié)合區(qū)中未見序列變化。
本發(fā)明的目的之一是提供改進的一些引物，能有效擴增這些新發(fā)現(xiàn)毒株以及應用這些Amplicor HIV-1引物擴增所有的毒株。而且本發(fā)明的引物能以近似相同的效率擴增所有已知的HIV-1型M族毒株。
本發(fā)明涉及改進的寡核苷酸引物，該引物能使HIV-1型M族A-G亞型的gag基因片段的PCR擴增具近似相同效率而不出現(xiàn)非目的片段的伴隨擴增。
本發(fā)明特別涉及用于擴增人類免疫缺陷性病毒1型(HIV-1)核酸的寡核苷酸引物，該寡核苷酸引物選自SKCC1(SEQ ID NO3)及SKCC3(SEQ IDNO4)。
優(yōu)選SK145(SEQ ID NO1)和SKCC1(SEQ ID NO3)組成的或SK145(SEQ ID NO1)和SKCC3(SEQ ID NO4)組成的寡核苷酸引物對。
在另一實施方案中這些成對引物可以與引物SK145M2(SEQ ID NO2)組合形成一組由SK145(SEQ ID NO1)、SKCC1(SEQ ID NO3)及SK145M2(SEQ ID NO2)組成的或一組由SK145(SEQ ID NO1)、SKCC3(SEQ ID NO4)、SK145M2(SEQ ID NO2)組成的寡核苷酸引物。
本發(fā)明還涉及擴增來自HIV-1型M族亞型gag基因區(qū)域的改進方法，包括應用本發(fā)明的引物進行PCR擴增。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明擴增引物的試劑盒，這些試劑盒可以包含另外的試劑，例如檢測探針或者一個或多種擴增試劑例如聚合酶、緩沖液、三磷酸核苷酸。
為幫助理解本發(fā)明，對有關術(shù)語定義如下
“核酸”、“寡核苷酸”指的是多聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)及多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)及其它類型的多核苷酸嘌呤或嘧啶堿基的N糖甙或修飾后的嘌呤或嘧啶堿基?！昂怂帷焙汀肮押塑账帷边@兩者名稱之間沒有長度區(qū)別，可以互換使用。這些術(shù)語只是指分子的一級結(jié)構(gòu)。因此包括雙股、單股DNA以及雙股、單股RNA。
寡核苷酸可用適當?shù)姆椒ㄖ苽洌缈寺〔⑾拗颠m當序列以及直接化學合成，例如應用Narang等的磷酸三酯法，1979，酶學方法(Meth.Enzymol.)6890-96；Brown等的磷酸二酯法，1979，酶學方法(Meth.Enzymol.)68109-151；Beaucage等的二乙基磷酸酰胺法，1981，四面體通訊(TetrahedonLett.)221859-1862；以及美國專利號4,458,066的固相載體法。這些合成方法在Goodchild，1990，生物結(jié)合化學(Bioconjugate Chemistry)1(3)165-187中有評論。
“雜交”指的是應用兩個單鏈核酸通過堿基互補配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)。雜交可發(fā)生于完全互補的核酸鏈間或存在小錯配區(qū)的基本互補的核酸鏈間。只能在完全互補核酸鏈間發(fā)生雜交的條件稱為“嚴格雜交條件”或“序列特異雜交條件”?；旧匣パa序列的穩(wěn)定雙鏈可在非嚴格雜交條件下獲得。允許的錯配程度可通過適當調(diào)節(jié)雜交條件控制。核酸領域的技術(shù)人員憑經(jīng)驗調(diào)節(jié)一些變量能夠決定雙鏈的穩(wěn)定性。這些變量包括寡核苷酸的長度和堿基對的濃度、離子強度、以及堿基錯配率。根據(jù)該領域的指南(Sanbook 1989，分子克隆-實驗手冊，(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)Cold SpringHarbor，New York；Wetmur，1991，生物化學和分子生物學評論26(3/4)227-259)進行。
“引物”指的是天然或人工合成的寡核苷酸，在誘導合成與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物條件下，例如在4種不同的三磷酸核苷和聚合試劑(例如DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶)及適宜緩沖液和適宜溫度下，能作為DNA合成的起始點。引物優(yōu)選單鏈寡聚脫氧核糖核苷酸。引物的適宜長度取決于該引物的用途，一般在15-35個核苷酸之間。短的引物分子一般要求較低的溫度以與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復合物。引物不需要反映模板的準確序列，但必須與模板充分互補雜交。引物可以為檢測或固定而具備一些另外的特征，但不能改變該引物的基本性能即作為DNA合成起始點。例如引物可以在5’端包含另一個核酸序列，它不與靶核酸雜交，但有助于克隆該擴增的產(chǎn)物。引物與模板充分互補雜交的區(qū)域在本文中稱為雜交區(qū)域。
本文所用的“上游”引物指的是以延伸產(chǎn)物為編碼鏈的引物，“下游”引物指延伸產(chǎn)物為互補非編碼鏈亞序列的引物。
“目的序列”、“目的區(qū)域”、“目的核酸”指的是用于擴增檢測或作其它分析的核酸片段。
按本文所指，如果引物與目的序列之間的錯配數(shù)少于引物與樣品中可能存在的非目的序列間的錯配數(shù)，則該引物對于目的序列來說就是特異性的。只有當錯配數(shù)不超過引物與目的序列間的錯配數(shù)時才能選擇形成穩(wěn)定雙鏈的雜交條件。在該條件下目的特異性引物只與目的序列形成穩(wěn)定雙鏈。因此在適當?shù)膰栏駭U增條件下應用目的特異性引物能特異性擴增那些含有目的引物結(jié)合位點的序列。同樣，在適當?shù)膰栏耠s交條件下應用目的特異性探針能檢測特異性的目的序列。
“擴增反應混合物”指的是含有進行擴增反應所必須試劑的溶液，一般含有引物、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶、脫氧三磷酸核苷(dNTPS)、適宜緩沖液中的二價金屬離子。若反應混合物含有全部進行反應所必須的試劑，則為完全的反應混合物，若只含有一部分必要的試劑，則為不完全混合物。熟悉本領域的技術(shù)人員都明白，各種反應成份常規(guī)上是單獨溶液保存，各含有一種成份，以利于方便、穩(wěn)定儲存或應用時可調(diào)節(jié)各成分的濃度，并在反應之前將各反應物合并以形成完全的反應混合物。而且本領域的技術(shù)人員也都知道反應物都是分裝出售，適用的商品試劑盒可含有包括本發(fā)明引物在內(nèi)的任何一種反應成分。HIV-1擴增引物本發(fā)明的引物能擴增來自HIV-1型M族各亞型的核酸。這些引物顯著優(yōu)于以前所用的引物，能夠以近似相同的效率擴增所有M族A-G亞型分離物的gag基因區(qū)域的核酸，包括新發(fā)現(xiàn)的分離物。這些引物的核苷酸序列如下所示，自左到右按5’到3’方向排列。上游引物SK145(SEQ ID NO1)AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATSK145M2(SEQ ID NO2) AGTGGGGGGGACACCAGGCAGCAATGCAAAT下游引物SKCC1(SEQ ID NO3)TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCCSKCC3(SEQ ID NO4)TGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTAT本發(fā)明的下游引物可與本文中的所有上游引物一起使用，本發(fā)明的下游引物優(yōu)選與上游引物SK145(SEQ ID NO1)一起使用，視情況也可與上游引物SK145M2(SEQ ID NO2)結(jié)合。上游引物SK145(SEQ ID NO1)見kellog和Kwok，1990，PCR手冊方法和應用指南，1990，(Innis等編)Academic Press，SanDiego，CA337-347。第二個上游引物SK145 M2(SEQ ID NO2)在與SK145(SEQ ID NO1)相同的區(qū)域雜交，但能更好的與某些HIV-1A和E亞型分離物的核酸序列相匹配，如實施例中所示，這兩種上游引物同時使用能平衡特定亞型擴增的效率。擴增在能擴增全部HIV-1型M族各亞型的條件下進行擴增，但該條件必須足夠嚴格以避免非目的序列的擴增。優(yōu)選的擴增反應條件詳見Mulder，1994，臨床微生物學雜志(J.Clin.Microbiol.)32(2)292-300，以及Amplicor HIV-1Monitor實驗中的產(chǎn)物部分，該嚴格條件并非本發(fā)明的關鍵所在。擴增條件的最優(yōu)化可按本文提供的指導建立。
本發(fā)明的引物和方法可用于檢測HIV-1原病毒DNA或HIV-1RNA，RNA的擴增用反轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈反應(RI-PCR)，該技術(shù)在本學科內(nèi)已知，可見于美國專利號5,322,770、5,310,652；Myers Gelfand，1991，生物化學(Biochemistry)30(31)7661-7666；以及Young等，1993 臨床微生物學雜志(J.Clin.Microbiol.)31(4)882-886。HIV-1RNA的RT-PCR擴增技術(shù)見Mulder等，1994，臨床微生物學雜志(J.Clin Microbiol)32(2)；292-300和Holodniy等，1991傳染病雜志(J.Inf.Dis.)163802-865.
適用于擴增HIV-1DNA及RNA的樣品制備方法可見有關文獻。所用的具體方法不是本發(fā)明的關鍵，有關技術(shù)人員可根據(jù)本文提供的指導選擇并優(yōu)化適當?shù)臉悠分苽浞椒āＳ糜跈z測HIV-1原病毒DNA的優(yōu)選樣品制備方法見Casareale等，1992，PCR方法和應用2149-153以及Butcher和Spadoro.1992，臨床免疫學通訊(Clin.Immunol Newsletter)1273-76。用于檢測HIV-1原病毒DNA的優(yōu)選樣品制備試劑盒可作為Amplicor HNV-1實驗的一部分購得。用于檢測血漿中HIV-1RNA的優(yōu)選樣品制備法見Mulder等，1994，臨床微生物學雜志(J.Clin.Microbiol)32(2)292-300。用于檢測和/或定量HIV-1RNA的優(yōu)選樣品制備試劑盒可作為AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗的一部分購得。擴增產(chǎn)物分析本發(fā)明的擴增引物和方法適用于任何擴增核酸的應用，例如應用本發(fā)明的引物有助于克隆和/或HIV-1測序。檢測PCR擴增核酸的方法在本領域中是已知的。用于分析該擴增的核酸的方法不是本發(fā)明關鍵所在，任何適當?shù)姆椒ň墒褂?。?yōu)選使用實施例中所示的HIV-1RNA擴增法以定量病毒的荷載量。
檢測擴增核酸的方法包括用凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物及用與互補寡核苷酸探針雜交來進行檢測。檢測靶-探針雜交的適宜程序是已知的，包括斑點印跡法和反向斑點印跡法。
斑點印跡法中擴增的目的DNA用固相支持物固定，如尼龍膜。該膜-靶復合物在適宜的雜交條件下與標記的探針一起孵育，并在適宜的嚴格雜交條件下洗去未結(jié)合的探針，然后監(jiān)測膜上結(jié)合探針的情況。PCR擴增產(chǎn)物的斑點印跡檢測法見Saiki，1986，自然(Nature)324163-166和美國專利號5,468,613。
在反向斑點印跡法中，探針固定在固相支持物如尼龍膜上，擴增的目的DNA是標記了的。目的DNA的標記一般是在擴增過程中通過與標記的引物結(jié)合實現(xiàn)，可以標記一個或兩個引物。將膜-探針復合物與標記的擴增的靶DNA在適宜雜交條件下孵育，然后在適當?shù)膰栏駰l件下洗去未雜交的靶DNA，監(jiān)測濾膜作為結(jié)合靶DNA存在的標志。反向斑點印跡法可見Saiki，1989，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.SciUSA)866230及美國專利號5,468,613。
或者，反向斑點印跡鑒定法也可在具有大量探針雜交位點或孔的固相支持物上進行。例如微孔板特別適用于本方法的大規(guī)模臨床應用。可通過被動結(jié)合或粘聯(lián)在微孔板上的蛋白介質(zhì)如牛血清蛋白(BSA)將探針固定在微孔板上進行(Tung，1991，生物結(jié)合化學(Bioconjugate Chem.)2464-465)。。反向斑點印跡法見美國專利號5,232,829；Loeffelholz等，1992，臨床微生物學雜志(J.Clin.Microbiol.)30(11)2847-2851；Jackson等，1991等，艾滋病AIDS51463-1467；Mulder等，1994，J.Clin.Microbiol32(2)292-300；AMPLICOR HIV-1 及AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗產(chǎn)物的插入片段。
檢測或/和定量擴增產(chǎn)物優(yōu)選應用與固定在微孔板上的寡核苷酸探針雜交的方法，按AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗的試劑和方法進行。應用本方法定量HIV-1RNA在實施例中有詳細敘述。
BSA綴合探針也可與磁性微粒結(jié)合，結(jié)合探針在溶液中與標記的擴增產(chǎn)物雜交，通過溶液的磁性獲取結(jié)果產(chǎn)物。根據(jù)上述方法即可檢測磁性固定的雜交雙鏈。
另一適合的鑒定方法稱為5’-核酸酶鑒定法，見美國專利號5,210,015、5,487,972以及Holland等，1988，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)887276-7280。根據(jù)此法將標記的檢測探針加入擴增反應混合物中，該探針已經(jīng)修飾以防止探針作為DNA合成的引物。任何在每一合成步驟如引物延伸過程中與目的DNA雜交的探針通過DNA聚合酶(例如TaqDNA聚合酶)的5’-3’外切核酸酶活性而降解，然后檢測該探針的降解產(chǎn)物。因此探針斷裂產(chǎn)物的存在既能夠表明探針與目的DNA雜交的發(fā)生和也能表明擴增反應的發(fā)生。美國專利號5,491,063和5,571,673給出了檢測與擴增同時發(fā)生的探針降解的改進方法。
上述的鑒定方案通常應用標記的寡核苷酸協(xié)助檢測雜交雙鏈。寡核苷酸用可通過分光器、光化學、生物化學、免疫化學或化學的方式可檢測到的標記物標記?？捎玫臉擞浳镉?2P、熒光染料、電子密度試劑、酶(例如通常用于ELISA中的)、生物素、或者可產(chǎn)生抗血清或單克隆抗體的半抗原或蛋白。本發(fā)明標記的寡核苷酸可應用前述合成寡核苷酸的方法合成和標記。
通過監(jiān)測反應混合物中雙鏈DNA總量的增加檢測HIV-1核酸擴增的替換方法見Higuchi等，1992，生物/技術(shù)(Bio/Technology)10413-417；Higuchi等，1993，生物/技術(shù)(Bio/Technology)；111026-1030；歐洲專利公開號512,334。雙鏈目的DNA的檢測依據(jù)在于當溴化乙錠和其它DNA結(jié)合標記與雙鏈DNA結(jié)合時顯示的增加的熒光度。這些DNA結(jié)合標記是加到擴增反應混合物中的。目的序列的擴增使雙鏈DNA量增加，導致可檢測的熒光度的增加。
本發(fā)明也涉及試劑盒，包含實施本發(fā)明方法所用組分的多包裝單位。一個實用的試劑盒包括擴增HIV-1核酸的PCR引物，也含有用于檢測擴增的HIV-1產(chǎn)物的試劑，例如寡核苷酸探針，這些探針有時被固定在適當?shù)妮d體膜上。其它可選擇的試劑盒成份包括催化引物延伸產(chǎn)物合成的制劑、三磷酸核苷酸底物、用于標記的物質(zhì)(例如親和素-酶綴合物、酶底物，若用生物素標記則為顯色劑)、PCR或雜交反應的適宜緩沖液以及實施本方法的說明。
本發(fā)明的下述實施例只提供例證，并不限制本發(fā)明的范圍。通過參閱上文所述及下文的實施例，本學科領域中一般的技術(shù)人員可以明了實施例后權(quán)利要求書范圍內(nèi)本發(fā)明的大量實施方案。
實施例1定量標準的構(gòu)建用AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗法進行的病毒載荷的定量需用一種定量標準(QS)，該定量標準用相同引物對擴增，但用另一探針檢測。將QS按已知的濃度加到被檢樣品中以產(chǎn)生已知的參照信號，在一較寬的目的片段濃度范圍內(nèi)，由擴增的目的片段或擴增的QS產(chǎn)生的信號與該參照量成正比。目的片段拷貝數(shù)可通過比較未知目的片段擴增所產(chǎn)生的信號與已知QS所產(chǎn)生的信號算得。
由于本發(fā)明引物擴增的片段不完全包含在AMPLICOR HIV-1MONITOR實驗的QS中，因此應用本發(fā)明的引物可以構(gòu)建一新的QS。新的QS是通過延伸Amplicor QS序列使其包含SKCC！(SEQ ID NO3)及SKCC3(SEQ ID NO4)結(jié)合位點，由Amplicor QS構(gòu)建成的。產(chǎn)生的QS可用AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗用的QS特異性探針檢測。含有新QS序列的質(zhì)粒構(gòu)建可按以下所示的標準技術(shù)進行，通過該質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄QS RNA。
應用SK145(SEQ ID NO1)及SK151(SEQ ID NO7)引物在下面實施例2中所述的必要條件下擴增由AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗獲得的Amplicor QS。這種擴增產(chǎn)生一含有SK145(SEQ ID NO1)及SK151(SEQ IDNO7)引物結(jié)合位點的DNA擴增產(chǎn)物，并保留原有的含QS特異探針結(jié)合位點的內(nèi)序列。
然后將產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物延伸使其包含SKCC1(SEQ ID NO3)的引物結(jié)合位點，并加上一個接頭以便克隆產(chǎn)物。該步通過用SK145(SEQ ID NO1)再次擴增延伸使其在5’-末端包含一HindIII接頭和SKCC1(SEQ ID NO3)而實現(xiàn)。適宜的擴增條件見Kellogg Kwok，1990，PCR方案方法和應用指南(Innis等編)，Academic Press，San Diego，CA337-347，除應用較低的退火/延伸溫度(例如42℃)以使SHCC1(SEQ ID NO3)發(fā)生雜交之外。
然后，將擴增產(chǎn)物進一步延伸使其包含SKCC3(SEQ ID NO4)引物結(jié)合位點，并在另一端加上第二個接頭以便克隆產(chǎn)物。該步通過用SK145(SEQ IDNO1)擴增延伸使其在5’-末端包含一Hind III接頭，同樣，用SKCC3(SEQ IDNO4)在5’末端延伸使其包含一XBaI接頭，擴增條件同上。
然后，將擴增產(chǎn)物插入質(zhì)粒，擴增的DNA和質(zhì)粒PSP64(promage，Madison，WI)分別用HindIII和XBaI消化，再用標準方法連接。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)細胞并獲取含有正確插入片段的克隆。對重組質(zhì)粒的插入片段必須進行序列測定以明確該引物和探針結(jié)合位點無突變發(fā)生。
QS RNA是用MEGAScriptTMSP6試劑盒(Ambion，Inc.Austin，TX)由含有QS序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄得來。
實施例2HIV-1 RNA定量本實施例評價了由不同HIV-1分離物毒株擴增的相對效率，同時也用AMPHCOR HIV-1 MONITOR實驗的試劑盒進行了擴增以便比較。
HIV-1毒株來自HIV-1陽性的臨床病例，克隆gag基因片段并用標準方法測序，根據(jù)該序列確定克隆的HIV-1亞型。發(fā)現(xiàn)大量HIV-1毒株是新型的。本例中按核苷酸序列選取特定的毒株，預期這些毒株的擴增對于AMPLICORHIV-1 MONITOR實驗法會有一定的困難，而且所選的毒株能夠代表M族亞型的序列變化。目的核酸構(gòu)建含有來自每一分離物的HIV-1 gag基因片段的質(zhì)粒，并基本上按Holodniy，1991，傳染病學雜志(J.Inf.Dis.)163802-865的方法轉(zhuǎn)錄HIV-1 RNA模板。制備每種模板的貯藏液并測定模板濃度，按估計的相對濃度稀釋貯藏液以使加到每一反應中的模板濃度相等，加到反應體系中的絕對模板拷貝數(shù)大約為4000-8000。定量標準將實施例1所述的QS按已知濃度加入各個反應混合物中，一般每個反應體系大約有100個拷貝。引物反應A-F是應用以下引物組合進行的。
引物組合比較反應引物組合A SK462(SEQ ID NO5)SK431(SEQ ID NO6)B SK145(SEQ ID NO1)SK151(SEQ ID NO7)C SK145(SEQ ID NO1)SKCC1(SEQ ID NO3)D SK145(SEQ ID NO1)和SK145M2(SEQ ID NO2)SKCC1(SEQ ID NO3)E SK145(SEQ ID NO1)SKCC3(SEQ ID NO4)F SK145(SEQ ID NO1)和SK145M2(SEQ ID NO2)SKCC3(SEQ ID NO4)所有的引物都在5’末端生物素化，以便能在反向斑點印跡、微孔板方法中檢測。上面未提到的其它引物的序列見下，方向為5’至3’。
上游引物SK462(SEQ ID NO5) AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT下游引物SK431(SEQ ID NO6) TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCTSK151(SEQ ID NO7) TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT擴增擴增反應A是按AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗所用的試劑和條件進行的。
擴增反應B按100ul反應體積進行，包含的試劑見下HIV-1模板RNAQS RNA
50mMN-二苷氨酸pH 8.3111mM醋酸鉀K(OAc)3.6mM醋酸錳Mn(OAc)2500uM三磷酸脫氧尿苷(dUTP)300uM脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧胞苷三磷酸(dCTP)和脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)的每一種50uM 脫氧胸苷三磷酸(dTTP)15％ 甘油0.2uM 每種生物素化的引物2單位 UNG*10單位rTthDNA聚合酶**由Hoffmann-La Roche生產(chǎn)，Pekin Elmer(Norwalk，CT)出售.
擴增反應C、D按反應B的條件進行，但需作如下改動100m K(OAc)500uM dATP，dCTP和dGTP的每一種7.5％ 甘油10單位UNG擴增反應E和F按反應C和D的條件進行但改用10％的甘油，反應混合物的細微改動是為使每對引物的擴增條件最優(yōu)化。
擴增反應B-F是用TC600DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer，Norwalk，CT)按如下溫度程序進行的。
反應前孵育 50℃ 2分鐘反轉(zhuǎn)錄 60℃ 30分鐘4個循環(huán) 變性95℃ 10秒鐘退火55℃ 10秒種延伸72℃ 10秒種26個循環(huán) 變性90℃ 10秒種退火60℃ 10秒種延伸72℃ 10秒種最后延伸 72℃ 15分鐘用探針雜交檢測擴增產(chǎn)物應用AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗的試劑和方案檢測擴增產(chǎn)物，估計的起始目的片段濃度按其中所述方法計算。結(jié)果AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗的定量方法中，起始目的片段濃度通過比較擴增后該目的片段產(chǎn)生的信號與擴增后已知濃度的QS產(chǎn)生的信號得到。因為QS的已知濃度是擴增前的數(shù)值，而比較的信號是擴增后的信號，因此擴增相對效率的改變會影響對未知目的片段起始濃度的估計。AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗定量是按HIV-1亞型B的擴增效率標定的，已知HIV-1的其它亞型會以較低的效率擴增，因此估計的目的片段濃度會比真實濃度低。
在本實驗中目的RNA按已知濃度加到各反應中，因此每一毒株的相對擴增效率可通過比較估計的目的片段濃度確定。因為AMPLICOR HIV-1MONITOR實驗定量是以HIV-1亞型B的擴增效率標定的，所以將亞型B(克隆105-1)的估計先導濃度作為參考值。對每一毒株，都用該分離物的估計靶濃度除以B亞型的估計靶濃度來測定相對擴增效率。這些相對擴增效率見下表，“-”表示該反應未進行。
相對亞型B的效率克隆亞型 A B C D E F113-1A694.31.70.91.41.40.9113-2A19 ---1.31.11.30.6114-1A12.4 ---1.41.30 70.9114-2A9.8 1.21.11.81.50.8115-1A497.6 0.81.21 1.6115-2A646.42.41 1.50.91.4105-1B11 1 1 1 1101-15 C7.3 ---1.13.51.91.4107-6D0.8 ---0.60.70.70.8308-1D0.9 ---0.60.70.70.5110-5E520.7465.7 3.51.24.60.8111-6E0.8 ---1.11.60.91.1112-7E3.3 0.81.51 91.21.4106-1G1.9 ---2.32 1.81.5108-3G0.6 ---0.50.80.50.5109-1G32.5 1 0.50.60.60.3
結(jié)果顯示，AMPLICOR用V-1 MONITOR實驗(反應A)擴增不同的HIV-1毒株的效率有顯著不同，有一些毒株包括亞型E毒株，克隆110-5，其擴增效率至少比亞型B(克隆105-1)的效率低500倍。
盡管只檢測了一部分毒株，但應用引物對SK145(SEQ ID NO1)和SK151(SEQ ID NO7)(反應B)仍顯示能顯著提高擴增效率的均一性。但是亞型E毒株(克隆110-5)的擴增效率仍比亞型B(克隆105-1)的擴增效率低500倍。
應用SK145(SEQ ID NO1)和SKCC1(SEQ ID NO3)(反應C)能以大約3倍于亞型B(克隆105-1)的擴增效率擴增包括亞型E毒株(克隆110-5)在內(nèi)的全部毒株。加入SK145M2(SEQ ID NO2)(反應D)能進一步提高毒株110-5的擴增效率，使其與亞型B參照種基本上相當。
同樣，應用SK145(SEQ ID NO1)及SKCC3(SEQ ID NO4)(反應E)能以大約5倍于亞型B(克隆105-1)的效率擴增包括亞型E毒株(克隆110-5)的全部毒株。加入SK145M2(SEQ ID NO2)(反應F)能進一步提高毒株110-5的擴增效率，使其與亞型B參照種基本上相當。
實施例3臨床樣品中的HIV-1定量本實施例中對來自Senegal的血清陽性病人的30個臨床樣品檢測HIV-1RNA，雖然未確定臨床樣品中存在的亞型，但因亞型A和D在非洲該地區(qū)內(nèi)相當普遍，可以預計某些臨床樣品不能被擴增或不能應用AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗進行有效擴增。
樣品準備如下將血漿樣品(80-250ul)與20ul 0.25％(重量/體積)的紅色Estapor聚苯乙烯微球(Bangs Laboratories，Inc.，Carmel，IN)一起加到1.5ml椎形離心管中，25,300Xg在4℃下離心1小時，棄上清，將沉淀粒子重新懸浮于250ul溶解緩沖液(50ul溶解液相當于6.7ul 30u/ul RNA酶抑制劑(Promega，Madison，WI)；0，67ul100mMDTT(二硫蘇糖醇)；2ul10％NP40(Pierce，Rockford，IL)；0.25ul 4mg/ml多聚rARNA；和40.4ul焦碳酸二乙酯處理的水)。將該沉淀在室溫下孵育15分鐘并旋轉(zhuǎn)混勻。
擴增反應在100ul含有50ul病毒裂解液和50ul的2x擴增反應混合物的反應體系中進行，以使最終反應物濃度與上面所述一致。大約100個拷貝的適當QS作為反應混合物的一部分被加到每一反應中，擴增產(chǎn)物的檢測按AMPLICORHIV-1 MONITOR實驗所用的試劑和方法進行，如上所述。
每一樣品的擴增按如下引物組合進行。
引物組合比較反應 引物組合A SK462(SEQ ID NO5)SK431(SEQ ID NO6)B SK145(SEQ ID NO1)SKCC1(SEQ ID NO3)C SK145(SEQ ID NO1)和SK145M2(SEQ ID NO2)SKCC1(SEQ ID NO3)結(jié)果按每ml血漿中HIV-1模板的拷貝數(shù)總結(jié)如下
估計的目的片段濃度(拷貝/毫升)分離物 A BC重復試驗重復式驗DKN 0350 800 1860 16001100DKN 079360 300603724091780 152300DKN 1541140 216605456068820 67120DKN 1620 160202598064340 21880DKN 1620 121801052014300 18320DKN 1690 3140 7000 56518047DKN 1711180 640 500 560 1040DKN 282560 3400 4360 55603460DKN 402340 4260 1052070005060MBN 26 27740 169401922016700 18680MBN 31 180 1820 1820 17202240MBN 34 840 2160 2200 31003120MIH 0022320 51320121100 144180 123900MIH 0122960 336204092040740 75840MIH 01330360 319805536042800 71220MIH 03017625 178500 273938 169750 189625MIH 053+ 534960 231620 530900 878340MIH 05510560 439605422049400 37400MIH 0745700 3980 6020 36404940MIH 11230480 271980 490780 423600 416140MIH 157520 165480 82920169980 146320MIN 003a 1300 577202162035380 34560MIN 003b 1760 328203094027760 26600MIN 017540 437380 375120 447740 902780MIN 0670 000 0MIN 12644320 636003846056680 40300MIN 139460 146320 142800 94520 105600MIN 146200 499203210019900 30400MIN 2170 3220 1880 23202580MIN 589154780267740 127100 144160 228040結(jié)果表明，本發(fā)明的引物組合B和C能擴增來自大多數(shù)的臨床樣品。30例樣品中除一例外，該引物組合B和C都能擴增，相反AMPLICOR HIV-1MONITOR實驗不能擴增29例中的6例。樣品MIH053應用AMPLICORHIV-1 MONITOR實驗擴增產(chǎn)生出一個強信號，但不能產(chǎn)生QS信號。因此在上表中該樣品未被定量，以“+”表示。
而且，對大多數(shù)樣品應用引物組合B或C估計的拷貝數(shù)顯著高于應用AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗估計的拷貝數(shù)。根據(jù)實施例2中顯示的擴增效率的不同，以上應用AMPLICOR HIV-1 MONITOR實驗低估的模板濃度也許會產(chǎn)生明顯降低的擴增效率。
在樣品MIN067中未檢測到病毒RNA，但這是否是由于目的序列中的不可見變化干擾了引物雜交或探針雜交，或其它原因引起的，尚不能定論。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名F.HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道Grenzacherstrasse 124(C)城市Basle(D)洲BS(E)國家Switzerland(F)郵編(ZIP)CH-4070(G)電話061-688 37 82(H)傳真061-688 13 95(I)電報962292/665542 hlr ch(ii)發(fā)明名稱檢測HIV-1的引物(iii)序列號7(iv)機讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機Apple Macintosh(C)操作系統(tǒng)System 7.1(Mactintosh)(D)軟件Word 5.1(v)在先申請資料申請?zhí)?0-037744申請日17.01.97(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2AGTGGGGGGACACCAGGCAGCAATGCAAAT(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3TACTAGTAGT TCCTGCTATG TCACTTCC(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4TGAAGGGTAC TAGTAGTTCC TGCTAT(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述 SEQ ID NO5AGTTGGAGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6TGCTATGTCA GTTCCCCTTG GTTCTCT(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7TGCTATGTCA CTTCCCCTTG GTTCTCT
權(quán)利要求
1.一種用以擴增人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的寡核苷酸引物，其選自SKCC1(SEQ ID NO3)和SKCC3(SEQ ID NO4)。
2.一對由SK145(SEQ ID NO1)和SKCC1(SEQ ID NO3)組成的寡核苷酸引物。
3.一組由權(quán)利要求2的一對引物和SK145M2(SEQ ID NO2)組成的寡核苷酸引物。
4.一對由SK145(SEQ ID NO1)和SKCC3(SEQ ID NO4)組成的寡核苷酸引物。
5.一組由權(quán)利要求4的一對引物和SK145M2(SEQ ID NO2)組成的寡核苷酸引物。
6.一種檢測人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的試劑盒，其包括權(quán)利要求1的寡核苷酸引物。
7.一種檢測人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的試劑盒，其包括權(quán)利要求書2的一對寡核苷酸引物。
8.一種檢測人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的試劑盒，其包括權(quán)利要求3的一組寡核苷酸引物。
9.一種檢測人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的試劑盒，其包括權(quán)利要求4的一對寡核苷酸引物。
10.一種檢測人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的試劑盒，其包括權(quán)利要求5的一組寡核苷酸引物。
11.一種擴增人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸的方法，其包括應用SKCC1(SEQ ID NO3)或SKCC3(SEQ ID NO4)進行聚合酶鏈反應。
12.權(quán)利要求11的方法，其中聚合酶鏈反應是用SK145(SEQ ID NO1)和SKCC1(SEQ ID NO3)進行。
13.權(quán)利要求12的方法，其中聚合酶鏈反應也用SK145M2(SEQ ID NO2)進行。
14.權(quán)利要求11的方法，其中聚合酶鏈反應是用SK145(SEQ ID NO1)和SKCC3(SEQ ID NO4)進行。
15.權(quán)利要求11的方法，其中聚合酶鏈反應也用SK145M2(SEQ ID NO2)進行。
16.基本上如本文所述的新的引物、方法和試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明為人類免疫缺陷性病毒1型(HIV－1)gag基因核酸序列的聚合酶鏈反應(PCR)擴增提供了改進的引物,本發(fā)明的引物和擴增方法能夠以幾乎相同的效率檢測全部HIV－1型M族的分離物。
文檔編號C07H21/04GK1191975SQ9810391
公開日1998年9月2日 申請日期1998年1月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月17日
發(fā)明者辛迪·D·克里斯托弗森, 雪莉·Y·夸克, 呂余希達 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司