專利名稱：基于凝膠固定核酸的dna固定方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將DNA固定于凝膠上的方法，該方法可用于制備DNA微陣列 以及固定DNA的反復(fù)利用等。本發(fā)明還涉及按照所述方法將DNA固定其上的 材料以及用所述材料檢測靶核酸的方法。
背景技術(shù)：
由于持續(xù)的化學(xué)暴露(環(huán)境物質(zhì)，食物等)，我們遺傳物質(zhì)的完整性時刻受 到挑戰(zhàn)。在疾病過程以及人的一生中，基因組DNA并不是一成不變的，研究基 因組水平上的動態(tài)變化顯得越來越有必要。
由于技術(shù)瓶頸的制約，對疾病過程中基因組水平上動態(tài)變化的系統(tǒng)性的比 對研究仍然無法進(jìn)行。但是保存?zhèn)€體基因組DNA以供現(xiàn)在或者將來研究的需要， 顯然具有極其重要的現(xiàn)實意義。如果能獲得人一生基因組變化的信息并作為醫(yī) 學(xué)資料保存下來，這必將能夠推動對健康狀態(tài)，疾病預(yù)測，疾病防治以及個性 化治療的認(rèn)識。然而，基因突變位點數(shù)量眾多，從人體樣本中獲得基因組DNA 的產(chǎn)量受到限制，我們必須用有限的基因組DNA檢測數(shù)以百萬計的突變位點。 科研人員試圖建立起高通量平臺以實現(xiàn)檢測的微型化，然而對所有可疑SNP位 點進(jìn)行分析仍然需要大量的DNA樣本。僅僅通過反應(yīng)微型化技術(shù)似乎無法完成 這樣的任務(wù)，基因組DNA固定化以實現(xiàn)DNA的回收和反復(fù)利用是一比較理想 的解決方法。
目前,固定DNA的已知方法大體分為以下兩類丄DNA通過共價鍵與固相載 體相結(jié)合；2.DNA通過靜電作用或者其它非共價鍵的形式與固相載體結(jié)合。顯然，通過共價鍵結(jié)合的DNA具有更好的穩(wěn)定性和可控性，是更合理的固定方法。為了提高與支持物的固定效率，需要預(yù)先熱變性DNA，在未變性的情況下固定效率明顯降低。另外，在現(xiàn)有技術(shù)中，為了對固定著的DNA進(jìn)行分析，往往需要通過PCR方法對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。因此，這種DNA的固定方法需要耐受反復(fù)重復(fù)的熱循環(huán)
(1) 將樣品溫度增加至95 °C，解開DNA雙鏈中的氫鍵；
(2) 將樣品溫度降低至45 °C，使得DNA模板與引物雜交，便于后續(xù)的DNA擴(kuò)增；
(3) 將樣品溫度增加至74 °C，通過使用聚合酶延伸引物實現(xiàn)DNA的體外擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，由本發(fā)明制備得到的固定有DNA的凝膠能夠承受反復(fù)的PCR反應(yīng)條件，為DNA的反復(fù)使用提供了可能。
本發(fā)明所述的DNA樣本的固定方法，包括原料選擇、混合和聚合反應(yīng)三個步驟；各步驟的內(nèi)容如下-.
原料選擇選用的原料和用量是10XTBE (pH13): 10%; 40%甲基丙烯酰胺儲存液10—70 %;稀釋變性氨基未端修飾的核酸1 nL—5ml;N,N,N,N-四甲基乙二胺1—10%; 10%過硫酸銨1—10%; 其余為水；
混合在配置好的凝膠原料中加入氨基末端修飾的核酸進(jìn)行混合，混合物
中含有的核酸量為10-1000ng/3pL;
聚合反應(yīng)取5 ^L混合物置于PCR反應(yīng)管中，37"C放置30分鐘待聚合反應(yīng)結(jié)束后，混合物成型成凝膠狀，末端氨基修飾的核酸即通過共聚反應(yīng)在凝膠中得以固定。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點采用的固相載體，甲基丙烯酰胺單體/甲叉雙丙烯酰胺水凝膠的三維結(jié)構(gòu)確保了 DNA結(jié)合的高承載量，同時水凝膠的親水特性能為固定的DNA創(chuàng)造良好的溶液環(huán)境便于隨后PCR反應(yīng)的進(jìn)行。末端修飾的核酸分子通過與固相載體之間形成穩(wěn)定的共價鍵實現(xiàn)固定，能夠經(jīng)受PCR反應(yīng)的劇烈條件，為隨后的PCR反應(yīng)驗證提供了保證。這種新型的DNA共聚反應(yīng)在沒有UV激發(fā)的情況下，仍然有較高的固定效率，從而排除了共聚反應(yīng)中生成嘧啶二聚體的可能性，對SNP檢測以及基因組測序尤為重要。


圖1是甲基丙烯酰胺單體/甲叉雙丙烯酰胺水凝膠固定末端氨基修飾的PCR產(chǎn)物的固定效果圖。
圖2是5'末端帶有氨基的PCR產(chǎn)物作為固定模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳圖。
圖3是pUCm-T-SEE質(zhì)粒斷裂片斷作為固定模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳圖。
圖4是人基因組DNA斷裂片斷作為固定模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳圖。
具體實施方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所述的DNA樣本的固定方法，包括原料選擇、混合和聚合反應(yīng)三個步驟；各步驟的內(nèi)容如下
原料選擇選用的原料和用量是10XTBE (pH13): 10%; 40%甲基丙烯
酰胺儲存液！0—70 % ，稀釋變性氨基未端修飾的核酸1 HL—5ml;N,N，N，N-
四甲基乙二胺1—10%; 10%過硫酸銨1—10%;其余為水；混合在配置好的凝膠原料中加入氨基末端修飾的核酸進(jìn)行混合，混合物中含有的核酸量為10-1000ng/3|iL;
聚合反應(yīng)取5 ^L混合物置于PCR反應(yīng)管中，37'C放置30分鐘待聚合反應(yīng)結(jié)束后，混合物成型成凝膠狀，末端氨基修飾的核酸即通過共聚反應(yīng)在凝膠中得以固定。
所述甲基丙烯酰胺單體重量濃度在5% - 30%之間，N,N,N,N-四甲基乙二胺
重量濃度在4%，過硫酸胺重量濃度在6%。核酸的濃度在0.5pg/mL - 50pg/mL
用5%和20%聚甲基丙烯酰胺凝膠原料配制DNA樣本的配方表
原料名稱 20%聚甲基丙烯酰胺凝膠 5%聚甲基丙烯酰胺凝膠
10xTBE (pH13) 3 pL 3
40。/。甲基丙烯酰胺儲存液 15 nL 4pL
H20 6jiL 17 pL
稀釋變性的氨基未端修 3&飾的核酸
N,N，N,N-四甲基乙二胺 1.2 nL 1.2 pL
10%AP (過硫酸銨) 1.8 HL 1.8
參照圖1:本發(fā)明所述甲基丙烯酰胺單體/甲叉雙丙烯酰胺水凝膠固定末端氨基修飾的PCR產(chǎn)物的固定效果(其中泳道l: pH11.0;泳道2: pH7.0)。
參照圖2: 5'末端帶有氨基的PCR產(chǎn)物作為固定模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳圖；其中泳道l (40次PCR反應(yīng)后)SEQIDN0.5和SEQIDN0.6序列號的引物對PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；泳道2(80次PCR反應(yīng)后)SEQIDN0.5和SEQIDN0.7序列號的引物對PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；泳道3 (120次PCR反應(yīng)后)SEQIDN0.4和SEQIDNO,8序列號的引物對PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；泳道4(160次PCR反應(yīng)后)SEQIDN0.3和SEQIDN0.6序列號的引物對PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物。參照圖3: pUCm-T-SEE質(zhì)粒斷裂片斷作為固定模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳圖；其中泳道l (40次PCR反應(yīng)后)SEQIDN0.4和SEQIDN0.6序列號的引物對PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；泳道2(80次PCR反應(yīng)后)SEQIDN0.4和SEQIDN0.8序列號的引物對PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；泳道3 (120次PCR反應(yīng)后)SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.6序列號的引物對PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物。
參照圖4:人基因組DNA斷裂片斷作為固定模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳圖；其中泳道l (50次PCR反應(yīng)后)SEQIDNO.9和SEQIDNO.10序列號的引物對PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物；其中泳道2 (100次PCR反應(yīng)后)SEQIDNO.il和SEQ ID NO. 12序列號的引物對PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物。實施例1
水凝膠共聚化學(xué)固定DNA效率的檢測
(1) 末端修飾的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的制備
將包含金黃色葡萄球菌腸毒素E基因的質(zhì)粒DNA (pUCm-T-SEE,其中see的GenBank登錄號M21319)作為模板，通過PCR擴(kuò)增該基因約850 bp的片段。用于此PCR的兩種引物的堿基序列見SEQIDNO.l和SEQIDNO.2;在引物合成過程中，在上下游引物的5'末端引入了(CH2)6-NH2修飾；PCR反應(yīng)結(jié)束后，回收PCR產(chǎn)物后，GeneQuant定量分析，-20 "C保存待用；
(2) 取5%聚甲基丙烯酰胺凝膠和20%聚甲基丙烯酰胺凝膠液待用；按照下列配方配置凝膠
5%聚甲基丙烯酰胺凝膠20%聚甲基丙烯酰胺凝膠H20 3.167 mL —
10xTBE (pH13) — 3nL
5xTBE (pH8.3) 1 mL —
Acrylamide/Bis儲存液(30%) 0.833 mL —
40%甲基丙烯酰胺溶液 一 15 nL
PCR產(chǎn)物 一 9 nL
TEMED 2.5 1.2
10%AP (過硫酸銨) 25 nL 1.8(3)安裝垂直板型電泳裝置，將所配置的5%聚甲基丙烯酰胺凝膠和20%聚甲 基丙烯酰胺凝膠液分別沿著凝膠的長玻璃片的內(nèi)側(cè)用移液器加至長短玻璃片的 窄縫內(nèi)直至凝膠液溢出，輕輕地將梳子插入凝膠內(nèi)；放置lh后小心拔去梳子， 用濾紙條吸去殘留的液體；將制備好的含有PCR產(chǎn)物的30 pL凝膠注入凹槽，37 'C烘箱內(nèi)放置lh，直至聚合反應(yīng)結(jié)束；將500mL電泳緩沖液(lxTBE)倒入電 泳槽中，合上電泳槽，設(shè)置電泳時間和電壓；160V電泳60min;電泳結(jié)束后， 帶上手套，小心從制膠板上將凝膠剝下，清水洗膠，將膠放入EB染色液中緩慢 搖動，染色20-30min，小心不要將膠撕破；取出用水漂洗后，UV下拍照記錄。 實施例2
固定方法的熱穩(wěn)定性實驗
(1) 末端修飾的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的制備
將包含金黃色葡萄球菌腸毒素E基因的質(zhì)粒DNA (pUCm-T-SEE，其中see 的GenBank登錄號M21319)作為模板，通過PCR擴(kuò)增該基因約850 bp的片段； 用于此PCR的兩種引物的堿基序列見SEQIDNO.l和SEQIDN0.2;在引物合 成過程中，在上下游引物的5，末端引入了(CH2)6-NH2修飾；PCR反應(yīng)結(jié)束后，回 收PCR產(chǎn)物后，GeneQuant定量分析，-20 。C保存待用；
(2) PCR產(chǎn)物的固定
取之前擴(kuò)增、純化后的PCR產(chǎn)物(末端帶有NH2修飾)，取lpL用雙蒸水稀 釋到10ng-l嗎/nL;取稀釋后的PCR產(chǎn)物，100 。C加熱變性5 min后立即置于冰浴 內(nèi)；按以下配方配置聚甲基丙烯酰胺凝膠
聚甲基丙烯酰胺凝膠
10xTBE (pH13)
40%甲基丙烯酰胺儲存液 H20
稀釋變性的PCR產(chǎn)物 TEMED
10%AP (過硫酸銨)
3pL (末端NH2修飾)
1.2 nL 1.8 nL
3pL 15
6nL制備好的凝膠均分成3分注入PCR反應(yīng)管中，37 ""C烘箱內(nèi)放置0.5h，待凝膠 聚合成型。用ixTAE配制1.5X的瓊脂糖凝膠，取聚合反應(yīng)完的甲基丙烯酰胺凝 膠，放置于瓊脂糖凝膠的孔洞中。電泳緩沖液為lxTAE，電壓為120V，電泳45 min，去除吸附于凝膠內(nèi)部和表面的PCR產(chǎn)物。2mL雙蒸水振蕩洗滌凝膠3次后， 吸去凝膠表面水滴，作為模板運(yùn)用于隨后的PCR反應(yīng)中。
(3)以固定的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增
根據(jù)固定的PCR產(chǎn)物的序列信息，設(shè)計以下3對上下游引物SEQIDNO，3 -SEQIDNO.8;通過不同配伍，逐漸延伸所獲得的PCR產(chǎn)物，排除每次PCR反應(yīng) 后殘留PCR產(chǎn)物的影響；在每次PCR反應(yīng)結(jié)束以后，對反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，觀察是否有預(yù)期的特異性條帶生成，如果有則證明該次PCR反應(yīng)之前在凝膠 中仍然有模板DNA的存在，以PCR反應(yīng)的成功次數(shù)來表征該方法的耐熱效果。 實施例3
pUCm-T-SEE質(zhì)粒片段的固定
(1) pUCm-T-SEE的斷裂以及末端修飾 按照常規(guī)方法提取pUCm-T-SEE質(zhì)粒，取純化后的pUCm-T-SEE質(zhì)粒100 pL， 加入甲酸50pL，混勻后置于30 'C水浴中反應(yīng)，反應(yīng)時間由20min;反應(yīng)結(jié)束 后立即加入NaOH乳濁液調(diào)整pH至7.0;按照試劑盒說明書要求，使用DNA膠回 收試劑盒回收經(jīng)過甲酸處理后的質(zhì)粒DNA，用100 pL雙蒸水回收柱上的DNA， 離心管中的液體即為回收的質(zhì)粒DNA;向脫嘌呤的質(zhì)粒溶液中加入25 ^L2.5 mol'L"的乙二胺鹽酸鹽溶液，混勻后加入NaOH乳濁液調(diào)整pH至7.4， 37 'C水浴 中反應(yīng)4h; 4h后加入25pL新配的0.1mol七"的硼氫化鈉溶液，室溫放置l h。最 后加入15pL的20%的乙二胺鹽酸鹽溶液，室溫放置lh，結(jié)束反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束 后，按照DNA回收試劑盒說明書要求，回收質(zhì)粒DNA片段，瓊脂糖電泳檢測反應(yīng)結(jié)果后，-20 "C保存待用；
(2) pUCm-T-SEE片段的固定及熱穩(wěn)定性實驗
將純化得到的帶有末端氨基的pUCm-T-SEE質(zhì)粒片段電泳檢測，選取分子大
小〈850bp的質(zhì)粒片段進(jìn)行割膠回收，得到的終溶液用GeneQuant定量，稀釋到一
定濃度，PCR反應(yīng)驗證模板DNA的存在后，置于-20 "C保存。
按以下配方配置聚甲基丙烯酰胺凝膠
聚甲基丙烯酰胺凝膠
10xTBE (pH13) 3
40%甲基丙烯酰胺溶液 15
H20 6nL
稀釋的變性pUCm-T-SEE質(zhì)粒片段 3
TEMED 1.2^
10%AP (過硫酸銨) 1.8 jiL
制備好的凝膠分裝3分注入PCR反應(yīng)管中，37 "C烘箱內(nèi)放置lh，待凝膠聚 合成型。按照之前方法使用不同引物的配伍進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測化學(xué)方法的熱穩(wěn) 定性，并將部分PCR產(chǎn)物送檢測序。 實施例4
人基因組DNA的固定化
(1) 人基因組DNA的提取
按照說明書的要求，提取人基因組DNA，使用GeneQuant定量；
(2) 人基因組DNA的斷裂以及末端修飾
取純化后的人基因組DNA100pL，加入甲酸50pL，混勻后置于30 "C水浴 中反應(yīng)，反應(yīng)時間5min。反應(yīng)結(jié)束后立即加入NaOH乳濁液調(diào)整pH至7.0;按照 試劑盒說明書要求，使用DNA膠回收試劑盒回收經(jīng)過甲酸處理后的人基因組 DNA，最后用100pL雙蒸水回收柱上的DNA，離心管中的液體即為回收的人基 因組DNA;向液體中加入25nL2.5mol丄"的乙二胺鹽酸鹽溶液，混勻后加入 NaOH乳濁液調(diào)整pH至7.4， 37 。C水浴中反應(yīng)4h; 4h后加入25nL新配的0.1mol.L"的硼氫化鈉溶液，室溫放置lh;最后加入15pL的20%的乙二胺鹽酸
鹽溶液，室溫放置lh，結(jié)束反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，按照DNA回收試劑盒說明書要
求，反復(fù)多次回收人基因組DNA片段，PCR反應(yīng)驗證基因組DNA的完整程度，
-20 'C保存待用；
(3)人基因組DNA片段的固定及熱穩(wěn)定性實驗
按以下配方配置聚甲基丙烯酰胺凝膠
聚甲基丙烯酰胺凝膠
10xTBE (pH13) 3 nL
40%甲基丙烯酰胺溶液 15
H20 6 |xL
人基因組DNA片段 3pL
TEMED 1.2
10%AP (過硫酸銨) 1,8 jiL
制備好的凝膠分裝3分注入PCR反應(yīng)管中，37 'C烘箱內(nèi)放置lh，待凝膠聚 合成型；使用以下引物反復(fù)進(jìn)行PCR檢測，檢測化學(xué)方法的熱穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1. 一種基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，其特征是包括原料選擇、混合和聚合反應(yīng)三個步驟；各步驟的內(nèi)容如下原料選擇選用的原料和用量是10×TBE(pH13)10％；40％甲基丙烯酰胺儲存液10—70％；稀釋變性氨基未端修飾的核酸1μL—5ml；N，N，N，N-四甲基乙二胺1—10％；10％過硫酸銨1—10％；其余為水；混合在配置好的凝膠原料中加入氨基末端修飾的核酸進(jìn)行混合，混合物中含有的核酸量為10-1000ng/3μL；聚合反應(yīng)取5μL混合物置于PCR反應(yīng)管中，37℃放置30分鐘待聚合反應(yīng)結(jié)束后，混合物成型成凝膠狀，末端氨基修飾的核酸即通過共聚反應(yīng)在凝膠中得以固定。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，其特征在 于所述甲基丙烯酰胺單體重量濃度在5% - 30%之間，N,N,N，N-四甲基乙二胺重 量濃度在4%，過硫酸胺重量濃度在6%;核酸的濃度在0.5pg/mL-5(Hig/mL。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，其特征在 于所述混合物的pH值的范圍在7.0-11.0之間，且隨著pH值的增高，DNA的固定效率具有明顯的上升趨勢。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，其特征在于所述的核酸是末端氨基的寡聚核苷酸、末端氨基修飾的PCR產(chǎn)物或末端氨基 修飾的長鏈DNA分子中的一種；當(dāng)待固定的核酸是質(zhì)粒、基因組等長鏈DNA 分子時，需要采用將其長鏈斷裂成100bp-100Kb的D NA碎片，并在其3'或5' 末端引入活性氨基便于后續(xù)的固定。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于凝膠固定核酸的DNA固定方法，其特征在于所述的長鏈DNA采用甲酸處理DNA生成活性醛基，該活性醛基隨后與乙二 胺和硼氫化鈉反應(yīng)隨機(jī)斷裂長鏈DNA，并在斷裂片斷的3'末端引入了活性氨基。
全文摘要
本發(fā)明涉及將DNA固定于凝膠上的方法，特別是涉及一種基于凝膠固定核酸的DNA固定方法及其應(yīng)用；所述的DNA樣本的固定方法包括原料選擇、混合和聚合反應(yīng)三個步驟；各步驟的內(nèi)容如下原料選擇選用的原料和用量是10×TBE(pH13)10％；40％甲基丙烯酰胺儲存液10-70％；稀釋變性氨基末端修飾的核酸1μL-5ml；N，N，N，N-四甲基乙二胺1-10％；10％過硫酸銨1-10％；其余為水；混合在配置好的凝膠原料中加入氨基末端修飾的核酸進(jìn)行混合，混合物中含有的核酸量為10-1000ng/3μL；聚合反應(yīng)取5μL混合物置于PCR反應(yīng)管中，37℃放置30分鐘待聚合反應(yīng)結(jié)束后，混合物成型成凝膠狀，末端氨基修飾的核酸即通過共聚反應(yīng)在凝膠中得以固定；本發(fā)明具有承載量高、末端修飾的核酸分子通過與固相載體之間形成穩(wěn)定的共價鍵實現(xiàn)固定，能夠經(jīng)受PCR反應(yīng)的劇烈條件等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101481733SQ20091000398
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月4日
發(fā)明者厲朝龍, 賈丹梅 申請人:杭州恩氏基因技術(shù)發(fā)展有限公司