能夠中和系統(tǒng)發(fā)育群1和系統(tǒng)發(fā)育群2的a型流感病毒以及b型流感病毒的人結合分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及結合分子例如人單克隆抗體，其結合系統(tǒng)發(fā)育群1和群2的A型流感病毒以及B型流感病毒的血凝素莖區(qū)中的表位，并且具有針對此類流感病毒的廣泛中和活性。公開內(nèi)容提供了編碼結合分子的核酸分子，其序列和包含結合分子的組合物。結合分子可以用于系統(tǒng)發(fā)育群1和2的A型流感病毒以及B型流感病毒的診斷、預防和/或治療中。
【專利說明】能夠中和系統(tǒng)發(fā)育群1和系統(tǒng)發(fā)育群2的A型流感病毒以及B型流感病毒的人結合分子
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學。本發(fā)明特別涉及能夠中和系統(tǒng)發(fā)育群I和系統(tǒng)發(fā)育群2的A型流感病毒的人結合分子。特別地，本發(fā)明涉及能夠中和系統(tǒng)發(fā)育群I和系統(tǒng)發(fā)育群2的A型流感病毒以及B型流感病毒的結合分子。本發(fā)明還涉及由系統(tǒng)發(fā)育群I和2的A型流感病毒并且還優(yōu)選通過B型流感病毒引起的感染的診斷、預防和/或治療。
【背景技術】
[0002]流感感染(也稱為“流感”或“流行性感冒”)是已知針對人類的最常見疾病之一，每年在全世界引起三到五百萬例嚴重疾病和250，000-500, 000例死亡。流感在季節(jié)性流行中快速傳播，影響5-15%的人口，并且增加對衛(wèi)生保健的費用且引起生產(chǎn)力損失(世界衛(wèi)生組織(WHO))。
[0003]存在引起在人和動物中的傳染學的3類流感病毒(A、B和C型)。A型和B型病毒是負責在人中觀察到的流感季節(jié)性流行和大流行的因子。
[0004]A型流感病毒可以基于兩種基因的抗原區(qū)中的變異而分類成流感病毒亞型，所述兩種基因編碼病毒附著和細胞釋放所需的表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。目前，在A型流感病毒中已知16個HA亞型(H1-H16)和九個NA (N1-N9)抗原變體。流感病毒亞型還可參考其系統(tǒng)發(fā)育群進行分類。系統(tǒng)發(fā)育分析(Fouchier等人，2005)已證實HA可細分為兩個主要群(Air，1981):系統(tǒng)發(fā)育群I (本文也稱為“群I”)中的H1、H2、H5和H9亞型等，和系統(tǒng)發(fā)育群2 (或“群2”)中的H3、H4和H7亞型等。A型流感亞型中僅一些(SPHlNl、H1N2和H3N2)在人中循環(huán)，但16個HA和9個NA亞型的所有組合都已在動物中，特別是在鳥類物種中得到鑒定。由A型流感感染的動物通常充當流感病毒的儲庫，并且某些亞型已顯示跨越對人的物種屏障，例如高致病性A型流感毒株H5N1。
[0005]B型流感病毒毒株僅感染人。在B型流感病毒毒株內(nèi)的HA中的抗原變異比在A型毒株內(nèi)觀察到的那些更弱。如由B/Yamagata/16/88 (也稱為B/Yamagata)和B/Victoria/2/87 (B/Victoria)譜系代表的(Ferguson等人,2003),兩個遺傳和抗原上不同的B型流感病毒譜系在人中循環(huán)。盡管由B型流感病毒引起的疾病譜一般比由A型流感病毒引起的那種更溫和，但對B型流感感染仍頻繁觀察到需要住院治療的嚴重疾病。
[0006]處理每年流感流行的目前方法包括每年疫苗接種，優(yōu)選生成異型交叉保護。然而，在人中的循環(huán)流感病毒遭受持久的抗原變化，這需要流感疫苗制劑的每年適應性改變，以確保流感疫苗株和循環(huán)流感毒株之間最緊密的可能匹配。盡管用流感疫苗的每年疫苗接種是預防流感的最佳方法，但抗病毒藥物例如奧司他韋(TamiHu.尼)對于流感感染的預防和治療可以是有效的。然而，顯示針對抗病毒藥物例如奧司他韋的抗性的流感病毒毒株數(shù)目是漸增的。
[0007]可替代方法是開發(fā)基于抗體的預防或治療性處理，以中和多種季節(jié)性和大流行流感病毒。保護不受流感病毒感染的大多數(shù)中和抗體的主要靶是病毒HA蛋白質(zhì)的球狀頭部(HAl部分)，其含有受體結合位點，但遭受在抗體結合位點中伴隨氨基酸置換的持續(xù)遺傳進化(抗原漂移)。 [0008]近來，已鑒定了識別系統(tǒng)發(fā)育群I (包括例如Hl和H5流感亞型)的A型流感病毒的血凝素保守莖區(qū)中的表位的廣泛交叉中和抗體(參見例如W02008/028946)，以及識別系統(tǒng)發(fā)育群2 (包括例如H3和H7亞型)的A型流感病毒的HA莖區(qū)中的高度保守表位的交叉中和抗體(W02010/130636)。這些抗體的中和活性受限于群I或群2流感病毒。此外，這些抗體不能結合且中和B 型流感病毒。
[0009]此外，W02010/010466公開了與血凝素結合并且能夠結合且中和群I (包括Hl和H5亞型)和群2 (包括H3和H7亞型)的A型流感亞型的人抗體FI6。這種抗體也不結合來自B型流感病毒的HA。
[0010]此外，US2009/0092620公開了識別Hl和H3亞型的血凝素中以及屬于B/Victoria和B/Yamagata組的B型流感病毒的血凝素上存在的抗原結構的鼠抗體。該抗體抑制幾個H3N2毒株的血凝活性，暗示這種抗體結合HA的球狀頭部中的表位。
[0011]考慮到由A型流感和B型流感病毒引起的呼吸系統(tǒng)疾病的嚴重性，以及季節(jié)性流行具有的高經(jīng)濟影響和大流行的持續(xù)危險，存在用于預防和治療A和B型流感亞型的有效方法的持續(xù)需要。因此對結合分子優(yōu)選廣譜中和性人結合分子仍存在需求，所述結合分子能夠交叉中和系統(tǒng)發(fā)育群I和系統(tǒng)發(fā)育群2的A型流感病毒，并且還優(yōu)選交叉中和B型流感病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明提供了能夠特異性結合來自系統(tǒng)發(fā)育群I (包括例如包含Hl和H5亞型的HA的流感病毒)的A型流感病毒毒株，和來自系統(tǒng)發(fā)育群2 (包括例如包含H3和H7亞型的HA的流感病毒)的A型流感病毒毒株的結合分子。在一個實施方案中，結合分子還具有針對來自系統(tǒng)發(fā)育群I和系統(tǒng)發(fā)育群2的A型流感病毒毒株的中和活性。在一個實施方案中，結合分子還能夠特異性結合B型流感病毒毒株,包括例如B/Yamagata和/或B/Victoria譜系的B型流感病毒毒株。在一個實施方案中，結合分子還能夠中和B型流感病毒毒株，包括例如B/Yamagata和/或B/Victoria譜系的B型流感病毒毒株。在一個實施方案中，結合分子能夠在體內(nèi)中和A型流感和/或B型流感病毒毒株。在一個實施方案中，結合分子結合A和B型流感病毒的HA蛋白質(zhì)莖區(qū)中的保守表位。在一個實施方案中，結合分子不具有血凝抑制(HI)活性。
[0013]本發(fā)明因此提供了結合血凝素蛋白莖區(qū)中的表位的結合分子，所述表位在系統(tǒng)發(fā)育群I內(nèi)的A型流感病毒亞型和系統(tǒng)發(fā)育群2內(nèi)的流感病毒亞型以及B型流感病毒亞型之間共享，并且因此涉及在群I和群2的A型流感病毒亞型和B型流感病毒之間交叉反應的結合分子。本發(fā)明還涉及編碼人結合分子的至少結合區(qū)的核酸分子。
[0014]本發(fā)明的結合分子和/或核酸分子適合于用作用于A型流感病毒和B型流感病毒的通用預防、診斷和/或治療試劑，甚至與成因流感亞型無關。
[0015]推測根據(jù)本發(fā)明的結合分子結合迄今未知且高度保守的表位，所述表位不傾向于或更少傾向于抗原漂移或轉變。特別地，這個表位在屬于系統(tǒng)發(fā)育群I和系統(tǒng)發(fā)育群2的流感病毒以及B型流感病毒之間共享。還包含本發(fā)明的結合分子鑒定和/或表征這些表位的用途。
[0016]本發(fā)明還提供了本發(fā)明的人結合分子和/或核酸分子在受試者的診斷、預防和/或治療中的用途，所述受試者具有流感病毒感染，或處于發(fā)展流感病毒感染的危險中。此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的人結合分子和/或核酸分子在此類流感感染的診斷/檢測中的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1顯示通討CR9114陽斷H1、H5、H9、H3和H7HA的構象奪化。(A)CR9114與A/New Caledonia/20/1999 (H1)A/Viet Nam/1203/2004 (H5),A/Hong Kong/1073/1999 (H9)、A/Wisconsin/67/2005 (H3)和 A/Netherlands/219/2003 (H7)的表面表達的 rHA 的多種構象-未切割的前體(HAO);中性pH，切割的(HA);融合pH，切割的(融合pH)-的FACS結合。結合表示為與未經(jīng)處理的rHA (HAO)的結合百分比。(B)CR9114與如上的表面表達的HA的FACS結合，除了在使切割的HA暴露于pH4.9前加入mAb CR9114之外。
[0018]M_2顯示MAb CR9114分別與CR6261和CR8020競爭結合Hl和H3。使用生物層干涉量度法測量的，所示mAb與由IOOnM CR6261或CR9114飽和的A/NewCaledonia/20/1999 (HlNl)的固定 HA (小圖 A 和 B)、或與由 IOOnM CR8020 或 CR9114 飽和的A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)的固定HA (小圖C和D)的另外結合程度。
[0019]證實CR9114在使用B型流感(B/Florida/04/2006)病毒的小鼠致死性攻擊模型中的預防功效。A.在攻擊前的第-1天時，用15mg/kg CR9114或媒介物對照靜脈內(nèi)處理的小鼠的卡普蘭-邁耶生存曲線，隨后為在第O天時25LD B/Florida/04/2006的攻擊。B.相對于第O天的平均體重變化(％)。條代表平均值的95%CI。如果小鼠死亡/在研究過程中實施安樂死，則末次觀察到的體重推進。C.中值臨床得分。條代表四分位數(shù)間距。臨床得分說明:0=無臨床體征；1=皮毛粗糙；2=皮毛粗糙,在處理過程中較少反應；3=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在處理過程中較少反應；4=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，對操作/處理無活躍反應。
【具體實施方式】
[0020]如本發(fā)明中使用的術語定義在下文給出。
[0021]如本文使用的術語“包括”視為隨后為單詞“但不限于”。
[0022]如本文使用的，術語“結合分子”指完整免疫球蛋白包括單克隆抗體，例如嵌合、人源化或人單克隆抗體，或包含免疫球蛋白片段的抗原結合和/或可變結構域，所述免疫球蛋白片段與完整免疫球蛋白競爭特異性結合免疫球蛋白的結合配偶體例如HA。與結構無關，抗原結合片段結合由完整免疫球蛋白識別的相同抗原。抗原結合片段可以包含肽或多肽，所述肽或多肽包含結合分子氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250個鄰接氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0023]如本文使用的，術語“結合分子”包括本領域已知的所有免疫球蛋白種類和亞類。取決于其重鏈恒定結 構域的氨基酸序列，結合分子可以分成完整抗體的五個主要種類:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中幾個還可以分成亞類(同種型)，例如IgAl、IgA2、IgGUIgG2、IgG3和 IgG4。[0024]抗原結合片段尤其包括Fab、F (ab，)、F (ab，)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、含有足以對(多)肽賦予特異性抗原結合的至少免疫球蛋白片段的(多)肽等。上述片段可以合成產(chǎn)生或通過完整免疫球蛋白的酶促或化學切割產(chǎn)生，或他們可以通過重組DNA技術遺傳改造。生產(chǎn)方法是本領域眾所周知的，并且例如在Antibodies:A Laboratory Manual,Editedby:E.Harlow and D,LaneC1988),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York中描述，所述參考文獻引入本文作為參考。結合分子或其抗原結合片段可以具有一個或多個結合位點。如果存在超過一個結合位點，則結合位點可以彼此相同或它們可以是不同的。
[0025]結合分子可以是裸露或未綴合的結合分子，但還可以是免疫綴合物的部分。裸露或未綴合的結合分子意指與效應部分或標簽未綴合、可操作地連接或以其他方式物理或功能結合的結合分子，所述效應部分或標簽例如尤其是毒性物質(zhì)、放射性物質(zhì)、脂質(zhì)體、酶。應當理解裸露或未綴合的結合分子不排除這樣的結合分子，除了通過附著效應部分或標簽外，所述結合分子已進行穩(wěn)定、多聚化、人源化或以任何其他方式操作。相應地，隨同包括所有翻譯后修飾的裸露和未綴合的結合分子，包括其中修飾通過重組結合分子生產(chǎn)細胞在天然結合分子生產(chǎn)細胞環(huán)境中作出，并且在起始結合分子制備后人工引入。當然，術語裸露或未綴合的結合分子不排除結合分子在施用于機體后與效應細胞和/或分子形成功能結合的能力，因為此類相互作用中的一些是必需的，以便發(fā)揮生物學效應。結合的效應基團或標簽的缺乏因此在定義中應用于在體外而不是在體內(nèi)的裸露或未綴合的結合分子。
[0026]如本文使用的，術語“生物學樣品”包含多個樣品類型，包括血液及其他生物起源的液體樣品、固體組織樣品例如活組織檢查標本或組織培養(yǎng)，或由其衍生的細胞及其后代。該術語還包括在其獲得后已以任何方式操作的樣品，例如通過用試劑處理、溶解、或富集某些組分例如蛋白質(zhì)或多核苷酸。該術語包含得自任何物種的多個種類的臨床樣品，并且還包括培養(yǎng)中的細胞、細胞上清液和細胞裂解產(chǎn)物。
[0027]如本文使用的術語“互補決定區(qū)”(CDR)意指在結合分子例如免疫球蛋白的可變區(qū)內(nèi)的序列，所述序列通常在很大程度上促成抗原結合位點，所述抗原結合位點在形狀和電荷分布中與抗原上識別的表位互補。CDR區(qū)可以是對于蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的線性表位、不連續(xù)表位或構象表位特異性的，如以其天然構象在蛋白質(zhì)上存在的，或在一些情況下，如例如通過在SDS中溶解而變性的蛋白質(zhì)上存在的。表位還可以由蛋白質(zhì)的翻譯后修飾組成。
[0028]如本文使用的，術語“缺失”指示氨基酸或核苷酸序列中的變化，其中與參考分子通常為天然存在的分子相比較，一個或多個氨基酸或核苷酸殘基分別不存在。
[0029]如本文使用的術語“表達調(diào)節(jié)核酸序列”指在特定宿主生物中可操作地連接的編碼序列表達所需和/或影響可操作地連接的編碼序列表達的多核苷酸序列，例如尤其是合適的轉錄起始、終止、啟動子、增強子序列；阻遏或激活序列；有效RNA加工信號例如剪接和多腺苷酸化信號；穩(wěn)定細胞質(zhì)mRNA的序列；增強翻譯效率的序列(例如核糖體結合位點)；增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；和需要時 ，增強蛋白質(zhì)分泌的序列可以是在選擇的宿主生物中顯示活性的任何核酸序列，并且可以衍生自編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因對于宿主生物是同源或異源的。表達調(diào)節(jié)序列的鑒定和采用對于本領域技術人員是常規(guī)的。
[0030]如本文使用的，術語“功能變體”指包含核苷酸和/或氨基酸序列的結合分子，與參考結合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比較，所述結合分子的核苷酸和/或氨基酸序列通過一個或多個核苷酸和/或氨基酸改變，并且能夠與結合配偶體即流感病毒競爭結合參考結合分子。換言之，參考結合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或改變由核苷酸序列編碼或含有氨基酸序列的結合分子的結合特征，即結合分子仍能夠識別且結合其靶。功能變體可以具有保守序列修飾包括核苷酸和氨基酸置換、添加和缺失。這些修飾可以通過本領域已知的標準技術引入，例如定點誘變和隨機PCR介導的誘變，并且可以包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
[0031]保守氨基酸置換包括其中氨基酸殘基替換為具有相似結構或化學性質(zhì)的氨基酸殘基的置換。具有相似側鏈的氨基酸殘基家族已在本領域中進行限定。這些家族包括具有下述側鏈的氨基酸:堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側鏈(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。對于技術人員明確的是，可以采用與上文使用的分類法不同的其他氨基酸殘基家族分類法。此外，變體可以具有非保守氨基酸置換，例如氨基酸由具有不同結構或化學性質(zhì)的氨基酸殘基的替換。相似的較小變化還可以包括氨基酸缺失或插入，或兩者。確定哪些氨基酸殘基可以進行置換、插入或缺失而不取消免疫活性的指導可以使用本領域眾所周知的計算機程序發(fā)現(xiàn)。
[0032]核苷酸序列 中的突變可以是在基因座處作出的單個改變(點突變)，例如轉換或顛換突變，或可替代地，多個核苷酸可以在單個基因座處進行插入、缺失或改變。此外，一個或多個改變可以在核苷酸序列內(nèi)的任何數(shù)目的基因座處作出。突變可以通過本領域已知的任何合適方法執(zhí)行。
[0033]如本文與A型流感病毒有關使用的術語“流感病毒亞型”指特征在于血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)病毒表面蛋白質(zhì)的多種組合的A型流感病毒變體。根據(jù)本發(fā)明，流感病毒亞型可以通過其H編號提及，例如“包含Hl或Η3亞型的HA的流感病毒”、或“Η1流感病毒％Η3流感病毒”，或通過H編號和N編號的組合提及，例如“流感病毒亞型Η3Ν2”或“Η3Ν2”。
[0034]術語流感病毒“亞型”特別包括每個亞型內(nèi)的所有個別流感病毒“毒株”，其通常由突變產(chǎn)生且顯示不同致病概況。此類毒株也可以被稱為病毒亞型的多種“分離物”。相應地，如本文使用的，術語“毒株”和“分離物”可以互換使用。關于人流感病毒毒株或分離物的目前命名法包括第一次分離的地理位置、毒株編號和分離年份，通常伴隨在圓括號中給出的HA和NA的抗原描述，例如A/Moscow/10/00(H3N2)。非人毒株還在命名法中包括起源宿主。
[0035]如本文與本發(fā)明的結合分子有關使用的術語“中和”指抑制流感病毒復制性感染靶細胞的結合分子，與通過其實現(xiàn)中和的機制無關。因此，中和可以例如通過抑制病毒與細胞膜的附著或粘附來實現(xiàn)，或通過在病毒與靶細胞附著后抑制病毒和細胞膜的融合等來實現(xiàn)。
[0036]如本文與本發(fā)明的結合分子有關使用的術語“交叉中和”指本發(fā)明的結合分子中和A和/或B型流感病毒的不同亞型的能力。
[0037]如本文使用的，術語“宿主”意指載體例如克隆載體或表達載體已引入其內(nèi)的生物或細胞。生物或細胞可以是原核或真核的。優(yōu)選地，宿主是分離的宿主細胞，例如培養(yǎng)中的宿主細胞。術語“宿主細胞”僅表明細胞被修飾用于本發(fā)明的結合分子的(過)表達，并且包括最初表達這些結合分子的B細胞，并且所述細胞已通過永生化、擴增、表達增強等進行修飾，以過表達結合分子。應當理解術語宿主不僅意指特定主題生物或細胞，同樣還指此類生物或細胞的后代。因為某些修飾可以由于突變或環(huán)境影響而在后續(xù)代中發(fā)生，所以此類后代事實上可能不等同于親本生物或細胞，但仍包括在如本文使用的術語“宿主”的范圍內(nèi)。
[0038]當應用于如本文定義的結合分子時，術語“人”指直接衍生自人或基于人種系序列的分子。當結合分子衍生自或基于人序列且隨后修飾時，如說明書自始至終使用的它仍視為人的。換言之，當應用于結合分子時，術語人意欲包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的結合分子，或基于在人或人淋巴細胞中出現(xiàn)的可變或恒定區(qū)且以一些形式修飾的結合分子。因此，人結合分子可以包括未由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基，包含置換和/或缺失(例如在體外通過例如隨機或定點誘變或者在體內(nèi)通過體細胞突變引入的突變)。如本文使用的“基于”指這樣的情況:核酸序列可以由模板確切拷貝，或具有較小突變，例如通過易錯PCR方法，或合成制備確切匹配模板或具有較小修飾。
[0039]術語“插入”也稱為術語“添加”指示氨基酸或核苷酸序列中的變化，導致與親本序列相比較分別的一個或多個氨基酸或核苷酸殘基的添加。
[0040]當應用于如本文定義的結合分子時，術語“分離的”指這樣的結合分子，其基本上不含其他蛋白質(zhì)或多肽，特別是不含具有不同抗原特異性的其他結合分子，并且還基本上不含其他細胞材料和/或化學制品。例如，當結合分子重組產(chǎn)生時，它們優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基組分，并且當結合分子通過化學合成產(chǎn)生時，它們優(yōu)選基本上不含化學前體或其他化學制品，即它們與涉及蛋白質(zhì) 合成的化學前體或其他化學制品分離。當應用于如本文定義的編碼結合分子的核酸分子時，術語“分離的”意指這樣的核酸分子，其中編碼結合分子的核苷酸序列不含其他核苷酸序列，特別是編碼結合其他結合配偶體的結合分子的核苷酸序列。此外，術語“分離的”指基本上與其他細胞組分分離的核酸分子，所述細胞組分在其天然宿主中天然伴隨天然核酸分子，例如核酶、聚合酶、或它天然與之結合的基因組序列。此外，“分離的”核酸分子例如cDNA分子當通過重組技術產(chǎn)生時，可以基本上不含其他細胞材料或培養(yǎng)基，或當化學合成時基本上不含化學前體或其他化學制品。
[0041]如本文使用的術語“單克隆抗體”指具有單一特異性的抗體分子的制備。單克隆抗體展示對于特定表位的單一結合特異性和親和力。相應地，術語“人單克隆抗體”指展示單一結合特異性的抗體，其具有衍生自或基于人種系免疫球蛋白序列或者衍生自完全合成序列的可變和恒定區(qū)。制備單克隆抗體的方法與結合特異性無關。
[0042]如本文應用于物體時使用的術語“天然存在的”指物體或化合物可以在自然界中找到的事實。例如，可以從自然界中的來源分離的存在于生物中，并且在實驗室中并未有意識地人為修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
[0043]如本發(fā)明中使用的術語“核酸分子”指聚合形式的核苷酸，并且包括RNA、cDNA、基因組DNA的有義和反義鏈，以及上述的合成形式和混合聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脫氧核苷酸或修飾形式的任一類型的核苷酸。該術語還包括單鏈和雙鏈形式的DNA。此外，多核苷酸可以包括通過天然存在和/或非天然存在的核苷酸鍵合連接在一起的任一或兩種天然存在和經(jīng)修飾的核苷酸。核酸分子可以是化學或生物化學修飾的，或可以含有非天然或衍生的核苷酸堿基，如本領域技術人員容易理解的。此類修飾包括例如標記、甲基化、天然存在的核苷酸中的一個或多個由類似物的置換、核苷酸間修飾例如不帶電鍵合(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶電鍵合(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、懸垂部分(例如多肽)、嵌合劑(例如吖啶、補骨脂素等)、螯合劑、烷化劑和經(jīng)修飾的鍵合(例如α異頭核酸等)。上述術語還意欲包括任何拓撲構象，包括單鏈、雙鏈、部分雙鏈體、三聯(lián)體、發(fā)夾、環(huán)狀和掛鎖狀(padlocked)構象。還包括的是在其經(jīng)由氫鍵合和其他化學相互作用結合指定序列的能力中模擬多核苷酸的合成分子。此類分子是本領域已知的，并且包括例如其中肽鍵合代替分子主鏈中的磷酸酯鍵合的那些。提及核酸序列包含其互補體，除非另有說明。因此，提及具有特定序列的核酸分子應理解為包含其互補鏈，與其互補序列。互補鏈也是有用的，例如用于反義療法、雜交探針和PCR引物等。
[0044]術語“可操作地連接”指兩個或更多個核酸序列元件，其通常是物理連接的并處于彼此的功能關系中。例如，如果啟動子能夠起始或調(diào)節(jié)編碼序列的轉錄或表達，則啟動子與編碼序列可操作地連接，在所述情況下編碼序列應理解為“處于啟動子的控制下”。
[0045]“藥學可接受的賦形劑”意指與活性分子例如藥物、試劑或結合分子組合用于制備適宜或方便劑型的任何惰性物質(zhì)?！八帉W可接受的賦形劑”是在使用的劑量和濃度對于接受者無毒的賦形劑，并且與包含藥物、試劑或結合分子的制劑的其他成分相容。藥學可接受的賦形劑是本領域廣泛應用且已知的。
[0046]如本文使用的，提及結合分子例如抗體及其結合配偶體例如抗原的相互作用的術語“特異性結合”意指相互作用取決于結合配偶體上的特定結構例如抗原決定簇或表位的存在。換言之，即使當結合配偶體存在于其他分子或生物的混合物中時，抗體也優(yōu)先結合或識別結合配偶體。結合可以通過共價或非共價相互作用或兩者的組合介導。再換言之，術語“特異性結合”意指免疫特異性結合抗原決定簇或表位，并且不免疫特異性結合其他抗原決定簇或表位。如通過例如放射性免疫測定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、BIAC0RE或本領域已知的其他測定法測量的，免疫特異性結合抗原的結合分子可以以更低親和力結合其他肽或多肽。免疫特異性結合抗原的結合分子或其片段可以與攜帶相同表位的有關抗原交叉反應。優(yōu)選地，免疫特異性結合抗原的結合分子或其片段可以不與其他抗原交叉反應。
[0047]如本文使用的，“置換”指示一個或多個氨基酸或核苷酸分別由不同氨基酸或核苷酸的替換。
[0048]術語“治療有效量”指如本文定義的結合分子的量，其有效預防、改善和/或治療由B型流感病毒感染產(chǎn)生的狀況。如本文使用的改善可以指可見或可察覺的疾病癥狀、病毒血癥或流感感染的任何其他可測量表現(xiàn)的減少。
[0049]術語“治療”指治愈或停止或至少延緩疾病進展的治療性處理以及防護或預防措施。需要治療的人包括已遭受由流感病毒感染產(chǎn)生的狀況的人，以及其中待預防由流感病毒感染的人。部分或完全從由流感病毒感染恢復的受試者也可能需要治療。預防包含抑制或減少流感病毒的傳播或者抑制或減少與由流感病毒感染相關的一種或多種癥狀的開始、發(fā)展或進展。
[0050]術語“載體”指示第二種核酸分子可以插入其內(nèi)用于引入宿主內(nèi)的核酸分子，所述核酸分子在所述宿主內(nèi)復制且在一些情況下表達。換言之，載體能夠轉運它已與之連接的核酸分子。如本文使用的術語“載體”考慮了克隆以及病毒載體。載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)以及衍生自細菌噬菌體或植物或動物(包括人)病毒的載體。載體包含由提議的宿主識別的復制起點，和在表達載體的情況下，由宿主識別的啟動子及其他調(diào)節(jié)區(qū)。含有第二種核酸分子的載體通過轉化、轉染或通過利用病毒進入機制引入細胞內(nèi)。特定載體能夠在它們引入其內(nèi)的宿主中自主復制(例如具有細菌復制起點的載體可以在細菌中復制)。其他載體可以在引入宿主內(nèi)之后整合到宿主的基因組內(nèi)，并且因此連同宿主基因組一起復制。
[0051]詳沭
[0052]在第一個方面，本發(fā)明包含能夠特異性結合系統(tǒng)發(fā)育群I的A型流感病毒亞型和系統(tǒng)發(fā)育群2的A型流感病毒亞型的血凝素(HA)的結合分子。在一個實施方案中，結合分子能夠中和系統(tǒng)發(fā)育群I和系統(tǒng)發(fā)育群2的A型流感病毒亞型。本發(fā)明的結合分子因此是獨特的，因為它們能夠交叉中和群IA型流感病毒毒株和群2A型流感病毒毒株。在一個實施方案中，結合分子能夠中和選自H1、H2、H5、H6、H8、H9和Hll亞型的至少一個或多個、優(yōu)選兩個或更多個、優(yōu)選三個或更多個、優(yōu)選四個或更多個、甚至更優(yōu)選五個或更多個群IA型流感病毒亞型，和選自H3、H4、H7和HlO亞型的至少一個或多個、優(yōu)選兩個或更多個、優(yōu)選三個或更多個群2A型流感病毒亞型。在一個實施方案中，結合分子能夠特異性結合B型流感病毒亞型的血凝素(HA)。在另一個實施方案中，結合分子能夠中和B型流感病毒。在一個實施方案中，結合分子能夠在體內(nèi)中和A和/或B型流感病毒。A和B型流感病毒毒株可以是人和非人流感病毒毒株(即，得自非人動物，例如鳥)。
[0053]優(yōu)選地，結合分子是人結合分子。在優(yōu)選實施方案中，結合分子是人抗體或其抗原結合片段。
[0054]在一個實施方案中，結合分子衍生自VH1-69種系基因。因此，結合分子都使用相同的VH1-69種系編碼的構架。
[0055]在一個實施方案中，結合分子優(yōu)選抗體和HA的結合相互作用排他地通過重鏈可變序列介導。
[0056]在一個實施方案中，結合分子包括包含SEQ ID NO: 133或SEQ ID NO: 139的氨基酸序列的重鏈CDR1,包含SEQ ID NO: 134,SEQ ID NO: 140或SEQ ID NO: 151的氨基酸序列的重鏈 CDR2，和包含選自 SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 152、SEQID NO: 161和SEQ ID NO: 162的氨基酸序列的重鏈⑶R3。本發(fā)明的結合分子的⑶R區(qū)顯示于表 7 中。CDR 區(qū)根據(jù) Kabat 等人(1991)如 Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest中所述。
[0057]流感病毒通過下述感染細胞:與靶細胞的細胞表面上的唾液酸殘基結合，并且在轉移到胞內(nèi)體內(nèi)之后，通過使其膜與胞內(nèi)體膜融合且將基因組-轉錄酶復合物釋放到細胞內(nèi)。受體結合和膜融合過程都由HA糖蛋白介導。A型流感病毒的HA包含兩個結構上不同的區(qū)域，即含有負責病毒附著至靶細胞的受體結合位點并涉及HA的血凝活性的球狀頭部區(qū)，和含有病毒包膜和細 胞的胞內(nèi)體膜之間的膜融合所需的融合肽的莖區(qū)。HA蛋白質(zhì)是其中每個單體由兩個二硫鍵連接的糖肽HAl和HA2組成的三聚體，所述HAl和HA2在感染過程中通過前體(HAO)的蛋白酶解切割產(chǎn)生。切割是病毒感染力必需的，因為它是使HA準備用于膜融合所需的，以允許構象變化。準備好的分子的活化在胞內(nèi)體中以pH5-pH6的低pH發(fā)生，并且需要HA結構中的廣泛變化。用于其參與膜融合過程的HA準備和活化階段各自呈現(xiàn)用于例如通過單克隆抗體抑制的不同靶。在一個實施方案中，結合分子能夠阻斷與膜融合相關的PH誘導的HA中的構象變化。
[0058]本發(fā)明的結合分子可能能夠特異性結合HA蛋白質(zhì)的HAO、HAl和/或HA2亞基。它們可能能夠特異性結合HA蛋白質(zhì)的HAO、HAl和/或HA2亞基上的線性或結構和/或構象表位。HA分子可以由病毒純化或重組產(chǎn)生且任選在使用前分離?？商娲兀琀A可以在細胞表面上表達。在一個實施方案中，本發(fā)明的結合分子能夠特異性結合HA莖區(qū)中的表位。在一個實施方案中，結合分子結合在HA的融合前構象中可接近的表位。
[0059]本發(fā)明的結合分子可能能夠特異性結合流感病毒，所述流感病毒是有活力的、活的和/或傳染性的，或處于滅活/減毒形式。用于滅活/減毒病毒例如流感病毒的方法是本領域眾所周知的，并且包括但不限于用福爾馬林、β -丙內(nèi)酯(BPL)、硫柳汞和/或紫外線處理。
[0060]本發(fā)明的結合分子還可能能夠特異性結合流感病毒的一個或多個片段，例如尤其是衍生自A和/或B型流感病毒亞型的一種或多種蛋白質(zhì)和/或(多)肽或者一種或多種重組產(chǎn)生的A和/或B型流感病毒的蛋白質(zhì)和/或多肽的制劑。多種A和B型流感毒株的蛋白質(zhì)的核苷酸和/或氨基酸序列可以在GenBank數(shù)據(jù)庫、NCBI流感病毒序列數(shù)據(jù)庫、流感序列數(shù)據(jù)庫(ISD)、EMBL數(shù)據(jù)庫和/或其他數(shù)據(jù)庫中找到。在各自的數(shù)據(jù)庫中找到此類序列完全在技術人員的范圍內(nèi)。
[0061]在另一個實施方案中，本發(fā)明的結合分子能夠特異性結合上述蛋白質(zhì)和/或多肽的片段 ，其中所述片段至少包含由本發(fā)明的結合分子識別的表位。如本文使用的“表位”是能夠以足夠高的親和力與本發(fā)明的結合分子結合以形成可檢測的抗原結合分子復合物的部分。
[0062]本發(fā)明的結合分子可能能夠或不能特異性結合HA的細胞外部分(本文也稱為可溶性 HA (sHA))。
[0063]本發(fā)明的結合分子可以是完整的免疫球蛋白分子例如多克隆或單克隆抗體，或者結合分子可以是其抗原結合片段，包括但不限于重和輕鏈可變區(qū)、Fab、F (ab’)、F (ab’)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(qū)(⑶R)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、和含有足以賦予與流感病毒毒株或其片段的特異性抗原結合的至少免疫球蛋白片段的(多)肽等。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的結合分子是人單克隆抗體和/或其抗原結合片段。結合分子還可以是納米抗體、α體(alphabody)、親和體、FN3-結構域支架及基于(人)重復蛋白質(zhì)(如Adnectin、Anticalin、Darpin等)中的結構域的其他支架、或包含表位結合序列的其他支架。
[0064]本發(fā)明的結合分子可以以非分離或分離形式使用。此外，本發(fā)明的結合分子可以單獨或在包含本發(fā)明的至少一種結合分子(或其變體或片段)的混合物中、和/或與結合流感且具有流感病毒抑制效應的其他結合分子一起使用。換言之，結合分子可以組合使用，例如作為包含本發(fā)明的兩種或更多種結合分子、其變體或片段的藥物組合物使用。例如，具有不同但互補的活性的結合分子可以在單一療法中組合，以實現(xiàn)所需預防、治療或診斷效應，但可替代地，具有相同活性的結合分子也可以在單一療法中組合，以實現(xiàn)所需預防、治療或診斷效應。任選地，混合物還包含至少一種其他治療試劑。優(yōu)選地，治療試劑例如M2抑制劑(例如金剛燒胺(amant i dine )、金剛乙胺)和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如扎那米韋、奧司他韋)用于流感病毒感染的預防和/或治療中。
[0065]一般地，根據(jù)本發(fā)明的結合分子可以以這樣的親和常數(shù)(Kd值)結合其結合配偶體，即群I的A型流感病毒(例如HlNl)和群2的A型流感病毒(例如H3N2)、和/或B型流感病毒、和/或其片段，所述親和常數(shù)低于0.2x10_4M、1.0x10_5M、1.0x10_6M、1.0x10_7M，優(yōu)選低于1.0×10-8Μ，更優(yōu)選低于1.0×10-9Μ，更優(yōu)選低于1.0×10-10Μ，甚至更優(yōu)選低于1.0x1O-11M,并且特別低于1.0×10_12Μ。親和常數(shù)可以對于抗體同種型而改變。例如，關于IgM同種型的親和結合指至少約1.0xlO-7M的結合親和力。親和常數(shù)可以例如使用表面等離振子共振例如使用 BIAC0RE 系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala,瑞典)進行測量。
[0066]本發(fā)明的結合分子顯示出中和活性。中和活性可以例如如本文描述的進行測量。測量中和活性的可替代測定法在例如WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis andSurveillance, Geneva: World Health Organisation, 2005,版本 2002.5 中描述。
[0067]一般地，根據(jù)本發(fā)明的結合分子具有50 μ g/ml或更少的中和活性，優(yōu)選20 μ g/ml或更少，更優(yōu)選?0 μ g/ml或更少的中和活性，甚至更優(yōu)選5 μ g/ml或更少，如在如實施例6中所述的體外病毒中和測定法(VNA)中測定的。根據(jù)本發(fā)明的結合分子可以結合以可溶形式例如在樣品或懸浮液中的流感病毒或其片段，或可以結合與載體或基底結合或附著的流感病毒或其片段，所述載體或基底例如微量滴定板、膜和珠等。載體或基底可以由玻璃、塑料(例如聚苯乙烯)、多糖、尼龍、硝酸纖維素或特氟隆等制成。此類載體的表面可以是固體或多孔的，并且具有任何方便的形狀。此外，結合分子可以結合以純化/分離或非純化/非分離形式的流感病毒。
[0068]如上文討論的，本發(fā)明涉及能夠識別且結合流感血凝素蛋白(HA)中的表位的分離的人結合分子，其中所述結合分子具有針對系統(tǒng)發(fā)育群I的A型流感病毒和系統(tǒng)發(fā)育群2的A型流感病毒的中和活性。根據(jù)本發(fā)明，因此已顯示本發(fā)明的結合分子交叉中和屬于兩個系統(tǒng)發(fā)育群的流感病毒亞型?；诒疚囊压_的內(nèi)容，技術人員可以確定抗體是否事實上與來自不同亞型的HA蛋白質(zhì)交叉反應，并且還可以確定它們是否能夠在體外和/或在體內(nèi)中和不同亞型的流感病毒。
[0069]在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的結合分子選自:
【權利要求】
1.一種分離的結合分子，其能夠特異性結合系統(tǒng)發(fā)育群I的A型流感病毒亞型和系統(tǒng)發(fā)育群2亞型的A型流感病毒亞型的血凝素蛋白(HA)莖區(qū)中的表位，并且能夠中和系統(tǒng)發(fā)育群I和系統(tǒng)發(fā)育群2的A型流感病毒亞型，其特征在于所述結合分子還能夠特異性結合B型流感病毒亞型的血凝素蛋白(HA)。
2.根據(jù)權利要求1的結合分子，其中所述結合分子能夠中和B型流感病毒亞型。
3.根據(jù)權利要求1或2的結合分子，其中所述結合分子能夠中和選自包含Hl、H2、H5、H6、H8、H9和Hll亞型的HA的A型流感病毒的至少一個或多個群IA型流感病毒亞型，和選自包含H3、H4、H7和HlO亞型的HA的A型流感病毒的至少一個或多個群2A型流感病毒亞型，和至少一個或多個B型流感病毒亞型。
4.根據(jù)前述權利要求中任一項的結合分子，其中所述結合分子不具有血凝抑制活性。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項的結合分子，其中所述結合分子包括包含SEQIDNO: 133 或 SEQ ID NO: 139 的氨基酸序列的重鏈 CDRl，包含 SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 140或SEQ ID NO: 151的氨基酸序列的重鏈CDR2，和包含選自SEQ ID NO: 135,SEQ ID NO: 141,SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 161 和 SEQ ID NO: 162 的氨基酸序列的重鏈CDR3。
6.根據(jù)前述權利要求中任一項的結合分子，其中所述結合分子選自: a)包含SEQ ID NO: 133 的重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO: 134 的重鏈 CDR2 區(qū)、和 SEQ IDNO: 135的重鏈⑶R3區(qū)的結合分子，
b)包含SEQ ID NO: 139 的重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO: 140 的重鏈 CDR2 區(qū)、和 SEQ IDNO: 141的重鏈⑶R3區(qū)的結合分子， c)包含SEQ ID NO: 139 的重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO: 134 的重鏈 CDR2 區(qū)、和 SEQ IDNO: 145的重鏈⑶R3區(qū)的結合分子， d)包含SEQ ID NO: 139 的重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO: 151 的重鏈 CDR2 區(qū)、和 SEQ IDNO: 152的重鏈⑶R3區(qū)的結合分子， e)包含SEQ ID NO: 139 的重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO: 134 的重鏈 CDR2 區(qū)、和 SEQ IDNO: 152的重鏈⑶R3區(qū)的結合分子， f)包含SEQ ID NO: 139 的重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO: 151 的重鏈 CDR2 區(qū)、和 SEQ IDNO: 161的重鏈⑶R3區(qū)的結合分子， g)包含SEQ ID NO: 139 的重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO: 151 的重鏈 CDR2 區(qū)、和 SEQ IDNO: 162的重鏈⑶R3區(qū)的結合分子，和 h)包含SEQ ID NO: 139 的重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO: 134 的重鏈 CDR2 區(qū)、和 SEQ IDNO: 141的重鏈⑶R3區(qū)的結合分子。
7.根據(jù)前述權利要求中任一項的結合分子，其中所述結合分子包括包含SEQIDNO: 139的氨基酸序列的重鏈⑶Rl區(qū)、包含SEQ ID NO: 134的氨基酸序列的重鏈⑶R2區(qū)、和包含SEQ ID NO: 145或SEQ ID NO: 152的氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)。
8.根據(jù)前述權利要求中任一項的結合分子，其中所述結合分子是人單克隆抗體或其抗原結合片段。
9.一種核酸分子，其編碼根據(jù)權利要求1-8中任一項的結合分子。
10.根據(jù)權利要求1-8中任一項的結合分子、和/或根據(jù)權利要求9的核酸分子，其用作藥劑且優(yōu)選用于流感感染的診斷、治療和/或預防性處理。
11.一種藥物組合物，其 包含根據(jù)權利要求1-8中任一項的結合分子、和/或根據(jù)權利要求9的核酸分子、和藥學可接受的賦形劑。
【文檔編號】A61P31/16GK103906763SQ201280034558
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年7月12日 優(yōu)先權日:2011年7月14日
【發(fā)明者】T·H·J·克瓦克斯, D·A·T·M·祖伊德格斯特, R·福格爾斯, R·H·E·弗里森 申請人:克魯塞爾荷蘭公司