熱穩(wěn)定性疫苗組合物及其制備方法【專利摘要】本公開提供涉及熱穩(wěn)定性疫苗的組合物和其制備方法。具體而言，本公開提供制備熱穩(wěn)定性疫苗的方法，其基于重組蓖麻蛋白神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)并且使用輔佐劑開發(fā)能夠在對(duì)象中誘發(fā)免疫應(yīng)答的組合物?！緦＠f明】熱穩(wěn)定性疫苗組合物及其制備方法[0001]政府支持聲明[0002]本發(fā)明在國立健康研究所U01-A1-08-2210授權(quán)下由政府支持作出。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0003]本發(fā)明一般涉及干燥疫苗組合物的領(lǐng)域。更具體而言，涉及生產(chǎn)結(jié)合至佐劑并且包含免疫刺激分子的干燥疫苗組合物的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0004]包含重組蛋白的疫苗受益于或絕對(duì)需要佐劑，以誘發(fā)免疫應(yīng)答。(Callahan等,1991,Theimportanceofsurfacechargeintheoptimizationofantigen-adjuvantinteractions,Pharm.Res.8(7):851-858;Singh和0'Haganl999,Advancesinvaccineadjuvants,NatBiotechnol17(II):1075-81;以及0’Hagan等,2001,Recentdevelopmentsinadjuvantsforvaccinesagainstinfectiousdiseases,BiomolEngl8(3):69-85)。招鹽佐劑是目前最廣泛使用的一般用于人的佐劑，這是因?yàn)樵谑┯弥羶和统扇说囊呙缰邪踩褂玫拈L(zhǎng)久歷史。FDA批準(zhǔn)的疫苗中目前出現(xiàn)的唯一佐劑是鋁鹽佐劑、氫氧化鋁和磷酸鋁。鋁鹽佐劑提高疫苗的免疫原性并且通過減少疫苗中蛋白質(zhì)劑量水平引起接種結(jié)果的顯著提高，提高了保護(hù)性抗體的滴度，并且減少了在已經(jīng)完成主要系列接種之后的每年接種需要。但是，在基于重組蛋白、肽和化學(xué)合成疫苗的許多亞單位疫苗中鋁鹽佐劑的使用存在明顯的限制。這些限制包括疫苗存儲(chǔ)和穩(wěn)定性的一般方面，因?yàn)榘X佐劑的疫苗僅僅在窄溫度范圍內(nèi)可存儲(chǔ)，并且不能冷凍。進(jìn)一步限制包括普遍接受的觀點(diǎn):鋁佐劑相對(duì)弱，不促進(jìn)細(xì)胞免疫的發(fā)展，并且在中和抗體需要用于阻斷病毒感染或阻止生物毒素活性的情況下可利于開發(fā)非中和的抗體。[0005]在鋁佐劑的情況下，已經(jīng)建議，為了提供足夠的免疫原性，抗原必須被吸附在佐劑的表面上°(Gupta等，1995，AdjuvantPropertiesofAluminumandCalciumCompounds.PharmaceuticalBiotechnology.6:229-248;以及White和Hem,2000,Characterizationofaluminium-containingadjuvants,DevBiol(Basel)103:217-28)。通常通過抗原和佐劑之間的靜電相互作用促進(jìn)該吸附，并且通常選擇配制PH以使抗原和佐劑帶相反的電荷(Callahan等1991)。也可通過與緩沖鹽如磷酸鹽、琥珀酸鹽和檸檬酸鹽的表面交換反應(yīng)，改變佐劑上的表面電荷(Hem和White,1984，Characterizationofaluminumhydroxideforuseasanadjuvantinparenteralvaccines.JParenterSciTechnol,38(I):p.2-10;Chang等,1997,Roleoftheelectrostaticattractiveforceintheadsorptionofproteinsbyaluminumhydroxideadjuvant.PDAJPharmSciTechnol,51(1):p.25-9;以及Rinella等，1996，Treatmentofaluminiumhydroxideadjuvanttooptimizetheadsorptionofbasicproteins.Vaccine,14(4):p.298-300)。對(duì)鋁鹽佐劑的作用機(jī)制了解不多，但是可能是由于數(shù)個(gè)不同的機(jī)制°(Lindblad2004."Aluminiumcompoundsforuseinvaccines^Immuno1.Cell.Biol.82(5):497-505;Gupta和Siber,1995，AdjuvantsforHumanVaccines—CurrentStatus,ProblemsandFuture-Prospects.Vaccinel3(14):1263-1276;Gupta和Rost,2000,AluminumCompoundsasVaccineAdjuvants,In0’HaganD,editorVaccineAdjuvants:PreparationMethodsandResearchProtocols,ed.,Totowa,N.J.:HumanaPressInc.p65~89;Cox和Coulter,1997，Adjuvants—aclassificationandreviewoftheirmodesofaction,Vaccinel5(3):248-256)。通常提出的機(jī)制是佐劑用作在注入部位的儲(chǔ)庫，其中抗原在施用后緩慢釋放。(Cox和Coulter,1997)。另一提出的機(jī)制是佐劑幫助遞送抗原至抗原呈遞細(xì)胞(Lindblad2004)。進(jìn)一步提出的機(jī)制是佐劑用作免疫刺激劑并且誘發(fā)Th2細(xì)胞因子(Grun和Maurerl989,DifferentThelpercellsubsetselicitedinmiceutilizingtwodifferentadjuvantvehicles:theroleofendogenousinterleukinlinproliferativeresponses.CellImmunol121(I):134-145)。仍另一提出的機(jī)制是佐劑使得佐劑表面上的蛋白質(zhì)抗原不穩(wěn)定，造成它們更容易遭受蛋白水解降解(Jones等，2005，Effectsofadsorptiontoaluminumsaltadjuvantsonthestructureandstabilityofmodelproteinantigens.JBiolChem280(14):13406-13414;以及That等，2004."Antigenstabilitycontrolsantigenpresentation"】.Biol.Chem.279(48):50257-50266)。[0006]盡管未充分理解作用機(jī)制，但可能表面積、表面電荷和佐劑的形態(tài)是決定對(duì)吸附在這些佐劑上的抗原免疫應(yīng)答的重要因素(Hem和Whitel984)。通常的理論是疫苗佐劑的顆粒大小越小，疫苗制劑免疫原性越大，尤其當(dāng)顆粒大小是大約I微米時(shí)-最適于攝取專職抗原呈遞細(xì)胞的尺寸(Maa等，2003.Stabilizationofalum-adjuvantedvaccinedrypowderformulations:mechanismandapplication.JPharmSci92(2):319-332,Diminsky等,1999.Physical,chemicalandimmunologicalstabilityofCHO-derivedhepatitisBsurfaceantigen(HBsAg)particles.Vaccinel8(l-2):3-17)。[0007]凍干(冷凍干燥)是經(jīng)常用于提高各種蛋白制劑長(zhǎng)期穩(wěn)定性的方法。但是，當(dāng)用鋁鹽佐劑配制的疫苗被處理以試圖通過冷凍和凍干提高穩(wěn)定性時(shí)，出現(xiàn)效價(jià)損失，其中效價(jià)是通過一系列試驗(yàn)可測(cè)量的疫苗數(shù)量質(zhì)量之和，其可包括動(dòng)物中的免疫原性、蛋白質(zhì)抗原的化學(xué)降解、蛋白質(zhì)抗原的變性或取代免疫原性表位的損失。效價(jià)的損失與人中效力的損失相關(guān)。之前的研究已經(jīng)提示，由于佐劑顆粒的聚集，不能生產(chǎn)包含佐劑的冷凍干燥疫苗產(chǎn)品。(Diminsky等，1999;Maa等,2003)。已經(jīng)提出許多理論以解釋用招鹽佐劑配制的疫苗凍干之后效價(jià)損失的可能機(jī)制。顆粒聚集可能解釋顯著損失。例如，冷凍和融化之后碳酸羥鋁和氫氧化鎂凝膠的聚集已經(jīng)歸因于使顆粒在一起的冰晶形成，這導(dǎo)致不可逆的聚集°(Zapata等，1984，Mechanismoffreeze-thawinstabilityofaluminumhydroxycarbonateandmagnesiumhydroxidegels.JPharmSci73(I):3-8)。該角軍釋已經(jīng)由Maa等，2003提出，進(jìn)一步提示更快的冷卻速度導(dǎo)致更大的冰成核速度并且形成更小的冰晶，這將不使鋁顆粒形成聚集體。顆粒聚集可因此解釋效價(jià)的損失，而不是其他因素，比如蛋白質(zhì)構(gòu)造(三級(jí)結(jié)構(gòu))的損失、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的損失和通過氨基酸側(cè)鏈脫酰胺或氧化的一級(jí)結(jié)構(gòu)修飾。[0008]通過顆粒數(shù)量和表面積，而不是由顆粒質(zhì)量，預(yù)測(cè)顆粒增加變應(yīng)性致敏的能力。Moorefield等顯示佐劑顆粒的抗原內(nèi)化程度與佐劑聚集體的顆粒大小逆相關(guān)(Moorefield等,2005.〃Roleofaluminum-containingadjuvantsinantigeninternalizationbydendriticcellsinvitro〃Vaccine23(13):1588-1595)。Nygaard等顯不顆粒直徑并且因此表面積和顆粒數(shù)量而不是質(zhì)量或體積在聚苯乙烯顆粒在小鼠中免疫應(yīng)答中是主要特性(Nygaard等，2004)。盡管可能顆粒大小是免疫原性的重要特征參數(shù)，但仍需全面的研究考察作為所生產(chǎn)產(chǎn)物的配制和冷卻速度以及其他物理性質(zhì)的函數(shù)的顆粒大小分布(PSD)。[0009]存在一些一致的觀察:更有效的具有鋁佐劑的疫苗是其中抗原結(jié)合至鋁表面的那些，而不是游離在溶液中的那些(Lindblad,2004，Aluminiumadjuvants—inretrospectandprospect,Vaccine,22:3658-68)。為了制劑的再現(xiàn)性和穩(wěn)定性，期望限定抗原最佳結(jié)合晶體表面的條件，和其中抗原在一段時(shí)間內(nèi)或在升高應(yīng)力條件下不被脫附的條件。為了構(gòu)建鋁疫苗，有必要進(jìn)行研究以優(yōu)化結(jié)合和脫附。鋁佐劑在某些溶液PH下具有零電荷點(diǎn)(PZC)，但是在高于或低于該值的pH下帶電(White和Hem,2000,Characterizationofaluminium-containingadjuvants,DevBiol(Basel)，103:217-28)。對(duì)于通常需要結(jié)合鋁鹽佐劑以獲得期望免疫應(yīng)答的重組蛋白疫苗，選擇最佳配制PH進(jìn)一步復(fù)雜化(Mclnerney,Brennan等，1999，AnalysisoftheabilityoffiveadjuvantstoenhanceimmuneresponsestoachimericplantvirusdisplayinganHIV-lpeptide,Vaccine，17:1359-68)。為了促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)合佐劑，選擇其中蛋白質(zhì)和佐劑具有相反電荷的溶液pH。但是，提供最佳蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的溶液pH可能不允許疫苗適當(dāng)結(jié)合佐劑。在這種情形下，疫苗蛋白質(zhì)可能不得不在對(duì)于穩(wěn)定性次優(yōu)的PH下制備并且與適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定賦形劑凍干，以使得長(zhǎng)期存儲(chǔ)期間的降解最小化。[0010]凍干蛋白質(zhì)以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和活性以便存儲(chǔ)和重構(gòu)通常已經(jīng)應(yīng)用于重組蛋白治療性蛋白質(zhì)。這已經(jīng)通常通過在二糖比如海藻糖和促進(jìn)加工和存儲(chǔ)期間玻璃態(tài)的其他賦形劑的存在下實(shí)現(xiàn)。蛋白質(zhì)可長(zhǎng)期存儲(chǔ)，只要產(chǎn)物在其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)以下存儲(chǔ)，高于Tg材料轉(zhuǎn)化成橡膠樣態(tài)。認(rèn)為賦形劑通過穩(wěn)定劑與具體位點(diǎn)的相互作用而在干燥期間取代水并且通過同時(shí)抑制蛋白質(zhì)分子U-松弛)或分子部分((6-松弛)的平移和旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，穩(wěn)定無定形狀態(tài)的蛋白質(zhì)。干燥技術(shù)已經(jīng)較少應(yīng)用于疫苗的長(zhǎng)期存儲(chǔ)，尤其在吸附至磷酸鋁或氫氧化鋁佐劑的疫苗的情況下?？捎玫年P(guān)于在升高溫度條件下存儲(chǔ)干燥疫苗的數(shù)據(jù)非常少，因?yàn)楫a(chǎn)生干燥疫苗的大部分嘗試是為了獲得能夠在中等溫度幅度下存活的可吸入粉末或制劑。例如，因?yàn)辄S熱病疫苗主要用于熱帶氣候，在穩(wěn)定劑(乳糖、山梨糖醇)存在下的凍干已經(jīng)用于保持活病毒疫苗的活力(Monath,1996，Stabilityofyellowfevervaccine,DevBiolStand,87:219-25)。凍干和存儲(chǔ)期間沒有賦形劑，在_20°C以上活性快速喪失，但是被穩(wěn)定的疫苗可在37°C下經(jīng)受多于兩周。也已經(jīng)開發(fā)了用于牛疾病牛疫的凍干的干燥疫苗并且可在離開冷鏈(coldchain)之后在非洲地域條件下使用多達(dá)一個(gè)月(House和Mariner,1996，Stabilizationofrinderpestvaccinebymodificationofthelyophilizationprocess,DevBiolStand,87:235-44)。使用方法和干燥變型的類似嘗試最經(jīng)已經(jīng)用于麻疫疫苗開發(fā)(Burger,Cape等，2008，StabilizingformulationsforinhalablepowdersofIive-attenuatedmeaslesvirusvaccine,JAerosolMedPulmDrugDeliv,21:25-34;Burger,Cape等，2008，StabilizingFormulationsforInhalablePowdersofLive-AttenuatedMeaslesVirusVaccine,JAerosolMed)和用于流感的干燥疫苗粉末，其中設(shè)計(jì)允許保持免疫原結(jié)構(gòu)的條件可能非常重要(Amorij,Meulenaar等,2007,Rationaldesignofaninfluenzasubunitvaccinepowderwithsugarglasstechnology:preventingconformationalchangesofhaemagglutininduringfreezingandfreeze-drying,Vaccine,25:6447-57;Amorij,Huckriede等，2008，DevelopmentofStableInfluenzaVaccinePowderFormulations:ChallengesandPossibilities,PharmRes)。作為穩(wěn)定劑,少量的甲醒偶爾添加至疫苗,包括當(dāng)前的AVA炭疽疫苗(Biothraxig),并且可通過交聯(lián)蛋白質(zhì)起作用，在招晶體表面上形成更多免疫原性蛋白質(zhì)聚集體(Little,Ivins等，2007，EffectofaluminumhydroxideadjuvantandformaldehydeintheformulationofrPAanthraxvaccine,Vaccine,25:2771-7)。歷史上，甲醛已經(jīng)用作衍生自培養(yǎng)物上清液比如破傷風(fēng)類毒素、肉毒桿菌類毒素和其他的較老疫苗中的選擇的穩(wěn)定劑。當(dāng)前的AVA疫苗標(biāo)記為3年穩(wěn)定性，其中穩(wěn)定性是許多生物化學(xué)評(píng)估和效價(jià)的函數(shù)。盡管用液體懸浮疫苗可實(shí)現(xiàn)適合量的穩(wěn)定性，但是在疫苗庫存和分發(fā)所需的更長(zhǎng)存儲(chǔ)期不可能滿足所有穩(wěn)定性參數(shù)。[0011]治療性蛋白質(zhì)的成功干燥，同時(shí)保持結(jié)構(gòu)和功能，取決于溶液中發(fā)生的降解途徑的理解，所述降解途徑可能被適當(dāng)?shù)母稍锖陀糜诜€(wěn)定的賦形劑延遲或消除。對(duì)于疫苗，主要通過免疫原性和保護(hù)研究，而不是酶活性來確定功能。在吸附至鋁佐劑晶體的蛋白質(zhì)免疫原的情況下，功能和其他體外參數(shù)的測(cè)量相應(yīng)地更困難，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)可被截留并且難以去除用于分析。因此，可僅僅通過免疫原性和保護(hù)研究測(cè)試功能。蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)象可明顯影響酶功能一如果存在，但是取決于構(gòu)象，也可影響B(tài)細(xì)胞表位的免疫原性。其中包含的線性B和T細(xì)胞表位也可受(甲硫氨酸和半胱氨酸殘基的)氧化和(尤其天冬酰胺殘基的)脫酰胺的影響。PH是控制治療性蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的最關(guān)鍵配制變量之一(Carpenter,Chang等,2002,Rationaldesignofstablelyophilizedproteinformulations:theoryandpractice,PharmBiotechnol,13:109-33;Chi,Krishnan等，2003，PhysicalstabilityofproteinsinaqueoussoIution:mechanismanddrivingforcesinnonnativeproteinaggregation,PharmRes,20:1325-36)。通過影響溶液中蛋白質(zhì)的構(gòu)象和膠狀穩(wěn)定性，pH可顯著調(diào)節(jié)它們的聚集速度(Chi,Krishnan等,2003,Physicalstabilityof`proteinsinaqueoussolution:mechanismanddrivingforcesinnonnativeproteinaggregation,PharmRes,20:1325-36)。另外，脫酰胺速度強(qiáng)烈依賴于pH(Manning，Patel等，1989，Stabilityofproteinpharmaceuticals，PharmRes,6:903-18)。對(duì)于給定蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)穩(wěn)定性可有不同的最佳pH值(Kolvenbach,Narhi等，1997，Granulocyte-co1nystimulatingfactormaintainsathermallystable,compact,partiallyfoldedstructureatpH2，JPeptRes,50:310-8)o例如，物理穩(wěn)定性在脫酰胺快得不可接受的pH下可能是最佳的(Chang,Reeder等，1996，Developmentofastablefreeze-driedformulationofrecombinanthumaninterleukin-lreceptorantagonist,PharmRes，13:243-9)。在這種情況下，開發(fā)使這些反應(yīng)的速度最小化的凍干制劑可提供可行的策略，以獲得穩(wěn)定的產(chǎn)品?？疾祛A(yù)凍干溶液PH對(duì)治療性蛋白質(zhì)在凍干和以干燥制劑存儲(chǔ)期間穩(wěn)定性的影響的較少公開的研究表明了該參數(shù)的重要性(Prestrelski，Pikal等，1995，Optimizationoflyophilizationconditionsforrecombinanthumaninterleukin_2bydried-stateconformationalanalysisusingFourier-transforminfraredspectroscopy,PharmRes,12:1250-9;Chang,Reeder等，1996，Developmentofastablefreeze-driedformulationofrecombinanthumaninterleukin-lreceptorantagonist,PharmRes,13:243-9;Katayama，Kirchhoff等，2004，RetrospectivestatisticalanalysisoflyophilizedproteinformulationsofprogenipoietinusingPLS:determinationofthecriticalparametersforlong-termstoragestability，JPharmSci，93:2609-23)。這些研究表明難以鑒定賦予研究的蛋白質(zhì)凍干和存儲(chǔ)期間足夠的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的預(yù)凍干溶液pH。但是，如果足夠量的穩(wěn)定賦形劑包括在制劑中，蛋白質(zhì)的降解可被最小化。例如，當(dāng)配制重組人白介素-1-受體拮抗劑(rhlL-lra)然后在包含亞最佳蔗糖以小于0.3的蔗糖/蛋白質(zhì)的質(zhì)量比和小于6.5的pH的溶液中凍干時(shí)，凍干之后在存儲(chǔ)和重構(gòu)期間出現(xiàn)嚴(yán)重的蛋白質(zhì)聚集(Chang,Reeder等，1996，Developmentofastablefreeze-driedformulationofrecombinanthumaninterleukin-lreceptorantagonist,PharmRes,13:243-9)。盡管在從大于6的pH溶液凍干之后蛋白質(zhì)聚集被最小化，但是以不可接受的高速度發(fā)生了脫酰胺。從包含大于0.3的蔗糖/蛋白質(zhì)質(zhì)量比的蔗糖量、PH6.5的溶液凍干之后，可抑制兩種去穩(wěn)定化途徑。在另一實(shí)例中，在pH7下冷凍干燥期間，白介素-2(IL-2)具有顯著更大的結(jié)構(gòu)擾動(dòng)，其比從pH5的溶液凍干的樣品在存儲(chǔ)和再水合之后產(chǎn)生更高水平的聚集(Prestrelski,Pikal等，1995，Optimizationoflyophilizationconditionsforrecombinanthumaninterleukin_2bydried-stateconformationalanalysisusingFourier-transforminfraredspectroscopy,PharmRes,12:1250-9)。向pH7的預(yù)凍干溶液制劑添加蔗糖提高凍干之后存儲(chǔ)期間IL-2的穩(wěn)定性。最近，為炭疽rPA采用該預(yù)配制方法，以產(chǎn)生用于鼻施用的干燥粉末疫苗候選物(Jiang,Joshi等,2006,Anthraxvaccinepowderformulationsfornasalmucosaldelivery,JPharmSci,95:80-96)。在該情況下,為溶液中的rPA確立最優(yōu)化pH和賦形劑穩(wěn)定劑，然后凍干。因?yàn)楹Ｔ逄鞘谴_定用于使可溶性rPA對(duì)熱應(yīng)力穩(wěn)定的賦形劑之一，就總量的rPA而言，與其中rPA快速消失的液體樣品相比，有證據(jù)表明在40°C下干燥的含海藻糖的疫苗穩(wěn)定性至少30天。在使用氣體驅(qū)動(dòng)注入設(shè)備獲得表皮遞送的干燥粉末組合物的嘗試中，發(fā)現(xiàn)鋁吸附的肝炎B疫苗(HBsAg)在存在甘露醇、甘氨酸和葡聚糖(不大于總賦形劑的~6%w/v)的混合物的情況下的快速冷凍產(chǎn)生了這樣的疫苗，其在快速冷凍(噴霧冷凍干燥)之后保持顆粒大小和小鼠中相對(duì)免疫原性，所述快速冷凍涉及將噴霧疫苗注入液氮然后干燥(Maa,Zhao等，2003，Stabilizationofalum-adjuvantedvaccinedrypowderformulations:mechanismandapplication,JPharmSci，92:319-32)。盡管通常在加工之后凍干的疫苗聚集并且免疫原性最小，但是未確定在熱應(yīng)力條件下噴霧冷凍干燥疫苗的行為。重構(gòu)之后，降低的免疫原性與鋁顆粒聚集相關(guān)。[0012]最近，Roser等已經(jīng)提出將防止招顆粒聚集的凍干方法。Roser等的美國專利號(hào)6，890，512公開了通過向氫氧化鋁顆粒懸液添加超過15%(w/v)的海藻糖防止懸液中顆粒脫水和再水合期間顯著聚集的方法。海藻糖，a-D-吡喃葡萄糖基-a-D-吡喃葡萄糖苷，是負(fù)責(zé)避免植物細(xì)胞干燥的天然存在的二糖。海藻糖已經(jīng)顯示通過形成固定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的糖玻璃在干燥期間防止蛋白質(zhì)的變性。但是，Roser等，盡管公開了防止顯著的顆粒聚集，但未公開顆粒懸液的冷凍速度或?qū)τ诳刂坪捅３诸A(yù)凍干顆粒大小和在海藻糖存在下包含疫苗的鋁鹽中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)關(guān)鍵的其他因素的重要性。保持顆粒大小是控制蛋白質(zhì)免疫原吸附至鋁顆粒表面的程度的關(guān)鍵參數(shù)，并且除了海藻糖或其他玻璃覆蓋賦形劑的含量，在凍干循環(huán)期間其還受數(shù)個(gè)因素影響。這些因素影響免疫原性和保護(hù)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。[0013]鋁鹽佐劑提供了提高蛋白質(zhì)或肽亞單位疫苗的免疫原性的深入研究的手段。但是，已經(jīng)開發(fā)了各種增強(qiáng)疫苗的研究性制劑，作為鋁鹽佐劑更有力的備選，但是目前在FDA-許可的人疫苗中不可用。設(shè)計(jì)來提高免疫應(yīng)答的制劑包括基于下述的各種組合物:油包水乳劑、水包油乳劑、自裝配大結(jié)構(gòu)、細(xì)胞因子、皂苷、toll樣受體激動(dòng)劑(TLR-4、TLR-5和TLR-9)、免疫刺激雙鏈RNA種類、未甲基化的DNA寡核苷酸以及聚合微粒和納米結(jié)構(gòu)。這些組合物中的許多涉及改善注入的疫苗的免疫原性，并且可應(yīng)用一些變型以改變用于鼻內(nèi)或口服接種的遞送路徑。作為可用于提高疫苗免疫原性的一類免疫刺激分子的例子，可使用細(xì)菌DNA，而不是脊椎動(dòng)物DNA，因?yàn)榧せ盍馨图?xì)胞的直接免疫刺激作用。這是由于未甲基化的CpG二核苷酸以期望的頻率出現(xiàn)在細(xì)菌DNA中，但是在脊椎動(dòng)物DNA中不足并且被甲基化(Krieg等，1995)。也可通過在具體的序列背景下添加包含未甲基化的CpG二核苷酸的合成寡脫氧核苷酸(ODN)激發(fā)活化。CpGDNA誘導(dǎo)幾乎所有(>95%)B細(xì)胞的增殖并且增加免疫球蛋白(Ig)分泌。通過CpGDNA的這種B細(xì)胞活化是非T細(xì)胞依賴性的和非抗原特異性的。但是，通過低濃度的CpGDNA的B細(xì)胞活化與通過B細(xì)胞抗原受體輸送的信號(hào)對(duì)于B細(xì)胞增殖和Ig分泌二者具有強(qiáng)的協(xié)同作用(Krieg等，1995)。通過B細(xì)胞抗原受體和通過CpGDNA激發(fā)的B細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間這種強(qiáng)的協(xié)同作用促進(jìn)抗原特異性免疫應(yīng)答。除了其對(duì)B細(xì)胞的直接作用，CpGDNA也直接活化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，以分泌各種細(xì)胞因子，包括高水平的IL-12(Klinman等，1996；Halpern等，1996；Cowdery等，1996)。這些細(xì)胞因子刺激天然殺傷(NK)細(xì)胞分泌Y-干擾素(IFN-.y.-)并且具有增加的溶解活性(Klinman等，1996,如上；Cowdery等，1996,如上；Yamamoto等，1992；Ballas等，1996)?？傮w上，CpGDNA誘導(dǎo)受IL-12和IFN-y控制的Thl樣模式的細(xì)胞因子生產(chǎn)，較少分泌Th2細(xì)胞因子(Klinman等，1996)。其他分子刺激toll樣受體。一個(gè)例子是鞭毛蛋白——包括許多細(xì)菌鞭毛的蛋白質(zhì)亞單位。鞭毛蛋白是TLR-5配體并且在這種結(jié)合后激發(fā)抗原呈遞細(xì)胞的至少一種生物學(xué)功能。鞭毛出現(xiàn)在包括下列屬的成員的桿菌和螺旋形細(xì)菌的表面:埃希氏菌(Escherichia)、沙門氏菌(Salmonella)、變形桿菌(Proteus)、假單胞菌(Pseudomonas)、芽抱桿菌(Bacillus)、彎曲桿菌(Campylobacter)、弧菌(Vibrio)、螺旋體(Treponema)、軍團(tuán)菌(Legionella)、梭菌(Clostridia)和柄桿菌(Caulobacter)。鞭毛蛋白的保守區(qū)對(duì)于TLR5結(jié)合是重要的，而多態(tài)中心區(qū)可缺失而不影響與TLR5結(jié)合。本領(lǐng)域可利用來自許多細(xì)菌的鞭毛蛋白序列，比如Genbank獲取號(hào)D13689、YP.sub.—275549、YP.sub.—275550、AAU18718、AAU18717、ZP.sub.—00743095、EA052626、YP.sub.—315348、AAT28337、AAT28336、AAT28335、AAT28334、AAT28333、AAZ36356、AAZ33167、AAZ94424、AAZ91670、NP.sub.—414908、BAD18052和BAD18051。作為純化的佐劑免疫刺激劑的第三個(gè)例子，非毒性的化學(xué)合成或酶修飾的革蘭氏陰性菌脂多糖衍生物是強(qiáng)有力的佐劑并且通過TLR-4結(jié)合和活化刺激淋巴細(xì)胞而起作用。例如，單磷酰脂A(MPL)是脂多糖的脂質(zhì)A組分的衍生物并且是促炎細(xì)胞因子的強(qiáng)有力活化劑。盡管天然脂質(zhì)A和其母體LPS具有強(qiáng)的發(fā)熱性質(zhì)并且在人中誘導(dǎo)發(fā)熱應(yīng)答(Greisman和Homick,JImmunol,109:1210-1215(1972);Greisman和Homick,JInfectDis,128:257-263(1973);Abemathy和Spink,JClinInvest,37:219-225(1958);Rietschel等，如上;以及Raetz,如上(1993))，但MPL和其化學(xué)合成的類似物沒有毒性但是誘導(dǎo)一系列宿主促炎細(xì)胞因子，包括IL-1、IL-6和TNF-a。[0014]另外，為了提高對(duì)吸附至鋁鹽的亞單位的免疫應(yīng)答，可能需要輔佐劑以便在人中在一個(gè)或兩個(gè)劑量之后產(chǎn)生有效的抗體應(yīng)答。最近幾年，許多與鋁鹽相容的佐劑化合物已經(jīng)作為佐劑被評(píng)估。這些佐劑主要包括單磷酰脂A(MPL)和QS-21以及CpG序列。人研究中炭疽疫苗最近的數(shù)據(jù)表明，就總抗-rPA抗體和炭疽毒素中和抗體而言，在非人靈長(zhǎng)類和人類中通過添加CpG7909至佐劑制劑，AlOH吸附的疫苗AVA可被顯著增強(qiáng)，盡管沒有描述含CpG疫苗的長(zhǎng)期熱穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)(Klinman,2006，CpGoligonucleotidesaccelerateandboosttheimmuneresponseelicitedbyAVA,thelicensedanthraxvaccine,ExpertRevVaccines,5:365-9)。MPL和QS-21也已經(jīng)與招鹽一起使用以及在GlaxoSmithKlineBiologies開發(fā)的專利油乳劑制劑中使用。在人和動(dòng)物模型中，QS-21已經(jīng)在AlOH疫苗中評(píng)估，良好顯示耐受性和全身性安全性。認(rèn)為QS-21通過離子和疏水相互作用結(jié)合鋁鹽，以及其一些部分以微團(tuán)形式保持在溶液中(含水疫苗中)。QS-21是從樹皮純化的皂苷，具有誘導(dǎo)抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫二者的廣譜佐劑作用。雖然不了解機(jī)制，但結(jié)合人疫苗已經(jīng)評(píng)估了有效的劑量水平。已經(jīng)在臨床研究中評(píng)估了QS-21與鋁并且已經(jīng)研究了與抗原配制的QS-21的獨(dú)立安全性研究。QS-21已經(jīng)與在注射部位(其溶解)的刺痛(stinging)相關(guān)聯(lián)，非常少的證據(jù)表明全身性副作用(Waite,Jacobson等，2001,Threedouble-blind,randomizedtrialsevaluatingthesafetyandtoleranceofdifferentformulationsofthesaponinadjuvantQS-21,Vaccine,19:3957-67)。人中數(shù)個(gè)研究已經(jīng)顯示QS-21提高了對(duì)吸附至鋁的抗原的應(yīng)答。這些包括在下述中的數(shù)個(gè)試驗(yàn):瘧疾疫苗候選物(Nardin,Oliveira等，2000，SyntheticmalariapeptidevaccineelicitshighlevelsofantibodiesinvaccineesofdefinedHLAgenotypes,JInfectDis,182:1486-96;Kashala,Amador等，2002，Safety,tolerabilityandimmunogenicityofnewformulationsofthe惡性痕原蟲malariapeptidevaccineSPf66combinedwiththeimmunologicaladjuvantQS-21,Vaccine,20:2263-77)>HIVgpl20(Evans,McElrath等，2001，QS_21promotesanadjuvanteffectallowingforreducedantigendoseduringHIV-1envelopesubunitimmunizationinhumans,Vaccine,19:2080-91)和更近的登革熱病毒亞單位的恒河猴(Rhesusmacaque)試驗(yàn)，其中QS-21增強(qiáng)了中和滴度和保護(hù)(Putnak,Coller等，2005，Anevaluationofdenguetype-2inactivated,recombinantsubunit,andIive-attenuatedvaccinecandidatesintherhesusmacaquemodel,Vaccine,23:4442-52)。已經(jīng)在長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究中較好研究了QS-21的溶液穩(wěn)定性，并且已經(jīng)顯示佐劑活性QS-21(其實(shí)際上由兩個(gè)異構(gòu)形式組成)在微酸緩沖液中高度穩(wěn)定超過4年，而在40°C下小于10天(Kensil和Kammer,1998,QS-21:awater-solubletriterpeneglycosideadjuvant,ExpertOpinInvestigDrugs,7:1475-82)。QS-21存儲(chǔ)為干燥粉末并且以該形式穩(wěn)定性是不確定的。[0015]蓖麻蛋白毒素是蓖麻子(蓖麻)產(chǎn)生的64kDa蛋白質(zhì)(DoanLG.Ricinimechanismoftoxicity,clinicalmanifestations,andvaccinedevelopment.Areview.JournalofToxicology-ClinicalToxicology2004;42(2):201-8;AudiJ,BelsonM,PatelM,SchierJ，OsterlohJ.Ricinpoisoning:acomprehensivereview.JAMA2005;294(18):2342-51)。全毒素由通過二硫鍵連接的兩個(gè)多肽鏈(A和B)組成。A鏈(RTA)是核糖體失活蛋白(RIP)，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制蛋白質(zhì)合成。B鏈(RTB)是凝集素，其結(jié)合細(xì)胞表面上的半乳糖殘基。一旦被細(xì)胞內(nèi)化，RTA移動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)，在那里，其酶學(xué)地使60S核糖體失活(Smallshaw,JE和Vitetta,ES,AlyophilizedformulationofRiVax,arecombinantricinsubunitvaccine,retainsimmunogenicity.Vaccine2010Marchll;28(12):2428-2435)。細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中單個(gè)分子的RTA完全抑制蛋白質(zhì)合成。報(bào)道的評(píng)估的人中當(dāng)吸入、注入或攝入時(shí)，致死劑量的蓖麻蛋白是l-25i!g/kg(AUdi等)。因?yàn)槠鋸V泛的可用性和特別的毒性，蓖麻蛋白代表用于生物恐怖的潛在試劑并且所以被AtlantaGA疾控中心(OTC)歸類為B類生物威脅。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中可通過用類毒素或或去糖基化的蓖麻蛋白A鏈(dgRTA)，或用抗-蓖麻蛋白抗體的被動(dòng)免疫，預(yù)防蓖麻蛋白中毒。但是認(rèn)為類毒素對(duì)于人的常規(guī)使用太毒，并且dgRTA的生產(chǎn)困難并且昂貴，而且也保留兩種活性位點(diǎn)以及可在人中誘導(dǎo)毒性副作用。僅僅如果蓖麻蛋白劑量相對(duì)低并且抗體在暴露后的數(shù)小時(shí)內(nèi)施用，用抗-蓖麻蛋白抗體的被動(dòng)免疫是有效的(HewetsonJF,RiveraVR,CreasiaDA,LemleyPV,RippyMK,PoliMA.Protectionofmicefrominhaledricinbyvaccinationwithricinorbypassivetreatmentwithheterologousantibody.Vaccinel993;ll(7):743-6)0[0016]為了避免這些限制，開發(fā)了重組體RTA疫苗(RiVax)(Smallshaw等)。RiVax并入兩個(gè)點(diǎn)突變，Y80A和V76M，以大大降低或消除其已知的毒性，即核毒性(ribotoxicity)和血管滲漏誘導(dǎo)能力二者。在沒有佐劑的情況下，RiVax在小鼠、兔子和人中是非毒性和免疫原性的(SmallshawJE,FiranA,FulmerJR,RubackSL,GhetieV,VitettaES.Anovelrecombinantvaccinewhichprotectsmiceagainstricinintoxication.Vaccine2002;20(27-28):3422-7)。這種模型已經(jīng)顯示產(chǎn)生積極的結(jié)果而沒有其他疫苗模型涉及的太多毒性。[0017]目前，蓖麻蛋白被NIAID和疾病控制和預(yù)防中心(⑶C)列為B級(jí)生物威脅試劑(Rotz,Khan等，2002，Publichealthassessmentofpotentialbiologicalterrorismagents,EmergingInfectiousDiseases,8:225-30.)。疫苗候選物基于抗蓖麻蛋白毒素的重組體亞單位疫苗，所述蓖麻蛋白毒素通過基因失活參與良好表征的分子活性的蓖麻蛋白毒素A鏈(RTA)中的殘基獲得。該修飾的分子在小鼠、兔子和人中是免疫原性的，并且誘導(dǎo)中和毒素或參與在每個(gè)物種中全身性或粘膜清除毒素的抗體。在天花或炭疽的情況下，在有證據(jù)表明爆發(fā)之后，可能通過大規(guī)模接種、選擇性接種或環(huán)接種控制恐怖分子引起的流行病(Halloran,Longini等,2002,Containingbioterroristsmallpox,Science,298:1428-32;Kaplan,Craft等,2002,Emergencyresponsetoasmallpoxattack:thecaseformassvaccination,ProcNatlAcadSciUSA,99:10935-40;Bozzette,Boer等，2003，Amodelforasmallpox-vaccinationpolicy,NEnglJMed,348:416-25;Kretzschmar,vandenHof等,2004,Ringvaccinationandsmallpoxcontrol,EmergInfectDis,10:832-41)。另一方面，因?yàn)樵撛噭┎荒軓?fù)制，所以抗暴露于生物毒素的生物恐怖分子的接種很可能用于選擇的人群，比如軍隊(duì)或第一響應(yīng)者，而不是大規(guī)模接種。可在大腸桿菌和其他重組體宿主中生產(chǎn)蓖麻蛋白的分離的A和B亞單位。B鏈也是疫苗中內(nèi)含物的候選物，但認(rèn)為比A鏈具有更少的免疫原性和更弱的保護(hù)性(Maddaloni，Cooke等，2004，Immunologicalcharacteristicsassociatedwiththeprotectiveefficacyofantibodiestoricin，JournalofImmunology，172:6221-8)。盡管蓖麻蛋白A鏈的毒性比天然蓖麻蛋白少至少1000倍，但是當(dāng)用作疫苗時(shí)其仍保持可導(dǎo)致毒性的酶活性(Thorpe，Detre等，1985，Modificationofthecarbohydrateinricinwithmetaperiodate-cyanoborohydridemixtures.Effectsontoxicityandinvivodistribution,EuropeanJournalofBiochemistry，147:197-206.)。蓖麻蛋白A鏈中數(shù)個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基Y80、Y123、E177、R180、N209和W211構(gòu)成其酶活性位點(diǎn)(Olson,1997,RicinA-chainstructuraldeterminantforbindingsubstrateanalogues:amoleculardynamicssimulationanalysis,Proteins,27:80-95.;LebedaandOlson,1999,Predictionofaconserved,neutralizingepitopeinribosome-1nactivatingproteins,InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,24:19-26)。這些氨基酸殘基的一些突變已經(jīng)產(chǎn)生了具有可忽略不計(jì)的毒性的菌麻蛋白A鏈，如通過抑制蛋白質(zhì)合成測(cè)定的(Kim和Robertus，1992，AnalysisofseveralkeyactivesiteresiduesofricinAchainbymutagenesisandX-raycrystallography,ProteinEngineering，5:775-9.)。也已經(jīng)鑒定了參與RTA結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的另外位點(diǎn)和殘基，其出現(xiàn)在JMh并且不需要毒素進(jìn)入宿主細(xì)胞(Baluna和Vitetta，1999，Aninvivomodeltostudyimmunotoxin-1nducedvascularleakinhumantissue,JImmunother，22:41-7;Baluna，Coleman等，2000，TheeffectofamonoclonalantibodycoupledtoricinAchain-derivedpeptidesonendothelialcellsinvitro:1nsightsintotoxin-mediatedvasculardamage,ExpCelIRes，258:417-24;Smallshaw，Ghetie等，2003，Geneticengineeringofanimmunotoxintoeliminatepulmonaryvascularleakinmice,NatureBiotechnology，21:387-91)。RTA上的內(nèi)皮結(jié)合位點(diǎn)涉及對(duì)分離的HUVEC細(xì)胞的損傷和誘導(dǎo)血管滲漏綜合癥(VLS)，其已經(jīng)在使用包含RTA的免疫毒素中確定為劑量限制毒性(Smallshaw，Ghetie等，2003，Geneticengineeringofanimmunotoxintoeliminatepulmonaryvascularleakinmice,NatureBiotechnology，21:387-91)。參與肺部血管滲漏、SCID小鼠的人皮膚異源移植物中血管滲漏和HUVEC細(xì)胞的RTA部分顯示出包括氨基酸殘基L74、D75和V76(Baluna，Rizo等，1999，Evidenceforastructuralmotifintoxinsandinterleukin-2thatmayberesponsibleforbindingtoendothelialcellsand啟動(dòng)vascularleaksyndrome,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，96:3957-62.)。所以，已經(jīng)構(gòu)建了考慮那些毒性位點(diǎn)的A鏈疫苗并且其包括蓖麻蛋白A鏈的雙突變。酶位點(diǎn)中酪氨酸80突變?yōu)楸彼?，血管滲漏位點(diǎn)中纈氨酸76突變?yōu)榧琢虬彼?，以使?duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的任何可能最小化?；诰w結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)現(xiàn)在已知該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與天然蓖麻蛋白A鏈(RTA)相同，表明分子中包含的點(diǎn)突變不破壞任何可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)(或可能的構(gòu)象依賴性表位)。當(dāng)在沒有佐劑的情況下肌肉內(nèi)(1.m.)施用至小鼠時(shí)，突變體A鏈誘發(fā)識(shí)別蓖麻蛋白的抗體，并且由IOxLD5。劑量的蓖麻蛋白保護(hù)動(dòng)物(Smallshaw，F(xiàn)iran等，2002，Anovelrecombinantvaccinewhichprotectsmiceagainstricinintoxication，Vaccine，20:3422-7)。[0018]天然PA是AVA(吸附的炭疽疫苗)中的主要免疫原和作為單組分疫苗用于暴露前和暴露后預(yù)防的保護(hù)性免疫的目標(biāo)?；谔烊籔A在無毒炭疽芽孢桿菌中的表達(dá)，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)個(gè)鋁吸附的重組體PA疫苗(二代)并且在最近的I期試驗(yàn)中測(cè)試，并且已經(jīng)顯示與AVA關(guān)系是免疫原性的(Gorse,Keitel等，2006，Immunogenicityandtoleranceofascendingdosesofarecombinantprotectiveantigen(rPA102)anthraxvaccine:arandomized,double-blinded,controlled,multicentertrial,Vaccine,24:5950-9;Campbell,Clement等,2007,Safety,reactogenicityandimmunogenicityofarecombinantprotectiveantigenanthraxvaccinegiventohealthyadults,HumVaccin，3:205-11)。在兔子氣溶膠孢子挑戰(zhàn)研究(總的ELISA-反應(yīng)性抗體和毒素中和活性(TNA))中已經(jīng)良好表征了免疫的主要關(guān)系(Little,Ivins等，2004，Definingaserologicalcorrelateofprotectioninrabbitsforarecombinantanthraxvaccine,Vaccine,22:422-30)。熟知炭疽毒素是由炭疽芽孢桿菌表達(dá)的一組3個(gè)質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)構(gòu)成的三重毒素(tripartitetoxin):保護(hù)性抗原(PA;83kDa)、致死因子(LF;90kDa)和浮腫因子(EF;89kDa)。LF和EF從胞外表面通過七聚物PA轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，其中它們受哺乳動(dòng)物細(xì)胞的酶修飾分子靶標(biāo)的作用。LF是金屬蛋白酶，其切割并且活化數(shù)個(gè)促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK激酶)，EF是鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴性腺苷酸環(huán)化酶，其引起細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平快速增加。(YoungCollier,2007,Anthraxtoxin:receptorbinding,internalization,poreformation,andtranslocation,AnnuRevBiochem,76:243-65)。這些蛋白質(zhì)單個(gè)是無毒的,但是當(dāng)一起施用時(shí)是強(qiáng)的毒素，引起細(xì)胞快速死亡。[0019]AVA疫苗仍是炭疽的唯一疫苗并且改善它的主要?jiǎng)恿跀?shù)個(gè)認(rèn)識(shí)到的缺點(diǎn):需要6-劑量方案以便實(shí)現(xiàn)牢固免疫和認(rèn)識(shí)到其不安全并且是反應(yīng)原性的，并且AVA的制備性加工是粗糙的和缺少一致性。盡管PA是AVA中的主要免疫原，不清楚可能在一些批次中存在的少量的LF和EF是否有利于疫苗有效性。炭疽rPA免疫原性喪失的主要因素包括佐劑表面上的加速脫酰胺。這可通過存在少量的磷酸鹽以降低表面PH阻止。存在正在開發(fā)的其他具體的rPA疫苗候選物。AVA或基于PA的疫苗通常誘導(dǎo)毒素中和抗體(Pitt,Little等,1999,Invitroc`orrelateofimmunityinananimalmodelofinhalationalanthrax,JApplMicrobiol,87:304;Reuveny,White等,2001,Searchforcorrelatesofprotectiveimmunityconferredbyanthraxvaccine,InfectImmun,69:2888-93;Little,Ivins等,2004,Definingaserologicalcorrelateofprotectioninrabbitsforarecombinantanthraxvaccine,Vaccine,22:422-30)?；赑A的疫苗的保護(hù)性作用的機(jī)制可歸因于抗-PA抗體，其保護(hù)宿主避免中毒并且因此允許免疫系統(tǒng)處理生物，盡管PA疫苗未設(shè)計(jì)為限制感染的發(fā)作。[0020]目前有72種疫苗被美國FDA(美國食品和藥品管理局)批準(zhǔn)(US.FDA中批準(zhǔn)用于免疫和分配的疫苗的完整目錄6/3/2010)。這72種疫苗中，36%包含鋁佐劑和30%是冷凍干燥的。72種疫苗中沒有一種包含鋁佐劑和冷凍干燥組分二者。[0021]本領(lǐng)域需要開發(fā)生產(chǎn)熱穩(wěn)定性、免疫學(xué)活性冷凍干燥疫苗制劑的方法，其結(jié)合重組抗原以促進(jìn)快速啟動(dòng)保護(hù)性免疫?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0022]本公開提供生產(chǎn)包含熱穩(wěn)定性的冷凍干燥疫苗佐劑的制劑的方法。本公開進(jìn)一步提供生產(chǎn)熱穩(wěn)定性的冷凍干燥疫苗的制劑的方法，其中疫苗抗原是重組抗原。[0023]在一種實(shí)施方式中，本公開提供制備結(jié)合免疫學(xué)活性佐劑的干燥疫苗組合物的方法，該方法包括:組合至少一種鋁鹽佐劑、包含至少一種揮發(fā)性鹽的至少一種緩沖系統(tǒng)、至少一種玻璃形成劑、至少一種免疫活性輔佐劑和至少一種抗原，以形成液體疫苗制劑；冷凍該液體疫苗制劑，以形成冷凍的疫苗制劑；和凍干冷凍的疫苗制劑，以形成干燥疫苗組合物，其中該組合物能夠在對(duì)象中誘發(fā)免疫應(yīng)答。對(duì)象產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以是體液免疫和/或?qū)乖禺愋缘募?xì)胞介導(dǎo)的免疫。一個(gè)方面，至少一種鋁鹽佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁。另一方面，鋁鹽佐劑是氫氧化鋁。在進(jìn)一步的方面中，至少一種緩沖系統(tǒng)選自醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、谷醇溶蛋白、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、硼酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。在仍另一方面中，至少一種緩沖系統(tǒng)選自醋酸銨、甲酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、三乙基醋酸銨、三乙基甲酸銨、三乙基碳酸銨、醋酸三甲胺、甲酸三甲胺、碳酸三甲胺、醋酸吡唳(pyridinal)和甲酸吡唳。在另一方面中，至少一種玻璃形成劑選自海藻糖、鹿糖、菲可(ficoll)、葡聚糖、蔗糖、麥芽三糖、乳糖、甘露醇、羥乙基淀粉、甘氨酸、環(huán)糊精和聚維酮。在進(jìn)一步的方面中，玻璃形成劑是海藻糖。一方面，冷凍干燥之前，液體疫苗制劑中存在的玻璃形成劑海藻糖的重量比體積濃度為從約5%至約15%。另一方面，液體疫苗制劑中存在的玻璃形成劑海藻糖的重量比體積濃度為從約8%至約20%。在另一實(shí)施方式中，至少一種免疫學(xué)活性輔佐劑被添加至方法步驟。在該方面中，至少一種免疫學(xué)活性輔佐劑選自脂質(zhì)A、脂質(zhì)A衍生物、單磷酰脂A、單磷酰脂A的化學(xué)類似物、包含CpG的寡核苷酸、TLR-4激動(dòng)劑、鞭毛蛋白、衍生自革蘭氏陰性細(xì)菌的鞭毛蛋白、TLR-5激動(dòng)劑、能夠結(jié)合TLR-5受體的鞭毛蛋白的片段、皂苷、皂苷的類似物、QS-21、純化的皂苷餾分、ISC0MS、皂苷與甾醇和脂質(zhì)的組合。在進(jìn)一步的方面中，輔佐劑化合物是QS-21。在進(jìn)一步的方面中，冷凍步驟包括下述之一:托盤冷凍、貨架冷凍、噴霧冷凍和殼體冷凍(shell-freezing)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，冷凍步驟包括使用預(yù)先冷卻的托盤啟動(dòng)冷凍步驟。[0024]在另一方面中，抗原選自或衍生自:輪狀病毒、口蹄疫病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、HlNUH2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、人II型副流感病毒、單純皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、水痘病毒、I型豬皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、炭疽芽孢桿菌、炭疽PA和衍生物、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、溫?zé)岵〔《尽⑽瘍?nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、貓白血病病毒、呼腸孤病毒、呼吸道合胞病毒、拉沙熱病毒、多瘤病毒、犬細(xì)小病毒、乳頭瘤病毒、森林腦炎病毒、牛痕病毒、人鼻病毒種、腸道病毒種、門戈病毒(Mengovirus)、副粘病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、I型人T細(xì)胞白血病-淋巴瘤病毒、I型人免疫缺陷病毒、2型人免疫缺陷病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、細(xì)小病毒B19、腺病毒、風(fēng)疹病毒、黃熱病病毒、登革熱病毒、牛呼吸道合胞病毒、冠狀病毒、百日咳博德特氏菌、支氣管敗血波氏桿菌、副百日咳博德特氏囷、流廣布魯氏囷病、羊種布魯氏囷、豬布魯氏囷、羊布魯氏囷、布魯氏囷種、大腸桿囷、沙門氏菌種、傷寒沙門氏菌、鏈球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌、肺結(jié)核、鳥分支桿菌(avium)、卡介菌、麻風(fēng)分支桿菌、肺炎雙球菌、葡萄球菌、腸桿菌種、漢氏羅卡利馬氏體、溶血巴斯德氏菌、放血敗血性巴斯德氏菌、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、性病性淋巴肉芽腫、梅毒螺旋體、嗜血菌種、牛生殖道支原體、肺支原體、支原體種、伯氏疏螺旋體、嗜肺軍團(tuán)菌、肉毒梭菌、白喉棒狀桿菌、耶爾森氏菌、立氏立克次體、斑疹傷寒立克次體、普氏立克次體、恰菲埃里希氏體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、血吸蟲、錐體蟲、利士曼原蟲種、血絲蟲、滴蟲、肉孢子蟲、牛肉絳蟲、豬肉絳蟲、利士曼原蟲、弓形蟲、旋毛蟲、球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、新型隱球菌、白色念珠菌、煙曲霉、球孢子菌、淋病奈瑟氏球菌、瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白、瘧疾裂殖子蛋白、錐體蟲表面抗原蛋白、百日咳、a病毒、腺病毒、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、腦膜炎球菌外膜蛋白、鏈球菌M蛋白質(zhì)、流感血凝素、癌癥抗原、腫瘤抗原、毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素、蓖麻蛋白毒素、假單胞菌外毒素、外毒素、神經(jīng)毒素、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、單核因子、單核因子受體、植物花粉、動(dòng)物皮屑和塵螨。[0025]在另一實(shí)施方式中，本公開提供了疫苗組合物，包括:至少一種鋁鹽佐劑；至少一種緩沖劑，其中至少一種緩沖劑包括揮發(fā)性鹽；至少一種玻璃形成劑；和至少一種抗原，其中該組合物被凍干以形成干燥疫苗組合物和進(jìn)一步其中干燥疫苗組合物能夠在對(duì)象中誘發(fā)免疫應(yīng)答。一個(gè)方面中，至少一種鋁鹽佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁。在另一方面中，至少一種緩沖劑選自醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、谷醇溶蛋白、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、硼酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽。在可選的方面中，至少一種緩沖劑選自醋酸銨、甲酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、三乙基醋酸銨、三乙基甲酸銨、三乙基碳酸銨、醋酸三甲胺、甲酸三甲胺、碳酸三甲胺、醋酸吡啶和甲酸吡啶。在仍另一方面中，至少一種玻璃形成劑選自海藻糖、蔗糖、菲可、葡聚糖、蔗糖、麥芽三糖、乳糖、甘露醇、羥乙基淀粉、甘氨酸、環(huán)糊精和聚維酮。在進(jìn)一步的方面中，抗原選自或衍生自:輪狀病毒、口蹄疫病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、人II型副流感病毒、單純皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、水痘病毒、I型豬皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、炭疽芽孢桿菌、炭疽PA和衍生物、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、溫?zé)岵〔《?、委?nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、貓白血病病毒、呼腸孤病毒、呼吸道合胞病毒、拉沙熱病毒、多瘤病毒、犬細(xì)小病毒、乳頭瘤病毒、森林腦炎病毒、牛瘟病毒、人鼻病毒種、腸道病毒種、門戈病毒、副粘病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、I型人T細(xì)胞白血病-淋巴瘤病毒、I型人免疫缺陷病毒、2型人免疫缺陷病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、細(xì)小病毒B19、腺病毒、風(fēng)疹病毒、黃熱病病毒、登革熱病毒、牛呼吸道合胞病毒、冠狀病毒、百日咳博德特氏菌、支氣管敗血波氏桿菌、副百日咳博德特氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌病、羊種布魯氏囷、豬布魯氏囷、羊布魯氏囷、布魯氏囷種、大腸桿囷、沙門氏囷種、傷寒沙門氏囷、鏈球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌、肺結(jié)核、鳥分支桿菌、卡介菌、麻風(fēng)分支桿菌、肺炎雙球菌、葡萄球菌、腸桿菌種、漢氏羅卡利馬氏體、溶血巴斯德氏菌、放血敗血性巴斯德氏菌、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、性病性淋巴肉芽腫、梅毒螺旋體、嗜血菌種、牛生殖道支原體、肺支原體、支原體種、伯氏疏螺旋體、嗜肺軍團(tuán)菌、肉毒梭菌、白喉棒狀桿菌、耶爾森氏菌、立氏立克次體、斑疹傷寒立克次體、普氏立克次體、恰菲埃里希氏體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、血吸蟲、錐體蟲、利士曼原蟲種、血絲蟲、滴蟲、肉孢子蟲、牛肉絳蟲、豬肉絳蟲、利士曼原蟲、弓形蟲、旋毛蟲、球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、新型隱球菌、白色念珠菌、煙曲霉、球孢子菌、淋病奈瑟氏球菌、瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白、瘧疾裂殖子蛋白、錐體蟲表面抗原蛋白、百日咳、a病毒、腺病毒、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、腦膜炎球菌外膜蛋白、鏈球菌M蛋白質(zhì)、流感血凝素、癌癥抗原、腫瘤抗原、毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素、蓖麻蛋白毒素、假單胞菌外毒素、外毒素、神經(jīng)毒素、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、單核因子、單核因子受體、植物花粉、動(dòng)物皮屑和塵螨。[0026]在可選的實(shí)施方式中，疫苗組合物進(jìn)一步包括至少一種免疫學(xué)活性輔佐劑。一個(gè)方面中，至少一種免疫學(xué)活性輔佐劑選自脂質(zhì)A、脂質(zhì)A衍生物、單磷酰脂A、單磷酰脂A的化學(xué)類似物、包含CpG的寡核苷酸、TLR-4激動(dòng)劑、鞭毛蛋白、衍生自革蘭氏陰性細(xì)菌的鞭毛蛋白、TLR-5激動(dòng)劑、能夠結(jié)合TLR-5受體的鞭毛蛋白的片段、皂苷、皂苷的類似物、QS-21、純化的皂苷餾分、ISCOMS和皂苷與留醇和脂質(zhì)的組合。[0027]在仍另一實(shí)施方式中，本公開提供控制結(jié)合佐劑的干燥疫苗組合物中顆粒大小的方法，該方法包括:組合至少一種鋁鹽佐劑、至少一種緩沖系統(tǒng)、至少一種玻璃形成劑和至少一種抗原，以形成液體疫苗制劑；冷凍液體疫苗制劑以形成冷凍的疫苗制劑；和凍干冷凍的疫苗制劑，以形成干燥疫苗組合物，其中用水性稀釋劑稀釋干燥疫苗組合物以形成重構(gòu)的疫苗組合物之后，重構(gòu)的疫苗組合物的平均顆粒直徑小于100微米。在另一方面，至少一種鋁鹽佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁。在進(jìn)一步的方面，鋁鹽佐劑是氫氧化鋁。在另一方面，至少一種緩沖系統(tǒng)選自醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、谷醇溶蛋白、組氨酸、硼酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。在進(jìn)一步的方面，至少一種緩沖系統(tǒng)選自琥珀酸鹽和磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。一個(gè)方面，至少一種玻璃形成劑選自海藻糖、蔗糖、菲可、葡聚糖、蔗糖、麥芽三糖、乳糖、甘露醇、羥乙基淀粉、甘氨酸、環(huán)糊精、聚維酮和鉀鹽。在具體的方面，玻璃形成劑是海藻糖。在進(jìn)一步具體的方面，在液體疫苗制劑中存在的玻璃形成劑海藻糖的重量比體積濃度為從約5%至約20%。在另一方面，液體疫苗制劑中存在的玻璃形成劑海藻糖的重量比體積濃度為從約7%至約15%。一個(gè)方面，冷凍步驟包括下述之一:托盤冷凍、貨架冷凍、噴霧冷凍和殼體冷凍。在另一方面，冷凍步驟包括噴霧冷凍。在進(jìn)一步的方面，重構(gòu)的疫苗組合物的平均顆粒直徑小于6微米。一個(gè)方面，選擇步驟中玻璃形成劑的濃度隨著冷卻步驟中將液體疫苗制劑冷卻成冷凍狀態(tài)的速度提高而下降。[0028]在可選的實(shí)施方式中，本公開提供了干燥疫苗組合物中使用的佐劑組合物，該佐劑組合物包括:鋁鹽佐劑、玻璃形成劑和緩沖鹽。一個(gè)方面，鋁鹽佐劑選自氫氧化鋁和磷酸鋁。在另一方面，玻璃形成劑是海藻糖。在進(jìn)一步的方面，緩沖鹽選自下述一種或多種:琥珀酸鈉、琥珀酸鉀、磷酸鈉和磷酸鉀。[0029]在仍另一實(shí)施方式中，本公開提供了具有有限平均顆粒直徑的結(jié)合佐劑的干燥疫苗組合物，該組合物通過包括下述的方法生產(chǎn):在緩沖系統(tǒng)中摻混至少一種佐劑、至少一種玻璃形成劑和至少一種抗原，以形成液體疫苗制劑；快速冷卻液體疫苗制劑至冷凍狀態(tài)以形成冷凍的疫苗制劑；和凍干冷凍的疫苗制劑，以形成干燥疫苗組合物，其中用水性稀釋劑稀釋干燥疫苗組合物以形成重構(gòu)的疫苗組合物之后，重構(gòu)的疫苗組合物的平均顆粒直徑小于100微米。[0030]在另一實(shí)施方式中，本公開提供控制冷凍疫苗制劑中顆粒大小的方法，該方法包括:組合至少一種鋁鹽佐劑、至少一種緩沖系統(tǒng)、至少一種玻璃形成劑和至少一種抗原，以形成液體疫苗制劑；冷凍液體疫苗制劑以形成冷凍的疫苗制劑；和凍干冷凍的疫苗制劑，以形成干燥疫苗組合物，其中融化和用水性稀釋劑稀釋干燥疫苗組合物以形成重構(gòu)的疫苗組合物之后，重構(gòu)的疫苗組合物的平均顆粒直徑小于100微米。一個(gè)方面，至少一種鋁鹽佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁。在另一方面，鋁鹽佐劑是氫氧化鋁。在進(jìn)一步的方面，至少一種緩沖系統(tǒng)選自醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、谷醇溶蛋白、組氨酸、硼酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。一個(gè)方面，至少一種緩沖系統(tǒng)選自琥珀酸鹽和磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。在另一方面，至少一種玻璃形成劑選自海藻糖、蔗糖、菲可、葡聚糖、蔗糖、麥芽三糖、乳糖、甘露醇、羥乙基淀粉、甘氨酸、環(huán)糊精、聚維酮和鉀鹽。在具體的方面，玻璃形成劑是海藻糖。在進(jìn)一步具體的方面，在液體疫苗制劑中存在的玻璃形成劑海藻糖的重量比體積濃度為從約5%至約20%。在另一具體的方面，在液體疫苗制劑中存在的玻璃形成劑海藻糖的重量比體積濃度為從約7%至約15%。一個(gè)方面，冷凍步驟包括下述之一:托盤冷凍、貨架冷凍、噴霧冷凍和殼體冷凍。在另一方面，冷凍步驟包括噴霧冷凍。在進(jìn)一步的方面中，重構(gòu)的疫苗組合物的平均顆粒直徑小于6微米。[0031]在另一方面，液體疫苗制劑被制備為高滲混合物，然后冷凍，其中當(dāng)用水性稀釋劑稀釋干燥疫苗組合物以形成重構(gòu)的疫苗組合物時(shí)，重構(gòu)的疫苗組合物的張度被調(diào)整至等滲水平。在仍另一方面，制備制劑，其中通過凍干去除揮發(fā)性鹽，重構(gòu)后產(chǎn)生這樣的疫苗制劑，其張度相對(duì)于起始制劑下降，同時(shí)保持相同濃度的抗原和佐劑?！緦＠綀D】【附圖說明】[0032]圖1描繪基于％表面積的冷凍干燥和重構(gòu)之前和之后顆粒大小分布。[0033]圖2描繪冷凍干燥之前和之后基于％表面積的組氨酸制劑的顆粒大小分布。[0034]圖3描繪冷凍干燥之前和之后基于％表面積的精氨酸制劑的顆粒大小分布。[0035]圖4描繪冷凍干燥之前和之后基于％表面積的甘氨酸制劑的顆粒大小分布。[0036]圖5顯示pH6的IOmM組氨酸緩沖液中Alhydrogel顆粒隨著時(shí)間的沉降。(a)沒有沉降;(b)沉降30分鐘之后；和(C)沉降3小時(shí)之后。[0037]圖6描繪在使顆粒在用-10°C預(yù)冷卻的貨架冷凍干燥之前沉降不同時(shí)間量之后基于表面積的顆粒大小分布。樣品在PH6的IOmM組氨酸緩沖液中包含lmg/mLAl。[0038]圖7描繪在使顆粒在用-10°C預(yù)冷卻的貨架冷凍干燥之前沉降不同時(shí)間量之后基于表面積的顆粒大小分布。樣品在pH6的IOmM組氨酸緩沖液中包含lmg/mLAl和8w/v%海藻糖。[0039]圖8顯示有或沒有海藻糖、同時(shí)改變冷凍干燥之前沉降時(shí)間的在IOmM組氨酸中l(wèi)mg/mLAl的制劑之間平均顆粒大小的比較。[0040]圖9說明凍干期間的步驟，其中處理包含在3ml玻璃小瓶中的Iml疫苗樣品，用FTS系統(tǒng)LyoStar冷凍干燥系統(tǒng)在初次和二次冷凍之前改變冷凍速度。在冷凍干燥后，用氮?dú)獯祾咝∑浚芊獠⑶掖鎯?chǔ)在_80°C，然后進(jìn)一步分析。[0041]圖10顯示在4個(gè)條件和增加海藻糖的濃度下在冷凍干燥循環(huán)之前和之后的顆粒大小分布。初次和二次干燥之前更快速度的冷凍和更高濃度的海藻糖產(chǎn)生冷凍干燥之后非常類似于初始顆粒分布的顆粒大小分布。從最慢至最快為:室溫托盤A(A)、-10°C預(yù)先冷卻的托盤(B)、液氮浸潰(C)、液氮噴霧冷凍干燥(D)。制劑由lmg/mlAlhydrogel>pH6.0的IOmM組氨酸以及0-12%海藻糖組成。[0042]圖11顯示冷凍干燥之后顆粒大小分布的室溫冷凍干燥的依賴性。如圖10中進(jìn)行室溫冷凍干燥。在托盤上室溫溫育然后是冷凍循環(huán)，顆粒大小分布從〈I微米移動(dòng)至>20微米，并且8%的海藻糖的存在降低顆粒大小移動(dòng)程度。[0043]圖12顯示用50%w/v甘油溶解在pH6.0的IOmM組氨酸，144mMNaCl中的RTA的SDSPAGE,與透析、濃縮和在_20°C存儲(chǔ)的RTA比較。(上圖-銀染色、下圖-考馬斯染色。相同組的樣品用于進(jìn)行兩種研究)。[0044]圖13顯示RTA吸附至Alhydrogel然后凍干。改變RTA的濃度，保持Al的濃度為lmg/mL。至少95%的RTA蛋白質(zhì)被吸附至pH6.0的Alhydrogel的表面。[0045]圖14顯示接種吸附至Alhydrogel的液體RTA疫苗的結(jié)果，其中各種劑量的RTA用于接種8個(gè)SwissWebster小鼠的組。當(dāng)疫苗在40°C存儲(chǔ)I個(gè)月然后接種時(shí),暴露于蓖麻蛋白毒素的動(dòng)物沒有一個(gè)存活并且觀察到顯著的免疫原性喪失。在4°C存儲(chǔ)I個(gè)月的疫苗以最高劑量誘導(dǎo)完全保護(hù)和以更低的劑量在小鼠中誘導(dǎo)部分保護(hù)。[0046]圖15顯示每個(gè)疫苗一次注入后(3周)和兩次注入后(5周)，沒有溫育、在40°C下溫育I周和I個(gè)月之后rRTA的抗體滴度。平均滴度顯示為僅僅對(duì)應(yīng)那些小鼠標(biāo)準(zhǔn)偏差的小鼠的平均。[0047]圖16顯示來自免疫小鼠的終點(diǎn)滴度數(shù)據(jù)。終點(diǎn)滴度=倒數(shù)(reciprocal)終點(diǎn)抗-RTA滴度。中和IC50滴度=保護(hù)孔中50%的細(xì)胞避免這里未顯示的蓖麻蛋白細(xì)胞毒性所需的血清的稀釋度，但是假(sham)免疫小鼠(1-10號(hào)(5號(hào)除外)沒有一個(gè)在它們的血清中具有任何抗-RTA滴度。也測(cè)試I號(hào)假免疫小鼠血清的體外中和能力，并且其不保護(hù)細(xì)胞。[0048]圖17顯示從用凍干之前吸附液體疫苗第二次接種SwissWebster小鼠后的各自血清獲得的總滴度以及中和滴度。[0049]發(fā)明詳述[0050]定義[0051]脫水海藻糖(高純度、低內(nèi)毒素)獲得自FerroPfanstiehl(Cleveland,0H)。精氨酸、甘氨酸、組氨酸、檸檬酸鈉和醋酸銨購買自SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)。通過E.M.SergeantPulp&ChemicalCo,Inc(Clifton,NJ)購買由BrenntagBiosector制造的Alhydrogel?2.0%(氧氧化招佐劑)。3_ml和5_ml凍干瓶和蓋獲得自WestPharmaceuticalServices。[0052]樣品制備[0053]制備包含不同濃度海藻糖(0_15w/v%)的水溶液。除非另外指出，在pH6并且包含lmg/mlAl(以Alhydrogel?的形式)的IOmM緩沖液(如所示)中制備樣品。將樣品處理為Iml等分試樣。除了佐劑，配制之前所有水溶液經(jīng)過0.2ym過濾器。[0054]表面電荷^電位[0055]測(cè)量各制劑中氫氧化鋁(Alhydrogel)懸液的4電位，以探究靜電相互作用。然后制備沒有抗原的制劑，以確定在冷凍干燥期間顆粒是否發(fā)生聚集。將濃度為ImgAl/mL的Alhydrogel在pH6的IOmM緩沖液(甘氨酸、精氨酸、組氨酸、醋酸銨、檸檬酸鈉)中與范圍為0-12w/v%的穩(wěn)定劑海藻糖結(jié)合。為了確定冷凍速度是否影響顆粒聚集，使用四種冷凍方法冷凍干燥制劑:室溫托盤冷凍、_10°C預(yù)冷卻的托盤冷凍、液氮浸潰冷凍和液氮噴霧冷凍，然后是初次和二次干燥。也添加蛋白質(zhì)至制劑以觀察其在冷凍干燥和重構(gòu)之后對(duì)顆粒大小的影響。范圍為0.04-2000um的顆粒大小分布由每種制劑的激光衍射表征。[0056]凍干[0057]FTS系統(tǒng)Lyostar冷凍干燥機(jī)用于樣品的冷凍干燥。如下以從最慢至最快的各種冷卻速度冷凍樣品:(i)將在室溫下準(zhǔn)備的瓶放置在冷凍干燥機(jī)托盤上并且在室溫保持I小時(shí)然后啟動(dòng)(ii)通過將樣品放置在冷凍干燥機(jī)中冷凍，在-10°C的貨架溫度下平衡lhr，然后以0.5°C/min的速度冷卻貨架至-40°C(“_10預(yù)先冷卻的托盤-冷凍”)；(ii)通過將瓶底浸入液體N2冷凍(LN2浸潰冷凍干燥)；和(iii)通過滴~20uI小滴入液體N2噴霧冷凍(LN2噴霧冷凍干燥)。在3-ml凍干瓶中處理托盤冷凍和液體N2浸入的樣品，同時(shí)在5-ml凍干瓶中處理噴霧冷凍的樣品。包含使用液體N2冷凍的樣品的瓶被快速轉(zhuǎn)移至放置在冷凍干燥機(jī)貨架上的預(yù)冷卻至-40V的冷凍干燥機(jī)。在冷凍干燥機(jī)中將樣品間隔開，從而它們每個(gè)彼此分開并且被一排含水的瓶子環(huán)繞。[0058]通過將貨架溫度設(shè)置至_20°C并且施加60mTorr的真空20小時(shí)實(shí)現(xiàn)樣品的初次干燥，并且隨后進(jìn)行二次干燥，其中貨架溫度以0.2V/min從-20°C攀升至(TC，以0.5°C/min攀升至30°C并且最終在30°C保持5小時(shí)。在真空下密封樣品并且用DI水重構(gòu)，然后分析。冷凍和干燥循環(huán)的變化描繪在(圖10)中。[0059]顆粒大小分布[0060]使用Beckman-CoulterLS230激光衍射顆粒大小分析儀測(cè)量顆粒大小分布(PSD)。每個(gè)測(cè)試需要3個(gè)Iml樣品，并且每個(gè)制劑的每個(gè)測(cè)試重復(fù)3次。報(bào)告的PSD是表面積加權(quán)的并且是3次測(cè)試的綜合。實(shí)施例[0061]1.不同顆粒沉降時(shí)間的-10°C預(yù)冷卻的托盤冷凍干燥[0062]在4°C下，結(jié)合pH6.0的IOmM組氨酸緩沖液,來自Alhydrogel的lmg/mLAl和O、4、8或12w/v%的海藻糖并且翻轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)30分鐘。將ImL的溶液放置在每個(gè)3mL玻璃冷凍干燥瓶中。將制劑放置在冷凍干燥器中-`1o°c預(yù)冷卻的貨架上并且根據(jù)下表冷凍干燥。冷凍干燥之后，將腔回填干燥氮?dú)獠⑶覍⑵棵芊?。[0063]表1[0064]【權(quán)利要求】1.一種制備結(jié)合免疫學(xué)活性佐劑的干燥疫苗組合物的方法，所述方法包括:(a)提供至少一種鋁鹽佐劑、包含至少一種揮發(fā)性鹽的至少一種緩沖系統(tǒng)、至少一種玻璃形成劑和至少一種抗原；(b)將(a)組合在一起，形成液體疫苗制劑；(C)冷凍(b)中的所述液體疫苗制劑，形成冷凍的疫苗制劑；和(d)凍干(C)中所述冷凍的疫苗制劑，形成干燥疫苗組合物，進(jìn)一步其中所述干燥疫苗組合物能夠在對(duì)象中誘發(fā)免疫應(yīng)答。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述對(duì)象產(chǎn)生的所述免疫應(yīng)答可以是體液免疫和/或?qū)乖禺惖募?xì)胞介導(dǎo)的免疫。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種鋁鹽佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸招。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種緩沖系統(tǒng)選自醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、谷醇溶蛋白、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、硼酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種緩沖系統(tǒng)選自醋酸銨、甲酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、三乙基醋酸銨、三乙基甲酸銨、三乙基碳酸銨、醋酸三甲胺、甲酸三甲胺、碳酸三甲胺、醋酸吡啶和甲酸吡啶。6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種玻璃形成劑選自海藻糖、蔗糖、菲可、葡聚糖、蔗糖、麥芽三糖、乳糖、甘露醇、羥乙基淀粉、甘氨酸、環(huán)糊精和聚維酮。7.權(quán)利要求1所述的方法，其`中所述至少一種玻璃形成劑是海藻糖并且在冷凍干燥之前在所述液體疫苗制劑中存在的所述海藻糖的重量比體積濃度為從約5%至約15%。8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種玻璃形成劑是海藻糖并且在所述液體疫苗制劑中所述海藻糖的重量比體積濃度為從約8%至約20%。9.權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一種免疫學(xué)活性輔佐劑在步驟(a)中添加。10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述至少一種免疫學(xué)活性輔佐劑選自脂質(zhì)A、脂質(zhì)A衍生物、單磷酰脂A、單磷酰脂A的化學(xué)類似物、包含CpG的寡核苷酸、TLR-4激動(dòng)劑、鞭毛蛋白、衍生自革蘭氏陰性細(xì)菌的鞭毛蛋白、TLR-5激動(dòng)劑、能夠結(jié)合TLR-5受體的鞭毛蛋白的片段、皂苷、皂苷的類似物、QS-21、純化的皂苷餾分、ISCOMS和皂苷與甾醇和脂質(zhì)的組合。11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述冷凍步驟包括下述之一:托盤冷凍、貨架冷凍、噴霧冷凍和殼體冷凍。12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述冷凍步驟包括使用預(yù)先冷卻的托盤啟動(dòng)所述冷凍步驟。13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原選自或衍生自:輪狀病毒、口蹄疫病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、人II型副流感病毒、單純皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、水痘病毒、I型豬皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、炭疽芽孢桿菌、炭疽PA和衍生物、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、溫?zé)岵〔《?、委?nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、貓白血病病毒、呼腸孤病毒、呼吸道合胞病毒、拉沙熱病毒、多瘤病毒、犬細(xì)小病毒、乳頭瘤病毒、森林腦炎病毒、牛瘟病毒、人鼻病毒種、腸道病毒種、門戈病毒、副粘病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、I型人T細(xì)胞白血病-淋巴瘤病毒、I型人免疫缺陷病毒、2型人免疫缺陷病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、細(xì)小病毒B19、腺病毒、風(fēng)疹病毒、黃熱病病毒、登革熱病毒、牛呼吸道合胞病毒、冠狀病毒、百日咳博德特氏菌、支氣管敗血波氏桿菌、副百日咳博德特氏囷、流廣布魯氏囷病、羊種布魯氏囷、豬布魯氏囷、羊布魯氏囷、布魯氏囷種、大腸桿囷、沙門氏菌種、傷寒沙門氏菌、鏈球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌、肺結(jié)核、鳥分支桿菌、卡介菌、麻風(fēng)分支桿菌、肺炎雙球菌、葡萄球菌、腸桿菌種、漢氏羅卡利馬氏體、溶血巴斯德氏菌、放血敗血性巴斯德氏菌、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、性病性淋巴肉芽腫、梅毒螺旋體、嗜血菌種、牛生殖道支原體、肺支原體、支原體種、伯氏疏螺旋體、嗜肺軍團(tuán)菌、肉毒梭菌、白喉棒狀桿菌、耶爾森氏菌、立氏立克次體、斑疹傷寒立克次體、普氏立克次體、恰菲埃里希氏體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、血吸蟲、錐體蟲、利士曼原蟲種、血絲蟲、滴蟲、肉孢子蟲、牛肉絳蟲、豬肉絳蟲、利士曼原蟲、弓形蟲、旋毛蟲、球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、新型隱球菌、白色念珠菌、煙曲霉、球孢子菌、淋病奈瑟氏球菌、瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白、瘧疾裂殖子蛋白、錐體蟲表面抗原蛋白、百日咳、a病毒、腺病毒、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、腦膜炎球菌外膜蛋白、鏈球菌M蛋白質(zhì)、流感血凝素、癌癥抗原、腫瘤抗原、毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素、蓖麻蛋白毒素、假單胞菌外毒素、外毒素、神經(jīng)毒素、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、單核因子、單核因子受體、植物花粉、動(dòng)物皮屑和塵螨。14.權(quán)利要求1所述的方法，其中干燥疫苗組合物用水性稀釋劑重構(gòu)以形成重構(gòu)的疫苗組合物。15.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述重構(gòu)的疫苗組合物包含小于100微米的平均顆粒直徑。16.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述液體疫苗制劑首先被制備為高滲混合物，然后冷凍，并且然后在用水性稀釋劑稀釋所述干燥疫苗組合物之后被調(diào)節(jié)至等滲水平。17.疫苗組合物，其包括:(a)至少一種鋁鹽佐劑；(b)至少一種緩沖劑，其中所述至少一種緩沖劑包括揮發(fā)性鹽；(C)至少一種玻璃形成劑；和(d)至少一種抗原，其中所述組合物被凍干以形成干燥疫苗組合物并且進(jìn)一步其中所述干燥疫苗組合物能夠在對(duì)象中誘發(fā)免疫應(yīng)答。18.權(quán)利要求17所述的疫苗組合物，其中所述至少一種鋁鹽佐劑選自氫氧化鋁、磷酸招和硫酸招。19.權(quán)利要求17所述的疫苗組合物，其中所述至少一種緩沖劑選自醋酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、谷醇溶蛋白、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、硼酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽。20.權(quán)利要求17所述的疫苗組合物，其中所述至少一種緩沖劑選自醋酸銨、甲酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、三乙基醋酸銨、三乙基甲酸銨、三乙基碳酸銨、醋酸三甲胺、甲酸三甲胺、碳酸三甲胺、醋酸吡啶和甲酸吡啶。21.權(quán)利要求17所述的疫苗組合物，其中所述至少一種玻璃形成劑選自海藻糖、蔗糖、菲可、葡聚糖、蔗糖、麥芽三糖、乳糖、甘露醇、羥乙基淀粉、甘氨酸、環(huán)糊精和聚維酮。22.權(quán)利要求17所述的疫苗組合物，其中所述組合物包括至少一種免疫學(xué)活性輔佐劑。23.權(quán)利要求22所述的疫苗組合物，其中所述至少一種免疫學(xué)活性輔佐劑選自脂質(zhì)A、脂質(zhì)A衍生物、單磷酰脂A、單磷酰脂A的化學(xué)類似物、包含CpG的寡核苷酸、TLR-4激動(dòng)劑、鞭毛蛋白、衍生自革蘭氏陰性細(xì)菌的鞭毛蛋白、TLR-5激動(dòng)劑、能夠結(jié)合TLR-5受體的鞭毛蛋白的片段、皂苷、皂苷的類似物、QS-21、純化的皂苷餾分、ISCOMS和皂苷與留醇和脂質(zhì)的組合。24.權(quán)利要求17所述的疫苗組合物，其中所述抗原選自或衍生自:輪狀病毒、口蹄疫病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、HlNl、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、人II型副流感病毒、單純皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、水痘病毒、I型豬皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、炭疽芽孢桿菌、炭疽PA和衍生物、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、溫?zé)岵〔《?、委?nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、貓白血病病毒、呼腸孤病毒、呼吸道合胞病毒、拉沙熱病毒、多瘤病毒、犬細(xì)小病毒、乳頭瘤病毒、森林腦炎病毒、牛瘟病毒、人鼻病毒種、腸道病毒種、門戈病毒、副粘病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、I型人T細(xì)胞白血病-淋巴瘤病毒、I型人免疫缺陷病毒、2型人免疫缺陷病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、細(xì)小病毒B19、腺病毒、風(fēng)疹病毒、黃熱病病毒、登革熱病毒、牛呼吸道合胞病毒、冠狀病毒、百日咳博德特氏菌、支氣管敗血波氏桿菌、副百日咳博德特氏菌、流產(chǎn)布魯氏菌病、羊種布魯氏菌、豬布魯氏菌、羊布魯氏菌、布魯氏菌種、大腸桿菌、沙門氏菌種、傷寒沙門氏菌、鏈球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌、肺結(jié)核、鳥分支桿菌、卡介菌、麻風(fēng)分支桿菌、肺炎雙球菌、葡萄球菌、腸桿菌種、漢氏羅卡利馬氏體、溶血巴斯德氏菌、放血敗血性巴斯德氏菌、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、性病性淋巴肉芽腫、梅毒螺旋體、嗜血菌種、牛生殖道支原體、肺支原體、支原體種、伯氏疏螺旋體、嗜肺軍團(tuán)菌、肉毒梭菌、白喉棒狀桿菌、耶爾森氏菌、立氏立克次體、斑疹傷寒立克次體、普氏立克次體、恰菲埃里希氏體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、血吸蟲、錐體蟲、利士曼原蟲種、血絲蟲、滴蟲、肉孢子蟲、牛肉絳蟲、豬肉絳蟲、利士曼原蟲、弓形蟲、旋毛蟲、球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、新型隱球菌、白色念珠菌、煙曲霉、球孢子菌、淋病奈瑟氏球菌、瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白、瘧疾裂殖子蛋白、錐體蟲表面抗原蛋白、百日咳、a病毒、腺病毒、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、腦膜炎球菌外膜蛋白、鏈球菌M蛋白質(zhì)、流感血凝素、癌癥抗原、腫瘤抗原、毒素、`產(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素、蓖麻蛋白毒素、假單胞菌外毒素、外毒素、神經(jīng)毒素、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、單核因子、單核因子受體、植物花粉、動(dòng)物皮屑和塵螨。【文檔編號(hào)】A61K39/38GK103781491SQ201280035108【公開日】2014年5月7日申請(qǐng)日期:2012年5月17日優(yōu)先權(quán)日:2011年5月17日【發(fā)明者】K·哈西特,P·南迪,R·布雷,J·卡彭特,T·倫道夫申請(qǐng)人:索利吉尼克斯公司,科羅拉多大學(xué)評(píng)議會(huì)公司