miRNA在胎盤組織中的表達的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于免疫調(diào)節(jié)的與在妊娠期間產(chǎn)生免疫耐受性相關(guān)的人類miRNA以及其片段、衍生物和變體。所述miRNA可以用于診斷和治療與免疫反應(yīng)失調(diào)相關(guān)的病癥、自身免疫病癥、妊娠相關(guān)疾病、胎盤形成障礙或問題和由同種異體移植引起的并發(fā)癥。另外，描述了用于診斷和治療所述病癥的新的藥物組合物和診斷組合物。
【專利說明】m i RNA在胎盤組織中的表達

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明總體上涉及可用于免疫調(diào)節(jié)的結(jié)合分子，特別是與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)相關(guān)或可用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的人類miRNA以及其前體、衍生物、變體和模擬物。另外，本發(fā)明涉及包含所述結(jié)合分子、其前體和模擬物的藥物和診斷組合物，所述組合物不僅在作為診斷工具用于鑒別與妊娠期間母體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄單元的突變方面，而且在如妊娠相關(guān)疾病、胎盤形成障礙或問題、自身免疫疾病等與免疫系統(tǒng)誤調(diào)節(jié)或過度活躍相關(guān)的病癥的治療策略中或在預(yù)防或治療移植物對抗宿主的反應(yīng)方面是有價值的。

【背景技術(shù)】
[0002]為了成功懷孕，必需調(diào)節(jié)母體的免疫系統(tǒng)。已知胎盤的胚胎/胎兒部分，且確切地說是它的滋養(yǎng)層，能夠產(chǎn)生可以通過與母體免疫系統(tǒng)局部地(即，在蛻膜內(nèi)以及在外圍)發(fā)生相互作用來預(yù)防胚胎排斥反應(yīng)的因子。然而，免疫調(diào)節(jié)必須在早期妊娠期間就已經(jīng)有效地發(fā)揮作用。在妊娠的前三個月，不少于30%到40%的蛻膜由母體免疫細胞組成，其中大部分(約70%)是NK細胞，但已知巨噬細胞和T細胞也以相當大的百分比存在(Warning等，2011)。
[0003]盡管這些介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)的因子中有一些是已知的，但其它的仍然有待于鑒別。調(diào)節(jié)母體免疫系統(tǒng)的能力并不限于滋養(yǎng)層，胎兒基質(zhì)細胞也能夠與母體免疫系統(tǒng)的細胞進行有效的交談(Roelen等，2009)。旨在鑒別負責母體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)的機制的實驗似乎指示可溶性因子以及粒子在這個過程中起重要作用。其中后者是可以由多種細胞類型釋放的外來體，即，小膜囊，且含有由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及mRNA和miRNA組成的多樣性貨物蛋白(cargo)(Valadi等，2007)。在妊娠期間，滋養(yǎng)層的細胞可以分泌似乎會抑制母體免疫系統(tǒng)的外來體(Southcombe等，2011)。然而，不知道這種抑制實際上是如何實現(xiàn)的和其中究竟涉及哪些因子。這些因子的鑒別將為妊娠相關(guān)病癥或妊娠期間的并發(fā)癥領(lǐng)域內(nèi)的治療和診斷策略提供新的手段，并且可能也可用于治療若干種與免疫系統(tǒng)失調(diào)或過度活躍相關(guān)的疾病。
[0004]已經(jīng)通過權(quán)利要求書中所描繪的和下文所描述的實施方案解決了這一技術(shù)問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本文中所提供的數(shù)據(jù)令人驚訝地突出了 C19MC miRNA在早期妊娠和胎盤基質(zhì)細胞中的早期功能。這個數(shù)據(jù)暗示C19MC以及miR-371-3簇的miRNA是重要的免疫調(diào)節(jié)劑。已經(jīng)指定編碼這兩個簇的基因在染色體19的長臂上緊鄰彼此(圖1)。就本文中所提供的數(shù)據(jù)而言，本發(fā)明總體上涉及提供用于免疫調(diào)節(jié)的C19MC以及miR-371-3簇的miRNA、其前體。就此而言，也提供了共有共同種子序列AAGTGC的其它miRNA和能夠干擾這些miRNA分子的靶基因的基因表達的結(jié)合分子。此外，本發(fā)明提供了包含如上文和下文所定義的miRNA分子的核酸序列的核酸、載體和宿主細胞，其中所述核酸序列可操作地連接到調(diào)節(jié)序列，例如啟動子、增強子，所述調(diào)節(jié)序列用于誘導(dǎo)和控制本發(fā)明的上述miRNA分子、其前體或其它結(jié)合分子在宿主細胞和/或患者中的表達。就此而言，本發(fā)明還提供了可用于治療或診斷總體上與免疫系統(tǒng)失調(diào)有關(guān)聯(lián)的病癥(如同在自身免疫疾病、妊娠相關(guān)疾病、胎盤形成或植入障礙或問題的情況下)和治療或預(yù)防同種異體移植物(植入物)的排斥反應(yīng)或由于移植物對抗宿主的反應(yīng)所致的病癥的藥物組合物和診斷組合物。此外，本發(fā)明還提供了可用于處理被自身免疫疾病侵襲的細胞或者預(yù)防或處理例如自身免疫疾病情況下的自體組織破壞現(xiàn)象的藥劑。本發(fā)明所提供的和上述組合物中所使用的藥劑是被設(shè)計用于不同的施用形式，如局部或全身施用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1:具有兩個miRNA簇，即C19MC和miR-371-3的染色體區(qū)19ql3的圖解
[0007]圖2:52個胎盤組織中的miRNA miR-520c_3p的相對表達相對于妊娠周數(shù)的關(guān)系圖。
[0008]圖3:絨膜絨毛的顯微解剖圖。首先從絨膜絨毛(A)切除基質(zhì)核心(B)，然后切除滋養(yǎng)層(C)。
[0009]圖4:以下miRNA在基質(zhì)和滋養(yǎng)層細胞中的相對表達:miR-371_3p、miR-372、miR-373 和 miR-520c_3p。
[0010]圖5:miR-520c-3p和miR-517a_3p在蛻膜和滋養(yǎng)層細胞中的相對表達。
[0011]圖6:說明靶向基因轉(zhuǎn)錄物的miRNA充當Fas-FasL誘導(dǎo)的細胞凋亡的抑制劑的的圖解。已經(jīng)根據(jù)miRBase (18發(fā)行版)鑒別了標靶。
[0012]圖7:分別在96小時和120小時利用BrdU測定在與JEG-3細胞和bAMC共培養(yǎng)的PBMC中所測量的細胞增殖。
[0013]圖8:分別在96小時和120小時利用BrdU測定在處于混合淋巴細胞反應(yīng)中且用Con A刺激的單獨PBMC中所測量的細胞增殖。
[0014]圖9:BC280723的基因組位置。
[0015]圖10:miR-517a-3p在經(jīng)編碼C19MC的BAC載體轉(zhuǎn)染的牛羊膜源性細胞中在轉(zhuǎn)染后24小時、48小時和6天時與模擬轉(zhuǎn)染(mock transfected)細胞相比的相對表達。對于24小時和6天，進行重復(fù)轉(zhuǎn)染。
[0016]圖11:(A)miR-520c-3p在!1(:1'-116和邛6-3細胞中的相對表達(關(guān)于定量RT-PCR的描述，參見實施例1)。(B)分別經(jīng)JEG-3細胞和HCT-116細胞的上清液處理的Jurkat細胞中的C-FLIP的相對表達。

【具體實施方式】
[0017]miR-371-373 (371-3)簇僅含有7個miRNA，而C19MC是目前已知的最大的人類miRNA簇，總共有大約60種不同的miRNA (表1)。已經(jīng)報告了 C19MC的成員大量地表達于胎盤的滋養(yǎng)層而不是基質(zhì)部分中，且在妊娠期間的表達有所增加(Luo等，2009)。關(guān)于miR371-373簇在胎盤中的表達，對其細節(jié)還是未知。
[0018]然而，尚未將兩個簇的miRNA作為可以調(diào)節(jié)母體免疫系統(tǒng)的候選物加以論述。反對它們與母體免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的有力論據(jù)來自于現(xiàn)有文獻。首先，C19MC簇成員的表達似乎限于滋養(yǎng)層(Luo等，2009)，但胎盤基質(zhì)細胞已被描述為也具有免疫抑制功能(Roelen等，2009)。其次，由C19MC簇的miRNA成員的表達增加(Luo等，2009)得出的結(jié)論是這些miRNA的功能與妊娠晚期有相當大的關(guān)系。
[0019]然而，與上文相反，本發(fā)明內(nèi)所提供的數(shù)據(jù)突出了 C19MCmiRNA在早期妊娠和胎盤基質(zhì)細胞中的早期功能(參見實施例1到4)。就下文更詳細描述的這些實驗結(jié)果而言，與此同時提供了 C19MC以及miR-371-3簇的miRNA作為母體免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)劑。
[0020]由于單一 miRNA能夠與超過一個標靶相互作用以及由于miR-371-3和C19MC簇(后者在甚至更大的程度上)中存在多種不同的miRNA，故miRNA的免疫調(diào)節(jié)功能可能基于多種機制。僅作為一個實例，不希望受理論束縛，實施例8中已經(jīng)描繪了促細胞凋亡功能，該實施例顯示C19MC簇的成員與拮抗Fas-FasL誘導(dǎo)的細胞凋亡的不同mRNA相互作用。然而，其它相關(guān)機制，包括誘導(dǎo)細胞衰老以及可逆細胞周期停滯和無反應(yīng)性，可能也受miRNA影響。因此，關(guān)于這些發(fā)現(xiàn)的治療意義，在本發(fā)明的一個實施方案中，使用本文中所描述的兩個簇的單一 miRNA、每單個簇的miRNA以及其不同的組合來滿足所預(yù)期的治療目的。
[0021]表1:針對染色體帶19ql3指定的C19MC和miR371_3簇的miRNA (參考圖1) ο ID號依據(jù)miRBasel8發(fā)行版(2011年11月)的條目；也參見Bentwich等，NatGenet.37 (2005)，766-770 和 Landgraf 等，Celll29 (2007)，1401-1414。表中所列的 miRNA前體的序列可以獲自相應(yīng)m iRNA的miRBase條目。

【權(quán)利要求】
1.一種用于免疫調(diào)節(jié)的miRNA，其中所述miRNA是選自由C19MC簇或miR-371_373簇中所包含的轉(zhuǎn)錄單元中的任一個所編碼的miRNA。
2.如權(quán)利要求1所述的miRNA，其中所述miRNA是選自:具有SEQID No: 1_66的hsa-miR-498、hsa-miR-512_3p、hsa-miR-512_5p、hsa-miR-515_3p、hsa-miR-515_5p、hsa—miR-516a_3p、 hsa-miR-516a_5p、 hsa—miR-5I6b_3p、 hsa-miR-516b_5p、hsa-miR_5I7_5p、hsa_miR-517a_3p、hsa-miR-5I7b_3p、hsa-miR-517c_3p、hsa—miR-518a_3p、hsa—miR-518a_5p、hsa—miR-518b、hsa—miR-518c_3p、hsa—miR-518c_5p、hsa—miR-518d_3p、 hsa-miR-518d_5p、 hsa—miR-5I8e_3p、 hsa—miR-5I8e_5p、hsa-miR_5I8f_3p、 hsa-miR-5I8f_5p、 hsa-miR-519a_3p、 hsa-miR-519a_5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-519d、hsa-miR-519e-3p、hsa-miR-519e-5p、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-520b、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-520c-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-520e、hsa-miR-520f> hsa_miR-520g、 hsa_miR-520h、 hsa-miR-521、 hsa-miR-522_3p、hsa-miR-522_5p、hsa-miR-523_3p、hsa-miR-523~5p> hsa-miR-524_3p、hsa-miR-524_5p、hsa-miR-525_3p、hsa-miR-525_5p、hsa_miR-526a、hsa-miR-526b_3p、hsa-miR-526b_5p、hsa-miR-527、hsa-miR-1283、hsa-miR-1323、hsa-miR-371a_3p、hsa-miR-371a_5p、hsa-miR-371b_3p、hsa-miR-371b_5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373_3p、hsa-miR-373_5p0
3.如權(quán)利要求1或2所述的miRNA，所述miRNA與由C19MC簇或miR-371-373簇所編碼的miRNA具有共同種子序列，其中所述miRNA: a.)是選自:具有SEQ ID No: 67-78 的 hsa-miR-302a_3p、hsa-miR-302a_5p、hsa-miR-302b_3p、 h sa-miR-302b_5p、 hsa-miR-302c-3p> hsa-miR-302c_5p、hsa-miR-302d_3p、hsa-miR-302d_5p ;和 / 或 b.)以一致種子序列AAGTGC為特征。
4.一種用于免疫調(diào)節(jié)的miRNA前體，其包含如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA的核酸序列。
5.一種用于免疫調(diào)節(jié)的結(jié)合分子，所述結(jié)合分子能夠干擾如權(quán)利要求1到4中任一項所述的miRNA分子的標靶基因的基因表達，其中所述結(jié)合分子是選自用于免疫調(diào)節(jié)的包含合成miRNA模擬物、RNA分子、抗體、適體、鏡像異構(gòu)體的分子群組。
6.一種雙鏈核酸，其包含如權(quán)利要求1到4中任一項所述的miRNA或miRNA前體或如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子的核酸序列。
7.—種載體,其包含如權(quán)利要求6所述的雙鏈核酸。
8.—種宿主細胞，其包含如權(quán)利要求7所述的載體。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細胞，其中所述細胞是人類細胞，優(yōu)選其中所述細胞是選自患者的自體細胞的群組。
10.一種藥物組合物或診斷劑，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子、如權(quán)利要求6所述的雙鏈核酸、如權(quán)利要求7所述的載體和/或如權(quán)利要求8或9所述的宿主細胞作為藥劑。
11.如權(quán)利要求10所述的藥物組合物或診斷劑，其中所述活性劑被包埋在人造外來體中。
12.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子或如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物，其用于治療自身免疫疾病。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述自身免疫疾病是選自包括以下的疾病群組:急性播散性腦脊髓炎(ADEM)、斑禿、強直性脊椎炎、抗磷脂綜合征(APS)、自身免疫性心肌病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳病、自身免疫性淋巴細胞增生綜合征(ALPS)、自身免疫性周圍神經(jīng)病變、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病綜合征、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板減少性紫癜、自身免疫性蕁麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜瀉、冷凝集素病、克羅恩病、皮膚肌炎、I型糖尿病、子宮內(nèi)膜異位癥、嗜酸性筋膜炎、胃腸道類天皰瘡、古德帕斯徹氏綜合征、格雷夫斯氏病、格林-巴利綜合征(GBS)、橋本氏腦病、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜(自身免疫性血小板減少性紫癜)、紅斑狼瘡、米勒費雪綜合征(格林-巴利綜合征)、混合結(jié)締組織病、重癥肌無力、尋常天皰瘡、惡性貧血、多肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、斯耶格倫氏綜合征、顳動脈炎(“巨細胞性動脈炎”)、橫貫性脊髓炎、潰瘍性結(jié)腸炎、未分化結(jié)締組織病(混合結(jié)締組織病)、血管炎、韋格納氏肉芽腫病。
14.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子、如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物或如權(quán)利要求10或11所述的診斷劑，其用于治療或診斷妊娠相關(guān)疾病。
15.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子、如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物或如權(quán)利要求10或11根據(jù)權(quán)利要求14所述的診斷劑，其中所述妊娠相關(guān)疾病是選自由子癇、先兆子癇、HELLP綜合征和胎盤形成或植入障礙或問題組成的疾病群組。
16.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子、如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物，其用于預(yù)防或治療同種異體移植物的排斥反應(yīng)。
17.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子、如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物，其用于預(yù)防或治療移植物對抗宿主的反應(yīng)。
18.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子、如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物或如權(quán)利要求10所述的診斷劑，其被設(shè)計用于局部施用。
19.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子、如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物或如權(quán)利要求10所述的診斷劑，其被設(shè)計用于全身施用。
20.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子、如權(quán)利要求7所述的載體、如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物或如權(quán)利要求10或11所述的診斷劑，其用于離體和/或體內(nèi)處理同種異體移植物。
21.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子、如權(quán)利要求7所述的載體、如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物藥劑或如權(quán)利要求10或11所述的診斷劑，其用于離體和/或體內(nèi)處理自體細胞或組織。
22.如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權(quán)利要求4所述的miRNA前體、如權(quán)利要求5所述的結(jié)合分子、如權(quán)利要求7所述的載體、如權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物藥劑或如權(quán)利要求10或11所述的診斷劑，其用于離體和/或體內(nèi)處理被自身免疫疾病侵襲的細胞或組織。
23.—種針對如權(quán)利要求1到3中任一項所述的miRNA和/或針對如權(quán)利要求4所述的miRNA前體的拮抗劑，所述拮抗劑選自用于治療良性和惡性腫瘤的包含合成miRNA模擬物、RNA分子、抗體、適體、鏡像異構(gòu)體和小分子的分子群組，所述良性和惡性腫瘤選自包括甲狀腺腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、生殖細胞腫瘤、肝細胞癌、白血病和淋巴瘤的群組。
24.一種獲得用于免疫調(diào)節(jié)的外來體的方法，其包括分離和純化來自表達如權(quán)利要求1到3中任一項所述的C19MC、miR-371-373和/或miR302_367簇的miRNA的胚胎或胎兒細胞的細胞培養(yǎng)物的上清液的外來體。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物是選自包括來自臍帶、羊膜、胎盤和絨毛膜的細胞的細胞群組。
26.一種從生物樣品獲得用于免疫調(diào)節(jié)的外來體的方法，其包括以下步驟:由所述生物樣品建立細胞培養(yǎng)物，收集所述細胞培養(yǎng)物的上清液，以及分離和純化其外來體。
27.如權(quán)利要求26 所述的方法，其中所述生物樣品包含自體細胞、組織樣品或吸出物。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述生物樣品包含同種異體細胞、組織樣品或吸出物。
29.一種用于體外產(chǎn)生包含根據(jù)權(quán)利要求1到3、5和6中任一項所述的miRNA、結(jié)合分子和/或雙鏈核酸的外來體和根據(jù)權(quán)利要求24到28中任一項所獲得的外來體的方法，其用于免疫調(diào)節(jié)。
30.一種根據(jù)權(quán)利要求24到29中任一項所述的方法獲得的外來體，其用于治療自身免疫疾病。
31.一種根據(jù)權(quán)利要求24到29中任一項所述的方法獲得的外來體，其通過局部施用而用于治療自身免疫疾病。
32.如權(quán)利要求31所述的外來體，其中所述外來體是使用關(guān)節(jié)注射，優(yōu)選關(guān)節(jié)內(nèi)注射或鼻內(nèi)施加來施用。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求24到29中任一項所述的方法獲得的外來體，其通過全身施用而用于治療自身免疫疾病。
34.一種氮胞苷或其它DNA去甲基化劑的用途，其在如權(quán)利要求24到28中任一項所述的方法中用于處理細胞培養(yǎng)物以增強所述細胞分泌外來體的能力。
35.一種氮胞苷或其它DNA去甲基化劑，其用于體內(nèi)處理組織以增強其分泌關(guān)于如權(quán)利要求I到3中任一項所述的C19MC、miR-371-373和/或miR302_367簇的miRNA有所增多的外來體的能力。
36.一種診斷胚胎植入或精液樣品授精的能力的方法，其包括分別在胚泡或胚胎的細胞培養(yǎng)基中或在精液中鑒別如權(quán)利要求1到3中任一項所述的C19MC簇和/或miR-371-373簇的至少一種miRNA。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述C19MC簇和/或所述miR-371-373簇的所述至少一種miRNA的水平與對照樣品相比相當或有所增加指示所述胚胎植入或精液樣品授精的能力正?；蛴兴鰪姡宜鲋辽僖环NmiRNA的水平與對照樣品相比有所降低指示所述胚胎植入或精液樣品授精的能力降低。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述C19MC簇和/或所述miR-371-373簇的所述至少一種miRNA的存在指示所述胚胎植入或精液樣品授精的能力正?；蛴兴鰪?，且所述簇的所述至少一種miR NA的不存在指示所述胚胎植入或精液樣品授精的能力降低。
【文檔編號】A61K31/7088GK104080911SQ201280058690
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月30日
【發(fā)明者】約恩·布勒尼克, 因加·弗洛爾 申請人:不來梅大學(xué)