專利名稱：一種杜仲提取物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體涉及一種杜仲提取物及其用途。
背景技術：
杜仲為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)的干燥樹皮,是中國名貴滋補藥材。具補肝腎、強筋骨、降血壓、安胎等諸多功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》列為上品。謂其“主治腰膝痛，補中，益精氣，堅筋骨，除陰下癢濕，小便余浙。久服，輕身耐老?！倍胖偈侵袊赜兴幉模渌幱脷v史悠久，在臨床有著廣泛的應用。近年來，國內(nèi)外專家對杜仲成分進行了反復細致的研究，杜仲游離氨基酸極少，含有的少量蛋白質(zhì)，是和絕大多數(shù)食品類似的完全蛋白，即能夠水解檢出對人體必需的8種氨基酸。測定了杜仲所含的15種礦物元素，其中有鋅、銅、鐵等微量元素，及鈣、磷、鉀、鎂等
宏量元素。杜仲具有補肝腎，強筋骨，清除體內(nèi)垃圾，加強人體細胞物質(zhì)代謝，防止肌肉骨骼老化，平衡人體血壓，分解體內(nèi)膽固醇，降低體內(nèi)脂肪，恢復血管彈性，利尿清熱，廣譜抗菌，興奮中樞神經(jīng)，提高白血球數(shù)量，增強人體免疫力等顯著功效。骨代謝疾病是指由多種因素引起骨組織中鈣、磷等礦物質(zhì)、成骨細胞和/或破骨細胞功能異常從而導致骨基質(zhì)、骨細胞代謝紊亂。包括骨質(zhì)疏松癥、骨軟化病、佝僂病等。其中最常見的骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, 0P)已經(jīng)成為世界范圍的、日趨嚴重的重要問題。資料顯示，美國、歐洲和日本受累人數(shù)大約有7500萬，其中1/3為絕經(jīng)后婦女。國內(nèi)的情況亦不容樂觀，據(jù)統(tǒng)計，60 69歲老年婦女骨質(zhì)疏松發(fā)生率高達50% 70%，老年男性發(fā)生率約為30%左右。隨著社會人口老齡化，世界 各國骨質(zhì)疏松的發(fā)生率還會增加。骨質(zhì)疏松因其引起的嚴重后果一骨折和巨額的醫(yī)療費用而受到了社會的高度重視。骨代謝疾病的細胞學本質(zhì)是承擔骨重建任務的成骨細胞(osteoblast，0B)和骨吸收的破骨細胞(osteoclast，0C)數(shù)量和功能比例的失調(diào)，因此成骨細胞數(shù)量上的補充和功能的強化，以糾正失調(diào)的比例就成為了學術界重點關注的熱點之一，也是治療骨質(zhì)疏松的一個方向。骨髓間充質(zhì)干細胞(bMSCs)具有多向分化的功能，在不同的因素調(diào)節(jié)之下，可向著不同細胞(成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞和肌細胞)方向分化。因此誘導和調(diào)節(jié)bMSCs向成骨細胞方向分化，同時抑制bMSCs的成脂分化，也成為目前治療與成骨細胞功能異常相關疾病的熱點。體外培養(yǎng)的bMSCs成骨/成脂分化的指標有多種，最有說服力的指標是已進入分化末端或接近末端出現(xiàn)的特異性標志物。標志物主要包括了形態(tài)學指標、化學特異性染色指標、分子指標(包括特異性基因表達、蛋白表達一Western blot法或免疫細胞化學法)。骨質(zhì)疏松癥在體檢測指標也有多種，主要包括影像學的骨密度、生化的血清標志物、組織學的骨切片、物理學的骨重和抗破壞性力學數(shù)據(jù)，化學分析的無機元素含量和組成比率等。臨床上治療骨質(zhì)疏松癥藥物普遍存在著毒副作用，如雌激素的長期使用將增加乳腺癌或子宮內(nèi)膜增生發(fā)生的風險，二磷酸鹽的使用容易導致骨殘、骨關節(jié)或肌肉疼痛等，因而近年來中藥及中藥提取物對骨質(zhì)疏松癥的防治作用引起了廣泛的關注。中藥普遍具有雙向調(diào)節(jié)作用，毒副作用較小，便于長期服用，因此應用前景廣闊。目前已被證實對骨質(zhì)疏松癥治療有效的單味中藥主要有淫羊藿、杜仲、蛇床子、黃芪、紅曲、骨碎補、葛根、牛膝、續(xù)斷等，中藥提取物(有效組份、有效部位)也有一些報道，目前尚無中藥杜仲的藥效成分用于骨代謝異常疾病的臨床應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以杜仲為原料，提取得到一類具有抗骨質(zhì)疏松藥理活性的物質(zhì)，開拓了杜仲的藥用范圍，也為骨質(zhì)疏松病人提供了一種新的治療用藥選擇。本發(fā)明具體技術方案如下
一種杜仲提取物，由如下步驟制備而成
(1)以杜仲為提取原料，用醇 與水的混合溶液進行提?。?br> (2)將步驟(I)的提取液經(jīng)中性氧化鋁層析柱除去色素，收集洗脫液，濃縮；
(3)使用有機溶劑萃取步驟(2)得到的洗脫液，得到杜仲提取物。上所述杜仲優(yōu)選鹽杜仲，由如下方法制得將杜仲干燥樹皮浸入飽和NaCl溶液中15分鐘，取出晾干，制成小塊或小條，150-180°C烘烤4h，形成鹽杜仲，此步驟為破壞杜仲膠，以使有效成分更多的溶出。上述杜仲可采用粉碎機粉碎，提高提取效率。上述醇與水的混合溶液為甲醇、乙醇或異丙醇中的一種或幾種與水任意比例的混合物。上述步驟(I)優(yōu)選條件為取鹽杜仲粉，60%乙醇室溫浸泡10分鐘，充分溶脹，60°C浸提30分鐘，過濾，殘渣再用60%乙醇60°C浸提30分鐘，合并兩次提取液。上述步驟(2)選用中性氧化鋁層析柱，中性氧化鋁可吸附去除提取液中無用的色素,優(yōu)選100-200目的中性氧化鋁，優(yōu)選采用柱體積為Φ60πιπιΧ80πιπι，填料預先用乙醇飽和。收集過柱后的流出液,濾液全部過柱后,在用IOOml乙醇洗柱，并收集流出液。上述醚類有機溶劑為乙醚、氯仿、正丁醇中的一種或幾種混合物。上述步驟(3)優(yōu)選萃取次數(shù)為3次。本發(fā)明還提供了上述的杜仲提取物在制備預防和治療骨代謝異常疾病的藥物組合物中的應用。本發(fā)明所述骨代謝異常疾病包括骨質(zhì)疏松癥，包括絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥，絕經(jīng)后的骨損失，男性骨質(zhì)疏松癥，皮質(zhì)類固醇誘導的骨質(zhì)疏松癥等；
藥物療法繼發(fā)的或者由于藥物療法，如二苯乙內(nèi)酰脲、甲狀腺激素替代療法，導致的骨損失；
或與不活動和空間飛行有關的骨損失和與類風濕性關節(jié)炎、骨質(zhì)減少、成骨不全、甲狀腺機能亢進、神經(jīng)性厭食癥、器官移植、人工關節(jié)松動有關的骨損失。本發(fā)明所述的藥物組合物，包含本發(fā)明所述的杜仲提取物以及一種或多種可藥用的稀釋劑或載體。本發(fā)明所述的杜仲提取物可以單獨使用或以藥物組合物的形式使用。藥物組合物包括作為活性成分的本發(fā)明的化合物或其可藥用鹽及可藥用載體。較佳的，本發(fā)明的藥物組合物有O. 1-99. 9%重量百分比的作為活性成分的本發(fā)明的化合物或其可藥用鹽。“可藥用載體”不會破壞本發(fā)明的化合物或其可藥用鹽的藥學活性，同時其有效用量，即能夠其藥物載體作用是的用量對人體無毒?！翱伤幱幂d體”包括但不限于離子交換材料、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)(SEDDS^n d-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐溫或其他類似聚合介質(zhì)等藥物制劑用的表面活性劑、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、硅酸鎂等。聚乙烯吡咯酮、纖維素物質(zhì)、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、環(huán)糊精如α-、β_、Y-環(huán)糊精或其經(jīng)化學修飾的衍生物如2-和3-羥丙基-β -環(huán)糊精等羥烷基環(huán)糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促進本發(fā)明的化合物、其藥用鹽或前藥的藥物傳遞。其他可藥用輔料如填充劑(如無水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合劑(如微晶纖維素)、崩解劑(如交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素和交聯(lián)PVP)、潤滑劑(如硬脂酸鎂)、吸收促進劑、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑、潤濕劑、溶劑、增溶劑和著色劑等也可加入本發(fā)明的藥物組合物中。上述本發(fā)明的杜仲提取物以及藥物組合物可通過腸道或者非腸道途徑給藥。非腸道給藥制劑包括注射劑、霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑等。給藥途徑包括皮下、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)注射或輸注，或者，口服、局部、直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、陰道、舌下、皮內(nèi)、粘膜、氣管、尿道給藥，或者通過吸入氣霧或植入蓄積或者針刺方式給藥。上述本發(fā)明的杜仲提取物以及藥物組合物的治療有效量為O. 001-100mg/kg/d之間，可用于相關疾病的單一用藥或聯(lián)合用藥治療，為本領域技術人員能夠理解的范圍。


圖1為本發(fā)明杜仲提取物誘導bMSCs對ALP、PPAR- Y基因表達的影響。圖2為本發(fā)明杜仲提取物進行去勢大鼠灌胃3個月后，體重測定結(jié)果。圖3為本發(fā)明杜仲提取物進行去勢大鼠灌胃3個月后，脛骨抗彎曲力測定。圖4為本發(fā)明杜仲提取物進行去勢大鼠灌胃3個月后，血清ALP測定。
具體實施例方式以下通過實施例說明本發(fā)明的具體步驟，但不受實施例限制。在本發(fā)明中所使用的術語，除非另有說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體實施例并參照數(shù)據(jù)進一步詳細描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。實施例1、杜仲提取物的制備
取杜仲干燥樹皮，浸入飽和NaCl溶液中15分鐘，取出晾干，制成小塊或小條，150-180°C烘烤4h，粉碎機粉碎，制得鹽杜仲粉。取100克鹽杜仲粉，加入300ml 60%乙醇室溫浸泡10分鐘，充分溶脹，60°C水浴30分鐘，抽濾漏斗濾紙減壓過濾，殘渣再一次60°C水浴30分鐘，減壓過濾，合并濾液。濾液加入到填料為中性氧化鋁(100-200目)層析柱中，柱體積為Φ60mmX80mm,填料預先用乙醇飽和。收集過柱后的流出液,濾液全部過柱后,在用IOOml乙醇洗柱，并收集流出液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60°C減壓蒸發(fā)濃縮，直至剩余IOOml左右時結(jié)束。分別使用IOOml乙醚萃取濃縮液3次，收集合并乙醚萃取液，室溫蒸發(fā)乙醚。使用30ml 80%甲醇溶解乙醚蒸發(fā)后的產(chǎn)物，攪拌，SOOOrpm離心5分鐘，取上清得到杜仲粗提物。實施例2、杜仲提取物的制備誘導bMSCs實驗
堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)是細胞成骨分化的標志分子,ALP的升高提示細胞已經(jīng)完成了成骨分化的主要階段。常用RT-PCR、RT-熒光定量PCR、Western blot、免疫細胞化學等方法檢測。1.大鼠 bMSCs 培養(yǎng)
1)2月齡SD大鼠(雌雄不拘)，頸椎脫白法處死，浸入70%乙醇消毒5-10分鐘。無菌條件下剪開腿部皮膚和肌肉，取股骨和脛腓骨，剔凈肌肉，骨兩端剪去端部組織，暴露紅骨髓。用無菌注射器吸取少許培養(yǎng)基，從骨的一段插入骨髓腔中，沖出骨髓細胞于無菌培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)板中，或用骨鉗夾碎骨骼，釋放細胞，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為I X 105/ml后，置培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)板中，放入37 °C，5%C02培養(yǎng)箱中。48小時后首次換液，之后實時換液；
2)細胞生長融合達90%后傳代。傾去培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入O.25%胰酶，消化數(shù)分鐘，傾去胰酶，加入培養(yǎng)基吹打，分瓶，補足培養(yǎng)基，放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中。2-3天后再次傳代。培養(yǎng)基組成DMEM/F12(1:1)，含15%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml，適量 NaHCO3, pH7. 2-7. 4。2.杜仲提取物誘導
將bMSCs接種至6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，培養(yǎng)基血清濃度降為7. 5%，以2 μ g/ml濃度的杜仲提取物進行誘導，并設非誘導的陰性對照組，誘導時間為10天，期間實時換液。3. RNA提取、熒光定量PCR檢測成骨和成脂標志基因表達
I)RNA提取
1.將ImlRNAiso Plus試劑加入到6孔培養(yǎng)板中，震蕩I分鐘，使其裂解培養(yǎng)細胞；
2.將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中，加入0. 2ml氯仿，震蕩，室溫靜置5分鐘；
3.1200rpm離心5分鐘,轉(zhuǎn)移上清液至另一1. 5ml EP管中(約400ul)；
4.加入400ul異丙醇，充分混勻，室溫靜置10分鐘；
5.1200rpm離心5分鐘,棄上清；
6.沉淀加入0.5ml 75%乙醇(DEPC水配制)，上下顛倒洗滌沉淀；
7.1200rpm離心5分鐘，棄上清，室溫充分揮發(fā)乙醇；
8.加入適量(一般20-50ul)DEPC水，溶解沉淀，-80°C保存。2)逆轉(zhuǎn)錄反應1.按下列組份配制RT反應液(反應液配制請在冰上進行)。
權利要求
1.一種杜仲提取物，其特征在于由如下步驟制備而成(1)以杜仲為提取原料，用醇與水的混合溶液進行提??；(2)將步驟(I)的提取液經(jīng)中性氧化鋁層析柱除去色素，收集洗脫液，濃縮；(3)使用有機溶劑萃取步驟(2)得到的洗脫液，得到杜仲提取物。
2.如權利要求1所述的杜仲提取物，其特征在于所述步驟(I)醇與水的混合溶液為甲醇、乙醇或異丙醇中的一種或幾種與水任意比例的混合物。
3.如權利要求2所述的杜仲提取物，其特征在于所述步驟(I)具體為取鹽杜仲粉，60% 乙醇室溫浸泡10分鐘，充分溶脹，60°C浸提30分鐘，過濾，殘渣再用60%乙醇60°C浸提30 分鐘，合并兩次提取液。
4.如權利要求1所述的杜仲提取物，其特征在于所述步驟(2)中性氧化鋁為100-200目。
5.如權利要求4所述的杜仲提取物，其特征在于所述步驟(2)采用95%的乙醇進行洗脫。
6.如權利要求1所述的杜仲提取物，其特征在于所述步驟(3)有機溶劑為乙醚、氯仿、 正丁醇中的一種或幾種混合物。
7.如權利要求6所述的杜仲提取物，其特征在于所述步驟(3)萃取次數(shù)為3次。
8.如權利要求1-7之一所述的杜仲提取物在在制備預防和治療骨代謝異常疾病的藥物組合物中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于所述的藥物組合物中含權利要求1-7之一所述的杜仲提取物以及藥學上可以接受的載體。
10.如權利要求8所述的應用，其中所述骨代謝異常疾病包括骨質(zhì)疏松癥、藥物療法繼發(fā)的或者由于藥物療法導致的骨損失、與不活動和空間飛行有關的骨損失和與類風濕性關節(jié)炎、骨質(zhì)減少、成骨不全、甲狀腺機能亢進、神經(jīng)性厭食癥、器官移植、人工關節(jié)松動有關的骨損失。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種杜仲提取物，由如下步驟制備而成(1)以杜仲為提取原料，用醇與水的混合溶液進行提??；(2)將步驟(1)的提取液經(jīng)中性氧化鋁層析柱除去色素，收集洗脫液，濃縮；(3)使用有機溶劑萃取步驟(2)得到的洗脫液，得到杜仲提取物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述杜仲提取物在在制備預防和治療骨代謝異常疾病的藥物組合物中的應用。
文檔編號A61P19/10GK103040915SQ20131002783
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權日2013年1月25日
發(fā)明者譚湘陵, 羌利民, 張艷紅, 張謙, 錢曉偉 申請人:南通大學