專利名稱：一種組織引導再生用膠原膜的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種組織引導再生用膠原膜的制備方法。
背景技術(shù)：
牙周引導組織再生技術(shù)(guided tissue regeneration, GTR)是目前國際上治療牙周病最先進的技術(shù)。1982年Nymans等首先提出GTR的概念(Nyman S.LindheJ.Karring T, et al.Clin Periodontol.1982 ; 9 (4): 290-296)，GTR 技術(shù)的核心是組織引導再生膜，即通過引導膜作為空間隔離的屏障膜，在防止牙齦結(jié)締組織細胞和結(jié)合上皮細胞向根方遷移的同時，選擇性地使牙周膜細胞和牙槽骨細胞粘附于根面分化形成牙周新附著。這種方法被證明在治療骨內(nèi)和根尖疾病時較開放皮瓣清創(chuàng)術(shù)更能有效的獲得臨床附著和降低探診深度(Kim YK, Yun PY, Kim SG, et al, Oral Surg Oral Med Oral PatholOral Radiol Endod.2009; 107: 5-11) 因此，引導膜的作用至關(guān)重要。隨著GTR技術(shù)在臨床越來越廣泛的運用，引導膜的類型和性能已經(jīng)成為制約其發(fā)展的關(guān)鍵因素。根據(jù)臨床需要，一種有效的引導膜應該具有適當?shù)臋C械強度，以阻擋生長快速的修復組織(上皮和牙齦結(jié)締組織)遠離牙根表面，在根面維持一個受保護的空間；同時該材料應能夠較好地引導牙槽骨細胞生長、分泌，形成新生骨，以增加新生牙槽骨的骨量。另外，良好的生物相容性、臨床可操作性好，能夠穩(wěn)定固著并能保持一段足夠引導組織起效的時間都是影響其應用的重要因素(Kuo SM, Chang SJ, Niu GC, et al, Applied PolymerScience.2009; 112:3127-3134).膠原是結(jié)締組織的主要成分，普遍存在于哺乳動物的皮膚、肌腱、骨骼、韌帶中，具有柔韌性，因其螺旋結(jié)構(gòu)及保持良好的主要序列，僅引起輕微的炎性反應。膠原膜作為可吸收性膜它具有低抗原性，生物相容性好，可參與組織愈合過程，降解速率可根據(jù)需要調(diào)節(jié)等諸多優(yōu)點。Cirelli 等(Wong HL, Cooke J.Dent Clin N Am.2005(49):637-659.)研究表明膠原膜具有良好的生物相容性和引導組織再生功能，而且引導種植體周圍組織再生效果最佳；膠原膜經(jīng)紫外線消毒后，可在一 20°C下儲存，在生物體內(nèi)降解期為6-8周，其降解由唾液酶溶解、機械性破損及上皮細胞分泌的膠原酶破壞完成。Minabe M等(Kim M, Kim J,Lee J, et al.1n Vivo, 2008, 22(3): 231 - 236.)用紫外線等多種方法使膠原分子間產(chǎn)生交鏈，使膠原膜在體內(nèi)降解的時間可以控制，增長其降解時間更利于較大的骨缺損。李成章等采用雙抗膠原膜的制作方法可應用于成品膠原膜的加工，加工改良后的雙抗膠原膜具有較高的交聯(lián)程度，較強的抗酶降解能力，其形態(tài)結(jié)構(gòu)特點及理化性能與牛腱膠原膜相比較更符合引導骨再生技術(shù)要求。膠原膜作為GTR的研究還有一些問題:首先是體內(nèi)降解速度過快，其次相對于GTR膜的要求，膠原膜的抗張強度較小，在應用過程中容易發(fā)生塌陷而失去空間維持能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種組織引導再生用膠原膜的制備方法。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種組織引導再生用膠原膜的制備方法，。包括如下步驟:
(I)將膠原溶于酸性溶液中；
(2 )將步驟(I)所得溶液的pH值調(diào)至5 9 ;
(3)將步驟(2)所得溶液快速剪切攪拌，獲得膠原乳液；
(4)將步驟(3)所得膠原乳液離心，收集溶液上面的膠原膜；
(5)將步驟(4)所得的膠原膜模具成型，冷凍干燥，采用物理或/和化學方法交聯(lián)，SP可。步驟(I)所述酸性溶液為醋酸、鹽酸或檸檬酸溶液，濃度為0.lmol/L 0.5mol/L。步驟(I)所得膠原溶液的濃度為0.5mg/ml-20mg/mlo步驟(2)所述的pH調(diào)節(jié)所用試劑為氫氧化鈉溶液或氨水。步驟(3)所述快速剪切攪拌方法為機械攪拌槳攪拌、組織搗碎攪拌。步驟(3)所述快速剪切攪拌的速度為3000 15000r/min，時間為5s 5min。步驟(4)所述離心的速度為1000r/min 7000r/min,時間為3 10分鐘。步驟(5)所述的物理交聯(lián)方法為紫外交聯(lián)或真空熱交聯(lián)，交聯(lián)溫度100°C -180°C ；所述化學交聯(lián)方法所用交聯(lián)劑為戊二醛溶液、甲醛溶液或1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液。本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明獲得的膠原膜具有優(yōu)異的力學性能和可控降解性能；
(2)本發(fā)明的膠原膜具有梯度的孔隙結(jié)構(gòu)，適合于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和細胞的吸附增殖，能夠較好地引導缺損組織的修復；
(3 )本發(fā)明方法工藝簡單，成本較低，有利于規(guī)模化生產(chǎn)。


圖1為實施例3組織引導再生用膠原膜疏松面數(shù)碼照片；
圖2為實施例3組織引導再生用膠原膜緊密面數(shù)碼照片；
圖3為實施例3組織引導再生用膠原膜疏松面電鏡照片；
圖4為實施例3組織引導再生用膠原膜緊密面電鏡照片；
圖5為實施例3組織引導再生用膠原膜剖面電鏡照片；
圖6為實施例3膠原膜與人牙周韌帶細復合培養(yǎng)第3天電鏡照片(X 1500)
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。以下實施例中所用膠原為sigma公司的膠原蛋白。實施例1
一種組織引導再生用膠原膜的制備方法，包括如下步驟: (1)將膠原在25°C下溶于0.1M的醋酸溶液中，得到濃度為6mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1M的氫氧化鈉溶液緩慢調(diào)節(jié)步驟(I)所得膠原溶液的pH值至7，保持30分
鐘；(3)將步驟(2)所得膠原溶液用電動攪拌機在3000r/min條件下剪切攪拌5分鐘，獲得膠原乳液；
(4)將步驟(3)中的乳液2000r/min離心，離心8分鐘，此時膠原浮于溶劑表面，收集溶液上面的膠原膜；
(5)將步驟(4)所得的膠原膜成型，再冷凍干燥，在120°C條件下真空熱交聯(lián)；
(6)包裝，輻照滅菌。樣品撕裂強度:31.0MPa.實施例2
一種組織引導再生用膠原膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在30°C下溶于0.1M的鹽酸溶液中，得到濃度為5mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1M的氫氧化鈉溶液緩慢調(diào)節(jié)步驟(I)所得膠原溶液的pH值至5，保持10分
鐘；
(3)將步驟(2)的膠原溶液用組織搗碎機在15000r/min條件下剪切攪拌5秒，獲得膠原乳液；
(4)將步驟(3)中的乳液1000r/min離心，離心10分鐘，此時膠原浮于溶劑表面，收集溶液上面的膠原膜；
(5)將步驟(4)所得的膠原膜成型，一20°C冷凍干燥，在140°C條件下真空熱交聯(lián)；
(6)將步驟(5)所得的膠原膜放入1%的戊二醛溶液中浸泡10小時，取出，用去離子水沖洗3次，一 20°C冷凍干燥。(7)將步驟(6)所得膠原膜包裝，輻照滅菌。樣品撕裂強度:30.2MPa。實施例3
一種組織引導再生用膠原膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在4°C下溶于0.1M的鹽酸溶液中，得到濃度為10mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1M的氨水緩慢調(diào)節(jié)步驟(I)所得膠原溶液的pH值至8，保持10分鐘；
(3)將步驟(2)所得的膠原溶液用組織搗碎機在15000r/min條件下剪切攪拌15秒，獲得膠原乳液；
(4)將步驟(3)中的乳液6000r/min離心，離心5分鐘，此時膠原浮于溶劑表面，收集溶液上面的膠原膜；
(5)將步驟(4)所得的膠原膜成型，-20°C冷凍干燥，在110°C條件下真空熱交聯(lián)；
(6)將步驟(5)所得的膠原膜放入1%的EDC-NHS溶液(按EDC/NHS=1:4的質(zhì)量比稱取一定量，置于水中配成質(zhì)量濃度為1%的溶液)中浸泡10小時，取出，用去離子水沖洗3次，-20°C冷凍干燥。(7)將步驟(6)所得膠原膜包裝，輻照滅菌。樣品撕裂強度:35.5MPa.實施例4
一種組織引導再生用膠原膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在4°C下溶于0.1M的醋酸溶液中，得到濃度為0.5mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1M的氨水緩慢調(diào)節(jié)步驟(I)所得膠原溶液的pH值至8，保持10分鐘；(3)將步驟(2)所得的膠原溶液用組織搗碎機在15000r/min條件下剪切攪拌20秒，獲得膠原乳液；
(4)將步驟(3)中的乳液7000r/min離心，離心3分鐘，此時膠原浮于溶劑表面，收集溶液上面的膠原膜；
(5)將步驟(4)所得的膠原膜成型，-20°C冷凍干燥，在100°C條件下真空熱交聯(lián)；
(6)將步驟(5)所得的膠原膜放入0.5%的甲醛溶液中浸泡10小時，取出，用去離子水浸泡、沖洗3次，-20°C冷凍干燥；
(7)將步驟(6)所得膠原膜包裝，輻照滅菌。樣品撕裂強度:3L 2MPa。實施例5 一種組織引導再生用膠原膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在30°C下溶于0.5M的鹽酸溶液中，得到濃度為20mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.5M的氫氧化鈉緩慢調(diào)節(jié)步驟(I)所得膠原溶液的pH值至9，保持10分鐘；
(3)將步驟(2)所得的膠原溶液用組織搗碎機在10000r/min條件下剪切攪拌30秒，獲得膠原乳液；
(4)將步驟(3)中的乳液6000r/min離心，離心4分鐘，此時膠原浮于溶劑表面，收集溶液上面的膠原膜；
(5)將步驟(4)所得的膠原膜成型，-20°C冷凍干燥，在180°C條件下真空熱交聯(lián)；
(6)將步驟(5)所得的膠原膜放入1%的EDC-NHS溶液中浸泡10小時，取出，用去離子水沖洗3次，-20°C冷凍干燥；
(7 )將步驟(6 )所得膠原膜包裝，輻照滅菌。樣品撕裂強度:30.0MPa0實施例6
一種組織引導再生用膠原膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在10°c下溶于0.5M的醋酸溶液中，得到濃度為15mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.5M的氨水緩慢調(diào)節(jié)步驟(I)所得膠原溶液的pH值至5，保持10分鐘；
(3)將步驟(2)所得的膠原溶液用組織搗碎機在15000r/min條件下剪切攪拌10秒，獲得膠原乳液；
(4)將步驟(3)中的乳液6000r/min離心，離心7分鐘，此時膠原浮于溶劑表面，收集溶液上面的膠原膜；
(5)將步驟(4)所得的膠原膜成型，-20°C冷凍干燥，在180°C條件下真空熱交聯(lián)；
(6)將步驟(5)所得的膠原膜放入1%的EDC-NHS溶液中浸泡10小時，取出，用去離子水沖洗3次，一 20°C冷凍干燥；
(7 )將步驟(6 )所得膠原膜包裝，輻照滅菌。樣品撕裂強度:34.8MPa。實施例7
一種組織引導再生用膠原膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在4°C下溶于0.2M的檸檬酸溶液中，得到濃度為10mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.2M的氨水緩慢調(diào)節(jié)步驟(I)中膠原溶液的pH值至7，保持10分鐘；(3)將步驟(2)所得的膠原溶液用電動攪拌機在8000r/min條件下剪切攪拌2分鐘，獲得膠原乳液；
(4)將步驟(3)中的乳液6000r/min離心，離心5分鐘，此時膠原浮于溶劑表面，收集溶液上面的膠原膜；
(5)將步驟(4)所得的膠原膜成型，-20°C冷凍干燥，再用紫外線照射30分鐘交聯(lián)；
(6)將步驟(5)所得的膠原膜放入1%的EDC-NHS溶液中浸泡10小時，取出，用去離子水沖洗3次，-20°C冷凍干燥；
(7)將步驟(6)所得膠原膜包裝，輻照滅菌。樣品撕裂強度:37.3MPa。效果實驗
一、體外膠原酶降解實驗
取膠原膜各1mg分別置于含有100U膠原酶的2mlStock緩沖液中(lOmMTris，25mMCaCl2, 1OOml蒸餾水，PH7.5)，37°C恒溫，記錄膜完全降解時間?？瞻讓φ战M為2mlStock緩沖液。實驗結(jié)果見表1。
權(quán)利要求
1.一種組織引導再生用膠原膜的制備方法，包括如下步驟: (I)將膠原溶于酸性溶液中； (2 )將步驟(I)所得溶液的pH值調(diào)至5-9 ； (3)將步驟(2)所得溶液快速剪切攪拌，獲得膠原乳液； (4)將步驟(3)所得膠原乳液離心，收集溶液上面的膠原膜； (5)將步驟(4)所得的膠原膜模具成型，冷凍干燥，采用物理或/和化學方法交聯(lián)，SP可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述酸性溶液為醋酸、鹽酸或檸檬酸溶液，濃度為0.lmol/L 0.5mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)所得膠原溶液的濃度為0.5mg/ml-20mg/ml ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的pH調(diào)節(jié)所用試劑為氫氧化鈉溶液或氨水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述快速剪切攪拌方法為機械攪拌槳攪拌、組織搗碎攪拌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述快速剪切攪拌的速度為3000 15000r/min,時間為 5s 5min。
7.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述離心的速度為IOOOr/min 7000r/min,時間為3 10分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)所述的物理交聯(lián)方法為紫外交聯(lián)或真空熱交聯(lián)，交聯(lián)溫度100°C -180°C ;所述化學交聯(lián)方法所用交聯(lián)劑為戊二醛溶液、甲醛溶液或1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種組織引導再生用膠原膜的制備方法。包括如下步驟將膠原溶于酸性溶液中；將所得溶液的pH值調(diào)至5-9；繼續(xù)將所得溶液快速剪切攪拌，獲得膠原乳液；將所得膠原乳液離心，收集溶液上面的膠原膜；所得膠原膜經(jīng)模具成型，冷凍干燥，采用物理或/和化學方法交聯(lián)，即可。本發(fā)明獲得的膠原膜具有優(yōu)異的力學性能和可控降解性能，且具有梯度的孔隙結(jié)構(gòu)，適合于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和細胞的吸附增殖，能夠較好地引導缺損組織的修復；本發(fā)明的制備工藝簡單，成本較低，有利于規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號A61L31/04GK103071189SQ20131003078
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者任力, 季培紅, 秦曉杰, 王迎軍, 劉卅 申請人:廣州華美康聯(lián)生物科技有限公司