專利名稱：用于反差成像的充氣微泡組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及充氣微泡組合物，適合用作診斷和/或治療成像的造影劑，涉及診斷/治療成像方法，包括所述組合物的使用，并且涉及所述組合物的制備方法。
背景技術：
近年來，超聲波造影劑的快速發(fā)展，業(yè)已產生了大量不同的配方，可將它們用于人類或動物肌體器官和組織的超聲波反差成像。這些制劑被設計成主要用作靜脈內或動脈內可注射的形式，與醫(yī)學回聲探測設備組合使用，該設備例如采用B-模式圖像生成(根據(jù)反向散射組織特性的空間分布)或多普勒信號處理(根據(jù)超聲回聲的等幅波或脈沖式多普勒處理確定血液或液體流動參數(shù))。一組可用作超聲波造影劑的可注射制劑包括直徑為幾個微米的氣泡分散在含水介質中的懸浮液。特別感興趣的是通過合適的添加劑穩(wěn)定化的氣泡，例如乳化劑，油，增稠劑或糖類，或通過將氣體或它的前體夾帶或包埋在多種系統(tǒng)中。在本領域中所述穩(wěn)定化的氣泡一般被稱作〃微泡〃，并且可以劃分成兩個主要類型。第一種類型的穩(wěn)定化的氣泡或微泡在本領域中一般被稱作〃微泡〃，并且包括含水懸浮液，其中，氣泡通過非常薄的外被(薄膜)約束在氣體/液體界面處，所述外被包括位于氣體與液體界面上的穩(wěn)定 化的兩親性材料。微泡懸浮液通常是通過如下方式制備:讓粉末狀兩親性材料，例如，冷凍干燥的預先成型的脂質體或冷凍干燥的或噴霧干燥的磷脂溶液與空氣或其他氣體接觸，然后與含水載體接觸，同時攪拌，以便產生微泡懸浮液，然后就可以服用，優(yōu)選在制備之后不久服用。氣體微泡的含水懸浮液及其制備的例子可以參見，例如US 5，271，92，US5，445，813，US 5，413，774，US 5，556，610，5，597，549，US 5，827，504，WO 97/29783 和待批的國際專利申請PCT/IB04/00243，以它們的全文形式收作本文參考。第二種類型的微泡在本領域中一般被稱作〃微球〃或〃微囊〃，并且包括懸浮液，其中，氣泡是由類脂或天然或合成聚合物的固體材料外被包圍的。微囊及其制備的例子可以參見，例如，US 5，711，933和US 6，333，021，以它們的全文形式收作本文參考。除了其他特征之外，微泡制劑還以它們各自的平均尺寸和尺寸分布為特征(它們提供了有關微泡群體如何分散在平均尺寸周圍的線索)。微泡制劑的尺寸分布一般與高斯型分布類似，集中在它們的平均尺寸值附近。反差成像基于充氣微泡在受到由超聲波探頭以某種頻率發(fā)射的超聲波的沖擊時產生共振，因此反射相應的回聲信號，該信號通過超聲波探頭檢測并隨后成像的能力。由于造影劑的回聲反應相對組織或器官本身的回聲反應而言是相當特殊的，因此容納在血管中的造影劑可以相對周圍的組織或器官方便地成像。充氣微泡的共振能力取決于多種因素，其中包括它的尺寸與穿透輻射的頻率的兼容性。作為一般指示，較小的微泡在較高的頻率下共振，而較大的微泡在較低的頻率下共振。另外，反射的回波強度一般與具有所述預定兼容尺寸的微泡的濃度成正比，例如，所述濃度是以所述微泡所攜帶的氣體總體積的形式表達的。本申請人現(xiàn)在業(yè)已發(fā)現(xiàn)，對于特定造影劑來說，可以確定優(yōu)選的尺寸范圍和相應的尺寸分布，它適合對確定的傳輸頻率作出反應。正如本申請人所發(fā)現(xiàn)的，在低頻率(例如，大約1.5-大約3.5MHz)下，所述尺寸分布通常具有較大的中位數(shù)直徑(例如，Dv50為大約4 μ m)，并且一般是較寬的；這一發(fā)現(xiàn)與以下事實吻合:常規(guī)的寬范圍分布的充氣微泡一般可用于在這種低頻率下進行反差成像，因為有足夠多數(shù)量的微泡可用于在受到特定低頻率超聲波的轟擊時共振。另一方面，在較高頻率(例如，5MHz或以上)時，合適反應性的微泡的尺寸分布實質上是較窄的。另外，所述窄的分布一般與相應的較小的Dv5tl值(例如，大約1-2.5 μ m)相關，符合以下事實，S卩小的微泡在較高的頻率下共振。這一發(fā)現(xiàn)還與以下事實吻合:常規(guī)較寬范圍分布的微泡制劑一般在高頻率反差成像時反應性較低，因為其中所包含的小尺寸微泡的比例較低。因此，在將高傳輸頻率用于超聲成像時，具有較窄的尺寸分布并具有較小的中值尺度(特別是Dv5tl)的適當校準的充氣微泡制劑可用于有效的反差成像，不過所述制劑在低傳輸頻率下使用時不夠有效。一般，將較低的傳輸頻率(例如，0.5-2MHz)用于身體深處部位的回聲探測分析，如心臟用途，而較高的傳輸頻率(例如，5-7，并且可高達10-15MHZ) —般被用于腹部(例如，腎臟，肝臟等)或淺表分析(例如，眼科學，乳腺分析等)。較高的傳輸頻率(例如，15-20MHZ，并且可高達80MHz)還可用于特殊用途。例如，用于血管內超聲成像。

本申請人業(yè)已發(fā)現(xiàn)了適合對至少兩種具有不同頻率的特定的超聲波提供有效的回聲反應的新型組合物。正如本申請人所發(fā)現(xiàn)的，所述有效的回聲反應可以通過適當?shù)馗淖兂錃馕⑴葜苿┑某叽绶植极@得。有利的是，所述制劑包括有效量的具有較小尺寸的微泡，因此能對相應的較高的特定傳輸頻率作出反應，以及有效量的具有較大尺寸的微泡，能對相應地較低的特定傳輸頻率作出反應，不過，所述有效量的大尺寸的微泡足夠少，以便不會過分減弱小尺寸微泡在特定高傳輸頻率下的反應。國際專利申請WO 98/32468披露了包括兩種或兩種以上類型的含有氣體的微粒的組合物，它們對超聲波壓力具有不同的敏感性。優(yōu)選的組合物是這樣的，它所包含的第一種類型的微粒具有較柔軟的封裝外殼(如具有磷脂外殼的微泡)和第二種類型的具有較硬封裝材料的微粒(如聚合物或蛋白外殼微囊)。具體地講，所述專利的例I披露了包括氫化卵磷脂酰絲氨酸的微泡與含有聚合物的微囊的混合物，該聚合物包括以下結構式的重復單元:-O- (CH2)a-CO-O-CH (CH3) -0-C0- (CH2)a-CO-O (CH2)b-CO-,其中，a是9-19的整數(shù)，b是1-8的整數(shù)。WO 01/68150披露了具有穩(wěn)定化外被的微囊，它包括聚烷基氰基丙烯酸酯聚合物。發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及用于診斷和/或治療成像的組合物，它包括充氣微泡的至少兩種不同的制劑，其中，所述至少兩種不同的制劑的非線性回聲探測反應的相應的峰彼此相差至少2MHz，優(yōu)選相差至少3MHz。
根據(jù)一種優(yōu)選實施方案，所述非線性回聲探測反應的相應峰大約為1.5-大約IOMHz0優(yōu)選的是，所述組合物包括非線性回聲探測反應峰為3MHz或以下，更優(yōu)選1.5-3MHz的微泡的第一種制劑，和非線性回聲探測反應峰為5MHz或以上，更優(yōu)選5-lOMHz的微泡的第二種制劑。根據(jù)另一種優(yōu)選實施方案，所述微泡的不同制劑具有不同中位數(shù)直徑的各自的尺寸分布。優(yōu)選的是，所述尺寸分布是由各自的至少第一和至少第二體積中位數(shù)直徑(Dv5tl)確定的，所述第一和第二 Dv5tl彼此相差的值為至少0.5 μ m,更優(yōu)選至少1.0 μ m,更優(yōu)選至少1.5μπι。優(yōu)選的是，根據(jù)直徑至多IOym的微泡群體計算的包含在所述微泡中的氣體總體積的至少95%，包含在直徑為8微米或以下的微泡中。根據(jù)另一種優(yōu)選實施方案，所述至少兩種類型的微泡中的至少一種的尺寸分布是由所述體積平均直徑和相應的數(shù)量平均直徑(Dv/Dn)之間的各自的比例確定的，所述類型的充氣微泡的至少一種的Dv/Dn比例為1.2-3，優(yōu)選為1.2-2。本發(fā)明的另一方面涉及包括用于診斷成像的充氣微泡的組合物，其中，所述充氣微泡的尺寸分布的Bowley偏度為0.16或以上。優(yōu)選的是，包含在所述微泡中的氣體總體積的至少95%包含在直徑為8微米或以下的微泡中。在本說明書和權利要求書中，Bowley偏度是根據(jù)充氣微泡制劑或組合物的體積尺寸分布的實驗曲線計算的，該計算是在直徑高達8 μ m的微泡群體中計算的。本發(fā)明的另一方面涉及使包括充氣微泡的組合物對第一傳輸頻率具有非線性回聲探測反應峰，對第二傳輸頻率具有增強的回聲探測反應的方法，該方法包括將所述組合物與對所述第二頻率具有非線性回聲探測反應的各自的峰的充氣微泡的第二組合物混合。優(yōu)選的是，所述第一和第二頻率彼此相差至少2MHz，更優(yōu)選相差至少3MHz。本發(fā)明的另一方面涉及生產對至少兩種不同的傳輸頻率具有有效的回聲探測反應的超聲波造影劑的方法，該方法包括混合充氣微泡的至少兩種不同的制劑，所述充氣微泡的非線性回聲探測反應的 各自的峰彼此相差至少2MHz，優(yōu)選相差至少3MHz。優(yōu)選的是，所述充氣微泡的至少兩種不同的制劑具有適應對所述至少兩種不同的傳輸頻率的有效反應的各自不同的尺寸分布。本發(fā)明的另一方面涉及診斷和/或治療成像方法，它包括給患者服用有效量的上述組合物。附1表示比較的微泡尺寸分布的示意圖。圖2表示本發(fā)明組合物的尺寸分布與常規(guī)制劑的示意性寬的尺寸分布比較的示意圖。圖3表示用于計算為特定傳輸頻率的最佳尺寸分布的示意性方法。圖4表示計算的最佳尺寸分布。圖5-9表示根據(jù)本發(fā)明實施例的實驗制劑的尺寸分布。

圖10表示確定Bowley偏度的參數(shù)的示意圖。圖11表示用于測量微泡制劑的回波功率反應的實驗裝置的示意圖。圖12表示實驗微泡制劑在不同傳輸頻率下的比較性回波功率反應。圖13表示本發(fā)明組合物與商業(yè)超聲波造影劑的尺寸分布的比較。
詳細說明充氣微泡的尺度和尺寸分布可以通過許多參數(shù)表征，最常用的參數(shù)是數(shù)量平均直徑Dn和體積平均直徑Dv。數(shù)量直徑提供了對微泡的平均數(shù)量尺寸的指示，體積直徑提供了有關微泡中夾帶的氣體總體積在它的群體中是如何分布的信息。用于表征充氣微泡群體的其他有用的參數(shù)是Dv5tl,Dv9tl或Dv95直徑。這些參數(shù)表示微泡中夾帶的氣體的百分比(分別為50,90或95%),所述微泡的直徑等于或小于所述值。因此,例如，Dv9tl=IO μ m表示所述微泡制劑的氣體總體積的90%被包含在直徑為ΙΟμπι或以下的微泡中。所述Dv5tl值確定了尺寸分布的體積中位數(shù)直徑。而理論上單一尺寸的微泡將表現(xiàn)出相同的Dn和Dv或Dv5tl值，實驗制劑中窄的或寬的尺寸分布將分別確定Dn和Dv值之間的相應的小的和大的差異，及由此而來的Dv/Dn比例的相應變化。因此，Dv/Dn比例的值可用于估算充氣微泡的特定群體的尺寸分布有多少是分散在它的平均值周圍；一般，尺寸分布越寬，Dv/Dn比例的值越大。因此，例如，主要包括小微泡(例如，直徑為2 μ m左右的微泡)實質上沒有大氣泡(例如，直徑超過
8μ m的氣泡)的群體，它所表現(xiàn)出的Dv值接近于Dn值，具有相應較低的Dv/Dn比例。相反，主要包含小微泡但仍然具有小比例的大氣泡的群體，能表現(xiàn)出較高的Dv值，及相應較高的Dv/Dn比例。一般，微泡群體表現(xiàn)出的Dv/Dn比例小于大約2，可以被認為是窄范圍分布的；這些微泡還可以被稱作〃校正的〃微泡。另一方面，Dv/Dn比例大約為3或以上的微泡群體一般可以被認為具有寬的分布。圖1和2表示本發(fā)明有利方面的例子，其中，組合至少兩種不同的充氣微泡制劑，以便獲得對至少兩種不同傳輸頻率的有效的回聲探測反應。在圖1中，實線11表示在典型的具有寬尺寸分布(BM)的微泡群體中，氣體體積相對于微泡尺寸的正規(guī)化分布的示意圖。虛線12表示在分布狹窄的微泡的第一群體中的氣體體積的正規(guī)化分布的示意圖(匪1)，所述微泡的Dv5tl值為1.9 μ m,所述尺寸分布適合對第一傳輸頻率作出有效反應。虛線13表示在相對較少的分布狹窄的微泡的第二群體中氣體體積的正規(guī)化分布的示意圖(匪2 )，所述微泡的Dv5tl值為4.1 μ m，所述尺寸分布適合對第二傳輸頻率f2作出有效反應。為了清楚起見，業(yè)已將對稱性高斯型分布用于BM，匪I和匪2的尺寸分布的示意性表示，同時正如在說明書的以下部分所表明的，實驗性尺寸分布形式一般會相對所述對稱分布或多或少地扭曲。當特定的傳輸頻率f I轟擊BM或匪I的微泡時，具有與所述頻率兼容的尺度(即主要是包含在由與傳輸頻率兼容的尺寸周圍限定的限幅(slice) SI中的那些)的所述微泡的各個部分會共振，并且反射具有特定強度的回聲信號。所述反射的回聲信號的強度大體上與包含在由12 (匪I)或11 (BM)以下的SI確定的各個部位所包含的氣體的體積成比例。從圖1中可以看出，在12下面所限定的SI的部位所包含的氣體的體積遠遠大于在11下面所限定的相同限幅中所包含的相應的氣體體積，因此，導致了更強的反射回聲，并最終導致了更好的圖像增強。當?shù)诙€較低的傳輸頻率f2轟擊BM或匪2的限幅S2中的兼容性微泡時，會產生類似的結果。在圖2中，實線21表示通過以1:1的體積比混合匪I和匪2獲得的組合的組合物(CC)的氣體體積的正規(guī)化分布的示意圖。虛線22表示以前的制劑BM的微泡中的氣體體積的正規(guī)化尺寸分布。從該附圖中可以看出， 本發(fā)明這一方面的組合的組合物使得可以將有效體積的氣體用于尺寸與兩種傳輸頻率Π和f2兼容的微泡中。相反，使用常規(guī)BM制劑將會限制單一傳輸頻率f2的組合。在所述具體例子中，相對于BM，與CC中的頻率fl兼容的較大數(shù)量的微泡會產生相應的較強的回聲反應。這種較強的回聲反應會導致有效的回聲反差成像，即使是在存在較大數(shù)量的較大的微泡的情況下，而大微泡除了不會對特定的頻率作出反應外，主要有助于信號的減弱，包括發(fā)射信號和反射信號的減弱。值得指出的是，盡管BM在限幅SI各個部位的反應理論上講可以通過它的氣體總體積增加(B卩，使用較大數(shù)量的BM制劑)而增強，不過，這種增強在實踐中可能是不希望的。一個原因是，一般優(yōu)選將造影劑的濃度保持盡可能得低(與可接受的成像增強一致)，以便避免它所產生的任何可能的副作用。另一個原因是，BM中氣體總體積的增加能決定較大微泡部分的相應的增加，它會決定超聲波信號的無法接受的減弱。正如本申請人所發(fā)現(xiàn)的，本發(fā)明組合物的尺寸分布形式(在用曲線作圖時以微泡尺寸為橫坐標，以正規(guī)化體積百分比為縱坐標)相對于由單一微泡制劑限定的典型的尺寸分布形式而言是相當特殊的。一般，后者實際上可能類似于大體上的高斯型分布，又被稱作高斯型分布，在它的右半部分具有大體上略微分散的分布。對稱的高斯型分布的分布偏差，即分散，可以通過常規(guī)參數(shù)形式，如“偏度”來表示。正如本領域所公知的，偏度是對稱性指標，或更確切地講，缺少分布或數(shù)據(jù)集的對稱性。在文獻中可以查閱到對偏度的可靠的測量標準。有用的偏度系數(shù)是〃偏度的Bowley系數(shù)〃(Elements of statistics, New York:Charles Scribner’s Sons, 1920),又被稱作〃四分位數(shù)偏度系數(shù)〃,它是通過以下公式定義的:
權利要求
1.用于診斷和/或治療成像的組合物，它包括通過兩親性材料的薄膜層穩(wěn)定化的充氣微氣泡的至少兩種不同制劑的混合物，所述制劑具有有著不同中值粒徑的各自的尺寸分布；其中， (a)所述至少兩種不同的制劑具有彼此相差至少2MHz的非線性回聲探測反應的各自的峰； (b)根據(jù)直徑至多IOym的微泡群體確定的包含在所述微泡中的氣體總體積的至少95%被包含在直徑為8 μ m或以下的微泡中。
2.如權利要求1的組合物,其中,所述非線性回聲探測反應的峰彼此相差至少3MHz。
3.如權利要求1的組合物，其中，所述非線性回聲探測反應的各自峰為大約1.5-大約IOMHz。
4.如權利要求1的組合物，其中，所述至少兩種制劑具有為3MHz或以下和5MHz或以上的非線性回聲探測反應的各自峰。
5.如權利要求1的組合物，其中，所述中值粒徑是由各自的至少第一和至少第二體積中值直徑(Dv5tl)確定的，所述第一和第二 Dv5tl的值彼此相差為至少0.5 μ m。
6.如權利要求1的組合物，其中，所述第一和第二Dv5tl的值彼此相差至少1.Ομπι。
7.如上述權利要求中任意一項的組合物，其中，所述至少兩個組的微泡的尺寸分布是由所述體積平均直徑和相應的數(shù)量平均直徑(DV/DN)之間的各自的比例確定的，所述充氣微泡中的至少一組的Dv/Dn比例為1.2-3。
8.如權利要求1的組合物，其中，所述兩親性材料是磷脂。
9.如上述權利要求中任意一項的組合物，還包括生理學上可接受的含水載體。
10.如權利要求1-8中任意一項的組合物，其中，所述充氣微泡是在與生理學上可接受的含水載體接觸時可以重構的干粉形式的。
11.如上述權利要求中任意一項的組合物，其中，所述充氣微泡包括靶向配體，診斷劑，生物活性劑或它們的任意組合。
12.如權利要求1-8中任意一項的組合物，其中，所述充氣微泡的制劑的至少一種包括靶向配體、診斷劑、生物活性劑或它們的任意組合。
13.生產造影劑的方法，所述造影劑對至少兩種不同傳輸頻率具有診斷有效的回聲反應，該方法包括混合充氣微泡或其前體的至少兩種不同的制劑，所述兩種不同的制劑具有彼此相差至少2MHz的非線性回聲探測反應的各自的峰；其中根據(jù)直徑至多10 μ m的微泡群體確定的包含在所述微泡中的氣體總體積的至少95%被包含在直徑為8 μ m或以下的微泡中。
14.如權利要求13的方法，其中，所述前體是干粉形式的，在可以藥用的液體載體中重構時能形成所述微泡制劑。
15.如權利要求13的方法，其中，所述前體是通過將磷脂分散在由水和與水不混溶的有機溶劑所形成的乳液中而獲得的微乳劑，所述乳液在存在低溫保護劑的情況下冷凍干燥，并且隨后用可以藥用的液體載體重構時形成了微泡制劑。
16.如權利要求14的方法，其中，所述充氣微泡或其前體的至少兩種不同的制劑是以組合制劑形式直接獲得的 ，包括將不同的工藝參數(shù)應用在相同的制劑混合物上。
17.診斷和/或治療試劑盒，包括干粉形式的如權利要求1-11中任意一項的組合物，和生理學上可接受的含水載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型組合物，其包含用于反差成像的充氣微泡，它特別適合對具有不同頻率的至少兩種特定的超聲波提供有效的回聲反應。所述組合物優(yōu)選包括至少兩種充氣微泡的不同的制劑，它們的非線性回聲探測反應的各自的峰彼此相差至少2MHz，并且優(yōu)選具有不同中值粒徑的各自的尺寸分布。具體地講，所述制劑優(yōu)選具有這樣的尺寸分布使各自的DV50值彼此相差至少0.5μm，更優(yōu)選至少1.0μm?；蛘?，所述組合物的體積尺寸分布表現(xiàn)出Bowley偏度值為0.16或以上。根據(jù)一種優(yōu)選實施方案，根據(jù)直徑至多10μm的微泡群體計算，包含在所述微泡中的氣體總體積的至少95%包含在直徑為8微米或以下的微泡中。
文檔編號A61K49/22GK103120799SQ201310032548
公開日2013年5月29日 申請日期2005年8月17日 優(yōu)先權日2004年8月18日
發(fā)明者P·比薩, P·弗蘭金, C·吉約, M·施奈德 申請人:博萊科瑞士股份有限公司