全人源的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2胞外區(qū)的單鏈抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程抗體【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種全人源抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)胞外區(qū)的單鏈抗體AK506的制備方法和用途。本發(fā)明公開了AK506的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)免疫球蛋白分子的氨基酸序列，包括對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的序列。本發(fā)明還提供獲得和表達(dá)AK506的方法，即從天然人源噬菌體抗體庫(kù)中篩選得到一株全人源抗VEGFR2胞外區(qū)的單鏈抗體AK506，然后通過(guò)原核細(xì)胞分泌表達(dá)、親和層析純化獲得單鏈抗體。本發(fā)明的單鏈抗體可特異性結(jié)合于VEGFR2胞外區(qū)，可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的生長(zhǎng)，可應(yīng)用于制備診斷劑和治療劑。
【專利說(shuō)明】全人源的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2胞外區(qū)的單鏈抗體 及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種新的可與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體 2 (VEGFR2)胞外區(qū)特異結(jié)合的高親和力全人源單鏈抗體，能抑制VEGFR的活化，從而抑制高 表達(dá)VEGFR的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)的生長(zhǎng)，是一種具有抗腫瘤活性的基因工程抗體。 【背景技術(shù)】
[0002] 以新生血管為靶點(diǎn)對(duì)腫瘤進(jìn)行生物治療成為新的研究熱點(diǎn)，其優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在： 腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞是藥物經(jīng)靜脈途徑首先到達(dá)的部位、不易產(chǎn)生耐藥性、腫瘤血管內(nèi)腫瘤 血管內(nèi)皮細(xì)胞的有限損害就可造成大量腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、抗腫瘤血管治療具有一定的 廣譜性等。目前，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)是迄 今鑒定出來(lái)的最重要的血管生成因子，可作為腫瘤代謝及轉(zhuǎn)移的標(biāo)記。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 受體（VEGFR)是VEGF的特異性受體，通過(guò)與相應(yīng)的VEGF結(jié)合刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷 移、促進(jìn)新生血管的生成，與機(jī)體多種常見(jiàn)腫瘤的發(fā)病及腫瘤的轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。
[0003] 最近，以VEGF/VEGFR作為靶標(biāo)的抗腫瘤藥物的研發(fā)取得了很大的進(jìn)展，已有數(shù) 種上市進(jìn)入臨床試驗(yàn)。針對(duì)VEGF/VEGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑研發(fā)的抗腫瘤藥物包括中和VEGF/ VEGFR的抗體（如貝伐單抗、頂C21121B)、可溶的VEGFR類蛋白（VEGF-Trap)和酪氨酸激酶 抑制劑（索拉非尼、舒尼替尼）等，其中VEGF的人源化抗體貝伐單抗是第一個(gè)被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市的抗血管生成藥物。
[0004] 目前發(fā)現(xiàn)的VEGFRs主要有5種類型，有3種屬于酪氨酸激酶受體，分別是 VEGFR-1 (Flt-1) > VEGFR-2 (kinase insert domain-containing receptor, KDR/Flk-1)和 VEGFR-3 (Flt-4)。VEGFR2 (人VEGFR2稱為KDR)作為VEGF的主要受體之一，在介導(dǎo)VEGF的 內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化、微管形成、血管通透性增加等一系列生物活性中發(fā)揮重要作用。
[0005] 單克隆抗體根據(jù)其序列來(lái)源的不同分為鼠源抗體，嵌合抗體（小鼠的可變區(qū)和人 的恒定區(qū)），人源化抗體（人和鼠的互補(bǔ)性決定區(qū)），人源抗體。鼠源抗體經(jīng)臨床多次用藥 后，人體內(nèi)易產(chǎn)生抗鼠抗體，使其臨床療效減弱或消失，而人源抗體可以降低抗體藥物在人 體的免疫原性，因此2000年以來(lái)人源抗體得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。2004年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)的抗 VEGF抗體貝伐單抗（Avastin)在臨床與化療藥物聯(lián)合治療結(jié)腸直腸癌有明顯的延長(zhǎng)病人 生命的效果。然而，封閉VEGF治療腫瘤的同時(shí)也抑制了 VEGF的正常生理功能，病人使用后 會(huì)引起高血壓、出血和血栓形成。因此，靶向VEGFR2的全人源抗體能降低免疫原性，而且特 異性拮抗VEGFR的抗體相對(duì)于拮抗VEGF而言其特異性及針對(duì)性更強(qiáng)，并能避免對(duì)VEGF的 全面封閉所產(chǎn)生的副作用。另外分子量只有全長(zhǎng)抗體的1/6的抗VEGFR2單鏈抗體可以通 過(guò)E. coli發(fā)酵降低生產(chǎn)成本。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的
[0007] 本發(fā)明提供一種具有潛在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)價(jià)值的全人源抗人VEGFR2胞外區(qū)的單鏈抗 體。本發(fā)明單鏈抗體的特征為特異性結(jié)合人VEGFR2胞外區(qū)，在體外能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞HUVEC的生長(zhǎng)。
[0008] 技術(shù)方案
[0009] 一種全人源的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 (VEGFR2)胞外區(qū)的單鏈抗體，其特征 在于：
[0010] 抗VEGFR2胞外區(qū)的單鏈抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，并且重鏈可變和輕 鏈可變區(qū)通過(guò)柔性肽連接，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0 :1 ;輕鏈可變區(qū)為SEQ ID NO :2的氨基酸序列，柔性肽的氨基酸序列為SGGGGSGGGGSGGS，SEQ ID NO :9。
[0011] 所述的抗VEGFR2胞外區(qū)的單鏈抗體，具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID N0:5的 氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗VEGFR2胞外區(qū)的單 鏈抗體，具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID N0 :8的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修 飾得到的氨基酸序列。
[0012] 所述的抗VEGFR2胞外區(qū)的單鏈抗體具有重鏈CDR2域，該域包含SEQ ID N0 :4的 氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗VEGFR2胞外區(qū)的單 鏈抗體具有輕鏈CDR2域，該域包含SEQ ID N0 :7的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修 飾得到的氨基酸序列。
[0013] 所述的抗VEGFR2胞外區(qū)的單鏈抗體具有重鏈CDR1域，該域包含SEQ ID N0 :3的 氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗VEGFR2胞外區(qū)的單 鏈抗體具有輕鏈CDR1域，該域包含SEQ ID N0 :6的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修 飾得到的氨基酸序列。
[0014] 一種分離的核酸，其特征在于該核酸編碼上述的抗體。
[0015] 一種表達(dá)載體，含有上述的核酸。
[0016] 一種重組宿主細(xì)胞,含上述的表達(dá)載體。
[0017] 上述任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的應(yīng)用，選擇性地與VEGFR2胞外區(qū)結(jié)合或抑制 VEGFR2胞外區(qū)與VEGFR2配體的結(jié)合或中和VEGFR2。
[0018] 上述任一項(xiàng)的抗體片段，選自單鏈抗體、Fab、單鏈Fv、雙抗體和三抗體。
[0019] 上述任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的偶聯(lián)物。
[0020] 所述的偶聯(lián)物，含有抗腫瘤藥物、靶組成部分或報(bào)告組成部分。
[0021] AK506-VH
【權(quán)利要求】
1. 一種全人源的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)胞外區(qū)的單鏈抗體，其特征在 于： 全人源的抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)胞外區(qū)的單鏈抗體包括重鏈可變區(qū) 和輕鏈可變區(qū)，并且重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過(guò)柔性肽連接，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列 為SEQ ID N0:1，輕鏈可變區(qū)為SEQ ID N0:2,柔性肽的氨基酸序列為SGGGGSGGGGSGGS。
2. -種分離的核酸，其特征在于，該核酸編碼權(quán)利要求1的一種全人源的抗VEGFR2胞 外區(qū)的單鏈抗體。
3. -種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求2所述的核酸。
4. 一種重組宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
【文檔編號(hào)】A61P37/02GK104059146SQ201310087619
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月19日
【發(fā)明者】王旻, 張娟, 李海鑫, 曹婉璐 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)