表皮生長因子受體激酶結(jié)構(gòu)域中的新型突變的制作方法
【專利說明】表皮生長因子受體激酶結(jié)構(gòu)域中的新型突變 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于癌癥療法的癌癥診斷和伴隨診斷。特別地，本發(fā)明涉及突變檢測， 所述突變可用于診斷和預(yù)后以及預(yù)測癌癥治療的有效性。
[0002] 發(fā)明背景 表皮生長因子受體（EGFR)也稱為HERl或ErbBl，是生長因子受體的1型酪氨酸激酶家 族的成員。這些膜結(jié)合蛋白質(zhì)具有細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，其與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑相互 作用。在配體結(jié)合后，在該家族中的受體經(jīng)歷酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的二聚化和后續(xù)自磷酸化。 自磷酸化觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括Ras/MAPK、PI3K和AKT途徑中的事件級聯(lián)。通過 這些途徑，HER家族蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和存活。
[0003] 許多人惡性腫瘤與EGFR的異常表達(dá)或功能相關(guān)（Mendelsohn等人，（2000) " Se EGF receptor family as targets /hr caflceT iAeTa/y% Oncogene，19:6550-6565. )〇 特 別地，已證實(shí)一些癌癥具有在EGFR激酶結(jié)構(gòu)域(外顯子18-21)中的突變。在非小細(xì)胞肺 癌（NSCLC)中，這些突變顯示促進(jìn)惡性細(xì)胞中的抗細(xì)胞凋亡途徑（Pao等人（2004) 〃你 F receptor gene mutations are common in lung cancers from ^never smokers^ and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib"HU. 101 等 XSiWA、" Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti~apoptotic pathways^,Science 305 (5687) 1163 - 1167.)。
[0004] 靶向EGFR的療法已得到開發(fā)。例如，西妥昔單抗（ERBITUX ?)和帕木單抗 (VECTIBIX?)是抗EGFR抗體。厄洛替尼（TARCEVAtm)和吉非替尼（IRESSA tm)是可用作EGFR 酪氨酸激酶的經(jīng)口活性選擇性抑制劑的喹唑啉。這些藥物在其癌癥由異常EGFR活性驅(qū)使 的患者中是最有效的。IRESSA?的隨機(jī)化的大規(guī)模雙盲研宄（IRESSA泛亞洲研宄（IPASS)) 比較在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)中作為第一線治療的吉非替尼與常規(guī)化學(xué)療法（Mok等人 (2009)aGefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. Eng JMed 361:947-957)。IPASS研宄了具有經(jīng)證實(shí)的腺癌組織學(xué)的1,217個(gè)患者。該研宄揭 示在具有EGFR突變陽性腫瘤的患者中，無進(jìn)展存活（PFS)對于IRESSA?顯著長于化學(xué)療法。 對于其中EGFR未突變的腫瘤則相反。PFS對于化學(xué)療法顯著長于IRESSA TM。該研宄證實(shí)為 了改善肺癌患者成功治療的機(jī)會(huì)，EGFR突變狀態(tài)必須是已知的。
[0005] 臨床結(jié)果的分析揭示具有在EGFR的激酶結(jié)構(gòu)域(外顯子18-21)中含有突變的腫 瘤的患者對于厄洛替尼具有的應(yīng)答優(yōu)于具有表達(dá)野生型EGFR的腫瘤的那些(美國專利號(hào) 7, 294, 468和7, 960, 118)。這些突變預(yù)測對酪氨酸激酶抑制劑（TKI)，例如喹唑啉厄洛替尼 (TARCEVAtm)和吉非替尼（IRESSA?)的應(yīng)答。在EGFR突變中，在外顯子19的區(qū)域中的核苷 酸包括核苷酸2235-2257 (對應(yīng)于氨基酸746-753)的框內(nèi)缺失和置換在肺癌患者中是尤 其常見的（參見美國專利號(hào)7,294,468 和1^11(311等人（2004)"4<^/^3〇'/71§'5?/(<3以〇/75·//? the epidermal growth factor underlying responsiveness of nonsmall cell lung cancer ?ο職" NEJM 350:2129.)。這些突變被認(rèn)為導(dǎo)致具有改變特性的活性激 酶，包括對抑制的敏感性增加(參見Paez等人（2004)/???皿i/? /?/?# caflcer/ correlation with clinical response to Gefitinib therapy, Science 304:1497)。 [0006] 在EGFR激酶結(jié)構(gòu)域中的一些突變是常見的，而其他突變更不頻繁地發(fā)生。然而， 靶向盡可能多的突變的EGFR突變臨床測試是必需的。這將確保具有罕見突變的患者未接 受"假陰性"測試結(jié)果。如果罕見突變未檢測到，則具有此類突變的患者將不會(huì)接受潛在的 挽救生命的治療。因此，當(dāng)發(fā)現(xiàn)EGFR激酶結(jié)構(gòu)域中的新突變時(shí)，檢測該突變具有影響一些 患者中的臨床結(jié)果的潛力。
[0007] 發(fā)明概述 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是經(jīng)分離的寡核苷酸，其與SEQ ID NO: 1中含有突變 2240_2264>CGAAAGA或2252_2277>GAGAAGCC的核酸特異性雜交。在該實(shí)施方案的變化中， 寡核苷酸包含與天然序列不匹配的至少一個(gè)核苷酸。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，寡核 苷酸與選自SEQ ID NO: 6-8和9-12的序列至少90%相同。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中， 寡核苷酸由選自SEQ ID NO: 6-8和9-12的序列組成。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，寡 核苷酸能夠引發(fā)在SEQ ID NO: 1中含有突變2240_2264>CGAAAGA的核酸而不是非突變型 SEQ ID NO: 1的選擇性擴(kuò)增。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，寡核苷酸能夠引發(fā)在SEQ ID N0:1中含有突變 2252_2277>GAGAAGCC的核酸而不是非突變型SEQIDN0:1的選擇性擴(kuò) 增。
[0008] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是治療具有腫瘤的患者的方法，所述腫瘤可能具 有在表皮生長因子受體（EGFR)基因中含突變的細(xì)胞，所述方法包括：就突變的EGFR基 因的存在測試患者的樣品，所述突變的EGFR基因的特征在于SEQ ID NO: 1中的突變 2240_2264>CGAAAGA或2252_2277>GAGAAGCC ;和如果存在突變之一，則給患者施用酪氨酸 激酶抑制劑化合物。在該實(shí)施方案的變化中，化合物是西妥昔單抗、帕木單抗、厄洛替尼或 吉非替尼。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，測試使用與選自SEQ ID NO: 6-8和9-12的序 列至少90%相同的寡核苷酸執(zhí)行。在該實(shí)施方案的另一個(gè)變化中，該方法進(jìn)一步包括就突 變的EGFR基因的存在測試患者的樣品，所述突變的EGFR基因的特征在于下述突變中的 一個(gè)或多個(gè)：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、 A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、 L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、 L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、 M766-A767 del Al ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、 L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、 2239_2240 TT>CC、2264 OA 和 E746-A750 del AP ins;并且在步驟（b)中，如果存在突變 中的任一個(gè)，則給患者施用酪氨酸激酶抑制劑化合物。
[0009] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是確定癌癥患者對酪氨酸激酶抑制劑療法的應(yīng) 答可能性的方法，其包括：就患者樣品中的EGFR基因中的突變2240_2264>CGAAAGA或 2252_2277>GAGAAGCC測試患者的樣品，并且如果存在突變，則確定患者可能響應(yīng)酪氨酸激 酶抑制劑療法。在該實(shí)施方案的變化中，酪氨酸激酶抑制劑療法包含西妥昔單抗、帕木單 抗、厄洛替尼或吉非替尼。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，測試使用與選自SEQ ID NO: 6-8 和9-12的序列至少90%相同的寡核苷酸執(zhí)行。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，該方法進(jìn)一 步包括就EGFR基因中下述突變中的一個(gè)或多個(gè)測試患者的樣品：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、 L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del Al ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、 2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 和 E746-A750 del AP ins ;并且在步驟（b)中，如果突變中的任一個(gè)報(bào)告為存在，則確定患者可能響應(yīng)酪氨酸激 酶抑制劑療法。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于檢測人EGFR基因中的突變 2240_2264>CGAAAGA 或 2252_2277>GAGAAGCC 的試劑盒，其包含與 SEQ ID NO: 1 中的突變 2240_2264>CGAAAGA 或 2252_2277>GAGAAGCC 而不是非突變的 SEQ ID NO: 1 特異性雜交 的一種或多種寡核苷酸。在該實(shí)施方案的變化中，試劑盒包含與選自SEQ ID NO: 6-8和 9-12的序列至少90%相同的寡核苷酸。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，試劑盒包含核酸前 體、核酸聚合酶以及支持核酸聚合酶活性必需的試劑和溶液。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化 中，試劑盒包含一種或多種寡核苷酸，其與SEQ ID NO: 1中的下述突變而不是非突變的SEQ ID NO: 1 特異性雜交：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、 A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、 L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、 M766-A767 del Al ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、 L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、 2239_2240 TT>CC、2264 OA 和 E746-A750 del AP ins。 toon] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療具有腫瘤的患者的方法，所述腫瘤可能 具有在表皮生長因子受體（EGFR)基因中含突變的細(xì)胞，所述方法包括：就突變的EGFR 基因的存在測試患者的樣品，所述突變的EGFR基因的特征在于SEQ ID NO: 1中的突變 2240_2264>CGAAAGA或2252_2277>GAGAAGCC ;和如果檢測到突變，則給患者施用酪氨酸激 酶抑制劑化合物。在該實(shí)施方案的變化中，化合物是西妥昔單抗、帕木單抗、厄洛替尼或吉 非替尼。在該實(shí)施方案的進(jìn)一步變化中，測試使用與選自SEQ ID NO: 6-8和9-12的序列 至少90%相同的寡核苷酸執(zhí)行。在該實(shí)施方案的另一個(gè)變化中，該方法進(jìn)一步包括就突變 的EGFR基因的存在測試患者的樣品，所述突變的EGFR基因的特征在于下述突變中的一個(gè) 或多個(gè) ：67