一種人表皮生長(zhǎng)因子受體的ctl表位多肽及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或該多肽具有在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上取代、缺失、置換、插入和/或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸的衍生序列。本發(fā)明還提供一種疫苗，包括人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽和佐劑，所述佐劑為gp96蛋白。通過佐劑和人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽的配合具有，具有提高免疫力，顯著提高治療腫瘤效果等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是目前國(guó)內(nèi)乃至世界發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大 的惡性腫瘤之一。男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第 二位，死亡率占第二位。大量臨床資料表明，長(zhǎng)期大量吸煙與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。由于吸 煙導(dǎo)致的被動(dòng)吸煙者肺癌患病率明顯增加。此外，研究發(fā)現(xiàn)近年來非吸煙群體的肺癌發(fā)病 率明顯上升。這可能與大氣污染的加重，特別是受可吸入顆粒大規(guī)模長(zhǎng)時(shí)期的影響相關(guān)。
[0003] 肺癌常用的治療方法包括手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療、靶向治療、免疫治療以 及不同治療方法的聯(lián)合治療。近年來，即使肺癌的治療方法不斷創(chuàng)新改進(jìn)，但治療效果仍不 能令人滿意，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移幾率還是較高。
[0004] 目前世界上傾向于將肺癌粗分為小細(xì)胞肺癌（SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，后 者包括除小細(xì)胞癌以外的其他上皮癌。小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)行為與其他上皮性癌(鱗癌、腺 癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌）顯著不同，臨床上表現(xiàn)為高度惡性，早期即發(fā)生廣泛的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對(duì) 化學(xué)治療和放射治療較敏感，因而治療原則也不同于其他上皮癌。目前臨床上常見的肺癌 病人約80 %為包括鱗癌、腺癌等在內(nèi)的非小細(xì)胞肺癌，這些病人確診時(shí)有85 %左右是中晚 期，約75%的晚期非小細(xì)胞肺癌病人失去了手術(shù)根治性治療機(jī)會(huì)、常規(guī)放化療的臨床效果 也不甚理想。
[0005] 分子靶向藥物治療是近年新興的一種治療手段，因其具有高度選擇性地殺死腫瘤 細(xì)胞而不殺傷或僅極少損傷正常細(xì)胞的特點(diǎn)，安全性和耐受性較好、毒付作用相對(duì)較小，許 多病人都視其為治療肺癌的一線生機(jī)。分子靶向是指在細(xì)胞分子水平上，針對(duì)已經(jīng)明確的 致癌位點(diǎn)，來設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，藥物進(jìn)入體內(nèi)會(huì)特異地選擇致癌位點(diǎn)來相結(jié)合發(fā)生作 用，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡，而不會(huì)波及腫瘤周圍的正常組織細(xì)胞。在非小細(xì)胞肺癌中，很 多病人都存在著表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)高表達(dá)，并且腫瘤的生長(zhǎng)依賴著EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通 路。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者中人體表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變頻率高，突變后的EGFR 對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑敏感性增加。因此靶向治療對(duì)EGFR基因突變的患者 效果明顯，通過阻斷致癌信號(hào)的傳輸達(dá)到控制癌癥的效果。目前肺癌靶向治療的常用表皮 生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)包括易瑞沙、特羅凱、凱美納等。研究表明，在 我國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者中，有特定的人群，包括女性、腺癌、不吸煙的患者，對(duì)易瑞沙和特羅 凱治療的有效率高。受體酪氨酸激酶抑制劑藥物的問題是價(jià)格較貴，在我國(guó)屬于自費(fèi)藥物， 沒有納入醫(yī)保報(bào)銷范圍，對(duì)有效的病人造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外，長(zhǎng)時(shí)間使用靶向藥物極 易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致藥物的藥效降低。再次，靶向藥物對(duì)患者具有一定的毒副作用，包括后 期皮疹，皮膚發(fā)干，發(fā)黑等癥狀。因此，迫切需要開發(fā)新的治療性疫苗以補(bǔ)充或替代現(xiàn)有的 抗腫瘤治療方案。
[0006] 研究顯示，腫瘤特異性殺傷性T淋巴細(xì)胞(Cytolytic T lymph〇Cyte，CTL)在清除 腫瘤中起著至關(guān)重要的作用。大部分腫瘤患者T細(xì)胞反應(yīng)低下，如何激活CTL免疫反應(yīng)成為 焦點(diǎn)。而CTL表位在CTL活化過程中扮演著關(guān)鍵角色，是誘導(dǎo)特異性CTL克隆性增殖、分化和 發(fā)揮效應(yīng)的最重要的激發(fā)因素，在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要的作用。
[0007] 熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP)是一類在生物進(jìn)化中高度保守且廣泛存 在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)，加熱、缺氧、病毒感染、重金屬中毒、氧化劑等刺激因素都 可誘導(dǎo)其表達(dá)增加。HSP根據(jù)同源程度及分子量大小可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、 HSP40、小分子HSP及泛素等多個(gè)亞家族。人類熱休克蛋白90家族(HSP90)包括HSP90a，HSP90 0，gp96(grp94)和Trap-1四個(gè)成員。gp96(GRP94)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)HSP90家族的代表，與細(xì)胞質(zhì) HSP90高度同源，主要生物學(xué)功能有:分子伴侶，參與新合成蛋白的折疊與組裝;與細(xì)胞內(nèi)的 其他肽類蛋白質(zhì)尤其是變性蛋白的結(jié)合，參與細(xì)胞的抗損傷、修復(fù)和熱耐受過程;參與蛋白 質(zhì)水解過程;結(jié)合抗原肽，加工提呈腫瘤抗原及維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等作用；對(duì)細(xì)胞的生 長(zhǎng)、發(fā)育、分化及死亡具有一定的調(diào)節(jié)作用。gp96是一種遺傳單態(tài)性分子，其氨基酸(aa)序 列高度保守：小鼠和倉(cāng)鼠的gp96氨基酸序列有95%以上的同源性，豬源、人源與禽源的gp96 氨基酸序列分別有97%和89%以上的同源性。gp96由于具有顯著的生物學(xué)活性，特別是在 免疫學(xué)方面同時(shí)具有刺激特異性殺傷T細(xì)胞的作用和抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用。gp96能結(jié)合 細(xì)胞中5-25mer的抗原多肽，通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面CD91分子進(jìn)入細(xì)胞并將結(jié)合的抗 原表位呈遞給MHC I類和II類分子從而啟動(dòng)特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)。此外，gp96能有效激發(fā)天 然免疫。gp96是來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的天然佐劑，可作用于APC及T細(xì)胞等其它免疫細(xì)胞，促 進(jìn)DC成熟，刺激細(xì)胞產(chǎn)生免疫因子IL-6、IL-12、TNF等，從而增強(qiáng)機(jī)體天然免疫反應(yīng)。 Srivastava等人首先發(fā)現(xiàn)了 gp96在腫瘤免疫應(yīng)答中的重要作用。從腫瘤中獲得的gp96_抗 原肽復(fù)合物能夠有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答。同時(shí)，由于胎盤中含有大量的癌胚 抗原，將胎盤中的gp96純化分離后免疫C57BL/6小鼠，也能取得良好的預(yù)防和治療效果。
[0008] 由于組織來源有限，從組織提取的熱休克蛋白gp96蛋白產(chǎn)量有限，難以工業(yè)化應(yīng) 用，而且組織提取的gp96蛋白結(jié)合組織細(xì)胞內(nèi)的抗原多肽，影響其與外源多肽的結(jié)合，從而 影響疫苗的療效。此外，受倫理道德因素的制約，從組織提取的gp96難以直接作為藥物推 廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽以及昆蟲細(xì)胞分泌表 達(dá)的gp96及其聯(lián)合應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[0011] 一種人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽，該多肽具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸 序列;或
[0012] 該多肽具有在SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上取代、缺失、置換、插入和/或 添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸的衍生序列。
[0013] 所述衍生序列仍與人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位相關(guān)。
[0014]所述衍生序列與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的功能相近或一致，所述功能主 要指結(jié)合HLA-A2分子的能力、刺激特異性T細(xì)胞產(chǎn)生、抗腫瘤生長(zhǎng)的能力等。
[0015] 本發(fā)明所述的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽具有水溶性好，便于臨床應(yīng)用 等優(yōu)點(diǎn)。
[0016] 經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明所述的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽的溶解度(溶劑可 以為任何水溶液，純水，生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等等)可以達(dá)到至少20mg/mL，且不需要用 有機(jī)溶劑溶解。
[0017] 以多肽做為臨床藥物時(shí)，為保證具有足夠的效果，需要具備一定的溶解性。但現(xiàn)有 的多肽具有水溶性不好等缺陷，在使用時(shí)只能將多肽溶于極性溶劑(例如：油類化合物、乙 醇等）。在臨床藥物進(jìn)行主管部門審批時(shí)，受極性溶劑的影響，審查周期延長(zhǎng)或者不能夠?qū)?批通過，影響多肽類藥物的進(jìn)一步應(yīng)用。為了避免上述缺陷，一般采用多肽修飾的方法來 改善多肽的水溶性，但是存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、效果不理想等問題。
[0018] 本發(fā)明提供的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽具有很好的水溶性，應(yīng)用前景 好。
[0019] 本發(fā)明所述的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位與HLA分子還具有很強(qiáng)的結(jié)合能力， 經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)具有很強(qiáng)大的免疫學(xué)功能。
[0020] 對(duì)于衍生序列，如果在SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上加或減一個(gè)氨基 酸，得到的序列仍然不影響原多肽序列的功能，那么該衍生序列也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0021] 除該多肽第二位和最后一位不能改變，其余氨基酸可以被其他同性質(zhì)（例如親水 氨基酸被親水氨基酸取代，疏水氨基酸被疏水氨基酸取代)的氨基酸取代。
[0022]在SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，出于某種目的的需要（例如：為了便 于純化、表達(dá)、標(biāo)記等操作)常常會(huì)添加一些標(biāo)簽序列或限制性酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基等。 所述標(biāo)簽序列、限制性酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基等均可以根據(jù)具體的使用情況進(jìn)行具體選 擇，并無特殊限制。
[0023]優(yōu)選地，所述人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序 列。
[0024] 本發(fā)明還提供一種人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽的編碼基因，通過上述編 碼基因來編碼上述的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽。
[0025] 本發(fā)明還提供一種重組載體，所述重組載體克隆、分泌和/或表達(dá)上述的人表皮生 長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽。
[0026] 所述重組載體可以根據(jù)實(shí)際的實(shí)際的需要選擇，與蛋白表達(dá)或復(fù)制的調(diào)控元件， 例如：?jiǎn)?dòng)子、終止子、多克隆位點(diǎn)、RBS序列、抗性基因以及其他具有生理性功能的基因等 等。
[0027] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)化體，包括上述的重組載體。所述重組載體可以獨(dú)立復(fù)制也 可以整合到細(xì)菌的染色體DNA中，隨染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制。
[0028] 本發(fā)明中，所述的轉(zhuǎn)化子為含有上述的重組載體的細(xì)胞。
[0029] 通過上述的重組載體以及轉(zhuǎn)化體，可以在體外實(shí)現(xiàn)表達(dá)多肽。
[0030] 本發(fā)明所述的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽在腫瘤治療中的應(yīng)用。優(yōu)選地， 應(yīng)用于肺癌的治療中。
[0031] 本發(fā)明還一種疫苗，包括上述的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽和佐劑。
[0032] 本發(fā)明所述的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽可以作為疫苗的活性組分，用 于肺癌的治療，具有水溶性好優(yōu)點(diǎn)。
[0033]進(jìn)一步，所述佐劑包括gp96蛋白。
[0034]采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是:通過gp96蛋白與人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL 表位多肽的聯(lián)合使用，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果好等優(yōu)點(diǎn)。
[0035] 進(jìn)一步，所述gp96蛋白為采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)分泌型的gp96蛋白。
[0036] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是：
[0037] 發(fā)明人在研究過程中，進(jìn)行對(duì)于表達(dá)系統(tǒng)的選擇進(jìn)行了篩選，例如:大腸表達(dá)系統(tǒng) 和酵母表達(dá)系統(tǒng)等。最終意外的發(fā)現(xiàn)了采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)分泌型的gp96蛋白最合 適，gp96蛋白產(chǎn)量高并且作為佐劑制備疫苗時(shí)效果好。
[0038]發(fā)明采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)分泌型的gp96蛋白，表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定，gp96蛋白的 表達(dá)量高，蛋白糖基化更接近于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，蛋白穩(wěn)定，且從細(xì)胞上清中提取，純化簡(jiǎn)單。 昆蟲細(xì)胞分泌表達(dá)的熱休克蛋白gp96不結(jié)合抗原多肽，因此可以更好地與外源多肽結(jié)合， 從而增強(qiáng)了其免疫學(xué)功能。
[0039] 進(jìn)一步，所述gp96蛋白通過昆蟲桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞分泌表達(dá)。
[0040] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是:采用昆蟲桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞分泌表達(dá) 具有效率尚、易提純、活性好且安全性尚等優(yōu)點(diǎn)。
[0041] 進(jìn)一步，所述gp96蛋白和人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽的質(zhì)量比為1: (0.5- 10)，優(yōu)選地，所述gp96蛋白和人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽的質(zhì)量比為1:2.5。
[0042] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是:質(zhì)量比設(shè)置為1: (0.5-10)有利于刺激特異性 CTL產(chǎn)生，產(chǎn)生更好的抑制腫瘤的效果，如果比例過高，容易導(dǎo)致抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生 免疫耐受問題，如果比例過低容易導(dǎo)致沒有效果問題;發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)比例設(shè)置為 1:2.5時(shí)，刺激特異性CTL產(chǎn)生的效果更好。
[0043] 進(jìn)一步，所述gp96蛋白包括SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列；和/或 [0044] 所述gp96蛋白的編碼基因包括SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列。
[0045] 本發(fā)明提供一種gp96蛋白的制備方法，包括以下步驟：利用昆蟲細(xì)胞分泌表達(dá) gp96蛋白，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清依次進(jìn)行HiTrap Q HP陰離子交換柱和Superdex 200 10/ 300GL分子篩層析得到的。
[0046] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是：純化簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，可以精確控制條件，并 可用于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，在保證蛋白純度的前提下，既節(jié)約了時(shí)間，又減少了蛋白的丟失。 [0047]進(jìn)一步，包括以下具體步驟：
[0048] 1)利用昆蟲桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞分泌表達(dá)gp96蛋白：構(gòu)建含有g(shù)p96蛋白的表 達(dá)載體和轉(zhuǎn)化子;所述轉(zhuǎn)化子為轉(zhuǎn)染有g(shù)p96蛋白的表達(dá)載體的細(xì)胞；
[0049] 2)將桿狀病毒侵染轉(zhuǎn)化子后，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27 °C，培養(yǎng)時(shí)的轉(zhuǎn)速為 100-120rpm/min，培養(yǎng)結(jié)束后，收集上清液；
[0050] 3)將上清液進(jìn)行HiTrap-Q Sepharose離子交換層析，具體包括如下步驟：
[0051] (a)將步驟2)得到的上清液上樣于層析柱，流速為lmL/min;
[0052] (b)用5mL PBS緩沖液洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lmL/min，所述PBS緩沖液含有 20〇111]\1恥(：1，？85緩沖液的口11為7.5;
[0053] (c)用10mL的PBS緩沖液洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lmL/min;所述roS緩沖液含 有30〇111]\1他(：1，？85緩沖液的口11為7.5;
[0054] (d)用3mL的PBS緩沖液洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lmL/min，得到的洗脫液即為 含有g(shù)p96蛋白的提取物;所述PBS緩沖液含有600mM NaCl，PBS緩沖液的pH為7.5;
[0055] 4)將洗脫液進(jìn)行Superdex 200 10/300GL分子篩層析，具體包括如下步驟：
[0056] (a)將HiTrap-Q Sepharose離子交換層析所得gp96蛋白提取物通過50Kd超濾管濃 縮，用pH為7.5的PBS換液，濃縮終體積為lmL的濃縮液，所述濃縮液含有g(shù)p96蛋白；
[0057] (b)通過上樣環(huán)將步驟(a)的濃縮液上樣于層析柱，流速為0.25mL/min;
[0058] (c)用PBS緩沖液洗滌層析柱，流速為0 ? 25mL/min，收取gp96蛋白；將收集的gp96蛋 白用pH為7.5的PBS緩沖液換液，濃縮，測(cè)定gp96蛋白濃度后分裝、貝士存。
[0059] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是：
[0060] 步驟3)的步驟(b)中200mM NaCl可以將部分雜蛋白洗脫，提高gp96蛋白的純度；
[0061 ] 步驟3)的步驟(C)中300mM NaCl既可以將雜蛋白洗脫，又能保證gp96仍然結(jié)合在 尚子柱上，有利于提尚g(shù)p96蛋白的純度和廣量；
[0062] 步驟3)的步驟(d)中600mM NaCl既可以將gp96蛋白完全洗脫，又能避免過高的鹽 濃度混入雜蛋白，有利于提尚g(shù)p96蛋白的純度和廣量；
[0063]步驟4)中分子層析柱的使用可以提高gp96蛋白的純度。
【附圖說明】
[0064]圖1為多肽與T2細(xì)胞表面的HLA-A2分子結(jié)合能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0065]圖2為多肽與HLA-A2分子以及分子構(gòu)成復(fù)合物的體外重折疊 (refolding)的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果。
[0066]圖3為多肽免疫HLA_2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠，其脾細(xì)胞中多肽特異性CTL免疫反應(yīng)的 ELISP0T檢測(cè)結(jié)果。
[0067]圖4裸鼠接種肺癌患者原位腫瘤組織，轉(zhuǎn)輸經(jīng)多肽免疫的HLA_2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠 的脾臟淋巴細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，其腫瘤的生長(zhǎng)情況。肺癌患者血液細(xì)胞HLA限制性經(jīng)流 式細(xì)胞儀檢測(cè)為HLA-2陽(yáng)性。
【具體實(shí)施方式】
[0068] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0069] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試 驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)， 均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。ATCC即美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection)的簡(jiǎn)寫，網(wǎng)址http: //www.atcc.org/〇
[0070] PBS緩沖液：8g NaCl、0.2g KCl、3.625g Na2HP〇4 ? 12H20、0.24g KH2P04,加水至 1L，調(diào)pH7.4。
[0071] 通過在NCBI(National Center for Biotechnology Information)的Protein數(shù) 據(jù)庫(kù)中搜索人表皮生長(zhǎng)因子受體蛋白的氨基酸序列(Accession: NP_005219.2)，如序列表 的SEQ ID NO. 1所示，以此作為合成多肽的序列來源。
[0072]實(shí)施例1、制備EGFR衍生的九肽，該多肽序列在EGFR的前體和成熟體中都存在。 [0073] 該衍生九肽為66?1?599-607多肽片段，其氨基酸序列如5￡〇10勵(lì).2所示，由氮末 端至碳末端方向的氨基酸序列為:Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val。
[0074] EGFR599-607多肽片段由吉爾生化(上海)有限公司合成。
[0075]對(duì)照多肽：乙肝病毒HBC82-90肽來源于乙肝病毒核心蛋白，非腫瘤抗原，其氨基酸 序列如SEQ ID N0.3所示。
[0076] 實(shí)施例2、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證EGFR599-607多肽片段與HLA-A2分子的結(jié)合力
[0077] 分別通過T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)和體外重折疊實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)EGFR599-607多肽片段與HLA- A2分子的結(jié)合力。
[0078] -、T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多肽與細(xì)胞表面的HLA-A2分子的結(jié)合能力
[0079] T2細(xì)胞表面表達(dá)HLA-A0201分子(HLA-A0 201分子也可以寫成HLA-A*0201分子，是 HLA-A2分子的一個(gè)分支），且其TAP基因缺陷，所以該細(xì)胞不能加工呈遞內(nèi)源性的多肽，故 其細(xì)胞表面的HLA-A0201分子處于不穩(wěn)定且低表達(dá)的狀態(tài)。當(dāng)有HLA-A0201分子可結(jié)合的外 源性抗原多肽存在時(shí)，這些多肽與T2細(xì)胞表面的HLA-A2分子結(jié)合，會(huì)大大增加其細(xì)胞表面 的HLA-A0201穩(wěn)定性，很大程度上提高細(xì)胞表達(dá)HLA-A2的強(qiáng)度，通過熒光標(biāo)記的MHC抗體標(biāo) 記和流式檢測(cè)即可鑒定，采用FI (fluorescence index，F(xiàn)I)值來說明多肽的結(jié)合力強(qiáng)弱。FI =(待測(cè)多肽的平均熒光強(qiáng)度-不加多肽的平均熒光強(qiáng)度)/不加多肽的平均熒光強(qiáng)度，若FI 2 1，則被認(rèn)為是與HLA-A2分子結(jié)合力高的多肽。具體操作步驟如下：
[0080] 取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞(來自ATCC.〖CRL-1992tm)，用無血清的培養(yǎng)基洗兩次，再用少量 無血清培養(yǎng)基懸起，細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種到96孔板中，每個(gè)孔中接種2 X 105個(gè)細(xì)胞，加入終濃度 為100yg/mL待測(cè)多肽，lyg/mL人fen蛋白（購(gòu)自sigma)，每個(gè)孔的體系為100iiL，37°C條件下 培養(yǎng)16小時(shí)。
[00811收集96孔板中的細(xì)胞，用PBS緩沖液洗2次，用偶聯(lián)FITC的抗人一 HLA-A2特異性抗 體BB7.2(abcam公司，貨號(hào)ab27728)標(biāo)記細(xì)胞，4°C條件下反應(yīng)30min。收集標(biāo)記后的細(xì)胞，用 PBS緩沖液洗兩次，用流式細(xì)胞儀測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。用FI值來評(píng)判待測(cè)多肽的結(jié)合力強(qiáng) 弱。
[0082] 上述中，實(shí)驗(yàn)組加入的多肽為EGFR599-607多肽片段;對(duì)照組加入的多肽為乙肝病 毒 HBc82-90肽。
[0083] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組EGFR599-607多肽片段的熒光強(qiáng)度明顯比對(duì)照組（乙 肝病毒mc82-90肽）的熒光強(qiáng)度要強(qiáng)。EGFR599-607與對(duì)照組的FI值分別為43.5、9.03，說明 與對(duì)照組相比，EGFR599-607多肽片段與HLA-A2分子有很好的結(jié)合力。而能結(jié)合HLA分子是 多肽具有免疫學(xué)功能的前提，本發(fā)明所述EGFR599-607多肽片段與HLA-A2分子的結(jié)合能力 更強(qiáng)，可能具有強(qiáng)大的免疫學(xué)功能。
[0084]二、體外重折疊(refolding)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多肽與HLA-A0201分子的結(jié)合能力 [0085] 在refolding實(shí)驗(yàn)中，如果多肽能與HLA-A0201分子結(jié)合，那么多肽、HLA-A0201以 及說微球蛋白（fem)就能形成穩(wěn)定的多肽-HLA-fcm三元復(fù)合物，在分子篩層析圖譜中出現(xiàn)多 肽-HLA-fem復(fù)合物蛋白峰。HLA-A2分子由重鏈和輕鏈組成，重鏈的編碼序列如SEQ ID N0.4 所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5顯示。輕鏈的編碼序列如SEQ ID NO.6顯示，其氨基酸序 列如SEQ ID N0.7所示。
[0086] 1、構(gòu)建HLA-A0201重鏈胞外區(qū)質(zhì)粒
[0087] 將編碼HLA-A0201 重鏈胞外區(qū)的DNA(GENBANK ACCESSION N0.AY365426 自 5'末端 第73-897位核苷酸）導(dǎo)入pET-28a質(zhì)粒(Novagen，69864-3CN)，得到重鏈重組質(zhì)粒，命名為 HLA-A0201-HC 質(zhì)粒。
[0088] 2、構(gòu)建人fen表達(dá)質(zhì)粒
[0089] 將編碼人fen的DNA(GENBANK ACCESSION N0.NM_004048 自 5'末端第 121-417位核 苷酸)導(dǎo)入pET-28a質(zhì)粒，得到輕鏈重組質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒。
[0090] 3、原核提取HLA重鏈和輕鏈蛋白
[0091] 包涵體清洗液（washing buffer):0 ? 5% (體積分?jǐn)?shù)）Triton-100，50mM Tris pH 8.0,300mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT;
[0092] 包涵體重懸液（resuspension buffer): 50mM Tris pH 8 ? 0，lOOmM NaCl，lOmM EDTA,l〇mM DTT；
[0093] 包涵體溶解液（dissolution Buffer): 6M Gua-HCl (或8M尿素），10 % (體積分?jǐn)?shù)） 甘油，50mM Tris pH8.0,100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT;
[0094] 復(fù)性液（refolding buffer): lOOmM Tris pH 8.0,400mM L_Arg HC1，2mM EDTA， 5mM GSH(還原性谷胱甘肽，溶液預(yù)冷后加入），0.5mM GSSG(氧化性谷胱甘肽，溶液預(yù)冷后加 入），0.5mM PMSF〇
[0095] LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，加水定容至1L。
[0096] (1)將HLA-A0201-HC質(zhì)粒與fen質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中（購(gòu)自天根 生化科技公司，產(chǎn)品號(hào)CB105-02)，從平板上挑取單克隆菌落接種到5mL的LB培養(yǎng)基中，該培 養(yǎng)基中含有l(wèi)〇〇mg/mL氨節(jié)霉素，小量活化，培養(yǎng)10-12h。然后按照1 % (體積比）的接種量接 種到2L LB培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)(溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200rpm)，培養(yǎng)至0D = 0.4-0.6,在無菌條 件下加入IPTG(終濃度為lmM)，37°C誘導(dǎo)4-6小時(shí)，4°C條件下，7000rpm離心10min，收集菌 體。
[0097] (2)用PBS緩沖液將菌體重懸，在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎（超聲6s，間隔12s，99 次，250W，多個(gè)循環(huán)），直至菌體懸液透明。收集超聲后的菌液，4°C條件下12000rpm離心 20min。沉淀中呈白色致密塊即為包涵體。
[0098] (3)用玻璃棒將包涵體上的菌體殘?jiān)稳ィ脀ashing buffer將包涵體懸起，用超 聲裂解方法進(jìn)一步純化蛋白（超聲4s，間隙10s，40次，250w)，離心，收集沉淀（4°C條件， 12000rpm離心20min)。此步驟重復(fù)三次。再用resuspension buffer將包涵體沉淀懸起，并 超聲裂解一次，離心收集包涵體(4°C條件，12000rpm離心20min)。注:每次超聲裂解離心過 后，都需要用玻璃棒將表面的菌體殘?jiān)M量刮去。
[0099] (4)離心收集的包涵體，將上清除去，倒置控干，稱重，按30mg的包涵體加入lmL dissolution buffer的比例加入dissolution buffer溶解，4°C條件攪拌溶解過夜。離心收 集上清(4°C條件，12000rpm離心20min)，將上清分裝后-20°C凍存。
[0100] 通過上述方法，分別獲得了 ft?包涵體蛋白和重鏈包涵體蛋白。
[0101] 4、包涵體體外復(fù)性
[0102] (1)配制refolding buffer，將裝有refolding buffer的燒杯放置在磁力攪拌器 上，轉(zhuǎn)子的攪拌速度為1 s轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)一圈較好。用lmL注射器的針頭替換5mL或1 OmL注射器的針 頭，將替換組合后的注射器固定在燒杯上，在注射器中加入溶解好的包涵體，使其能一滴一 滴地慢速滴入refolding buffer中。按最先輕鏈包涵體蛋白，其次多肽，再次重鏈包涵 體蛋白的順序加入，以重鏈包涵體蛋白：輕鏈fern包涵體蛋白：多肽=1:1:3的摩爾比加入。 重鏈包涵體蛋白最好分三次加入，每次加入的時(shí)間間隔8-10h，多肽溶解在100-200微升二 甲亞砜中一次性注入。
[0103] 實(shí)驗(yàn)組加入的多肽為EGFR599-607多肽片段；對(duì)照組加入的多肽為乙肝病毒 HBc82-90肽。
[0104] (2)將復(fù)性結(jié)束后的復(fù)性液用濃縮杯進(jìn)行濃縮(在加入濃縮杯之前最好12000rpm， 4°C離心20min，盡量去除沉淀以減小沉淀堵住濃縮膜的可能性），并換液到分子篩緩沖液 (含有20mM Tris，50mM NaCl，pH8.0)，當(dāng)溶液體積最終小于50mL之后換到濃縮管繼續(xù)濃縮 至5mL以內(nèi)，12000rpm，4°C條件離心10min后取上清準(zhǔn)備上樣。將準(zhǔn)備好的復(fù)性濃縮液注入 AKTA FPLC，根據(jù)Hi load 16/60superdex 200(GE公司，貨號(hào)為 17-1139-01)分子篩層析的 結(jié)果檢測(cè)復(fù)性效果。分子篩層析過程中，收集各個(gè)蛋白峰的樣品，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳鑒定。
[0105] 復(fù)性結(jié)果由圖2所示，EGFR599-607多肽片段在目標(biāo)位置10-15mL處出現(xiàn)了明顯的 復(fù)合物蛋白峰，而對(duì)照組的多肽則沒有蛋白復(fù)合物峰，說明EGFR599-607多肽片段與HLA-A0201分子具有多肽結(jié)合力。
[0106]通過T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)和體外重折疊實(shí)驗(yàn)，可以看出本發(fā)明所述的EGFR599-607多 肽片段與HLA-A2分子具有很好的多肽結(jié)合力。
[0107]實(shí)施例3、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)熱休克蛋白gp96
[0108] p F a s t B a c TM 1空載質(zhì)粒購(gòu)自普如汀生物技術(shù)（北京）有限公司，產(chǎn)品號(hào) BioVectorl058 19-1〇
[0109] DH10Bac?E.coli(簡(jiǎn)寫為DHlOBac)購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品號(hào) CL108-01。
[0110] 出1'瓜口-0 56口1^1〇86:層析柱為出1'瓜口0冊(cè)，購(gòu)自6￡公司，產(chǎn)品號(hào)17-1153-01，層 析柱的內(nèi)徑和柱長(zhǎng)是0 ? 7 X 2 ? 5cm。
[0111] Superdex 200 10/300GL:層析柱為Superdex 200 10/300GL，購(gòu)自GE公司，產(chǎn)品號(hào) 17-5175-01，層析柱的內(nèi)徑和柱長(zhǎng)是1 ? 0 X 3 ? 0cm。
[0112] 一、構(gòu)建 pFastBac?l_gp96 質(zhì)粒
[0113] l、gp96引物的設(shè)計(jì)與合成：以GenBank中人gp96基因的序列為模板，序列號(hào)為NM_ 003299,其基因序列如SEQ ID NO.8所示，其編碼氨基酸序列如序列SEQ ID NO.9所示。在 gp96基因5 '端加入EcoR頂每切位點(diǎn)，3 '端加入Xbal酶切位點(diǎn)。用于PCR擴(kuò)增的正向引物序列 GCTCTAGACTATTACAATTCATCTTTTTC-3'，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成該引物， 測(cè)序驗(yàn)證引物的序列正確無誤。
[0114] 2、提取人肺癌細(xì)胞 A549 (ATGC?Number: CCL-185?)的總 mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。
[0115] 3、以步驟1的cDNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的基因。
[0116] 4、用EcoRI和Xbal雙酶切g(shù)p96的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0117] 5、用EcoRI和Xbal雙酶切pFastBac?l空載質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物。
[0118] 6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。
[0119] 7、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限 公司，產(chǎn)品號(hào)CL108-01)，通過挑取單克隆獲得重組大腸桿菌的質(zhì)粒。用PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆， 用于PCR驗(yàn)證的pUC/M13正向引物序列為:5'-CCCAGTCACGACGITGTAAAACG-3'，反向引物序列 為:5 ' -AGCGGATAACAATITCACACAGG-3 ' 1CR產(chǎn)生了 一個(gè)含有目的序列的4.7-5kb擴(kuò)增子隨后 對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證正確的為陽(yáng)性重組質(zhì)粒。該陽(yáng)性重組質(zhì)粒是能表達(dá)桿狀病毒 的質(zhì)粒，在由DHlOBac自身含有的的輔助質(zhì)粒的幫助下發(fā)生重組，重組后的質(zhì)?？梢酝瑫r(shí)表 達(dá)桿狀病毒和目的蛋白，通過觀察病毒侵染情況可以部分反應(yīng)目的蛋白的表達(dá)情況。
[0120] 二、利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)gp96重組蛋白
[0121] 提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒，利用Cellfectin II reagent(Life technologies,貨號(hào)： 10362-100)將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞(購(gòu)自普如汀生物技術(shù)(北京)有限公司，產(chǎn)品號(hào) NTCC411123)中。將轉(zhuǎn)染陽(yáng)性質(zhì)粒的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)72h，通過細(xì)胞病變情況表明含有重組的一 代桿狀病毒(命名為P1毒)已經(jīng)釋放到培養(yǎng)基中，收取細(xì)胞上清獲得P1毒。加適量P1毒到Sf9 單層細(xì)胞中，控制細(xì)胞濃度達(dá)到1X10 6細(xì)胞/mL，加入的P1量（mL)=M0I(pfu/Cell) X number of cells/titer of viral stock(pfu/mL)，其中M0I (multiplicity of infection)取0.05-0. l，titer of PI viral stock取lxl06-lxl07pfu/mL，之后在27°C條件 下培養(yǎng)72h，4000rpm離心5min，收取上清獲得二代毒(命名為P2毒）。將適量P2毒加到lOOmL Sf9的懸浮細(xì)胞中，控制細(xì)胞濃度達(dá)到1.6 X 106細(xì)胞/mL，在27°C條件下100_120rpm培養(yǎng) 72h，擴(kuò)增獲得三代毒(命名為P3毒）。將P3毒進(jìn)行westernblotting雜交，結(jié)果表明gp96蛋白 已經(jīng)在Sf 9細(xì)胞中表達(dá)。
[0122] 隨后，在新鮮的Sf 9細(xì)胞（1 ? 5 X 106細(xì)胞/mL，300mL)中加入適量P3毒，27 °C條件下 100_120rpm在Insect-XPRESS?Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine培 養(yǎng)基(Catalog N〇:12-730Q)中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。感染72小時(shí)后，將懸浮液在7000rpm轉(zhuǎn)速條件 下離心20分鐘得到清澈的上清液，經(jīng)過0.22mm濾膜濾過后，再經(jīng)過HiTrap Q HP柱， Superdex 200 10/300GL離子柱純化后得到較純的gp96蛋白。gp96蛋白經(jīng)變性聚丙稀酰胺 凝膠電泳鑒定。將上述收集的穿透用PBS緩沖液換液，濃縮，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，最后 將蛋白分裝，貯存于-80 °C。
[0123] 上述中，HiTrap Q HP柱，Superdex 200 10/300GL離子柱純化的具體方法為：
[0124] 1)將感染后收集的上清液進(jìn)行HiTrap-Q Sepharose離子交換層析，具體包括如下 步驟：
[0125] (a)將上述步驟得到的上清液過濾后上樣于層析柱，流速為lmL/min;
[0126] (b)用5mL PBS緩沖液洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lmL/min，所述PBS緩沖液含有 20〇111]\1恥(：1，？85緩沖液的口11為7.5 ;
[0127] (c)用10mL的PBS緩沖液洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lmL/min;所述roS緩沖液含 有30〇111]\1他(：1，？85緩沖液的口11為7.5 ;
[0128] (d)用3mL的PBS緩沖液洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lmL/min，得到的洗脫液即為 含有g(shù)p96蛋白的提取物;所述PBS緩沖液含有600mM NaCl，PBS緩沖液的pH為7.5;
[0129] 2)將洗脫液進(jìn)行Superdex 200 10/300GL分子篩層析，具體包括如下步驟：
[0130] (a)將HiTrap-Q Sepharose離子交換層析所得gp96蛋白提取物通過50Kd超濾管濃 縮，用pH為7.5的PBS換液，濃縮為終體積為lmL的濃縮液，所述濃縮液中含有g(shù)p96蛋白；
[0131 ] (b)通過上樣環(huán)將步驟(a)的濃縮液(含gp96的lmL PBS溶液)上樣于層析柱，流速 為0.25mL/min;
[0132] (c)用PBS緩沖液洗滌層析柱，流速為0.25mL/min，收取gp96蛋白；將（c)收集的 gp96蛋白用pH為7 ? 5的PBS緩沖液換液，濃縮，測(cè)定gp96蛋白濃度后分裝、貯存。
[0133] 實(shí)施例4、多肽刺激HLA-2.1/Kb轉(zhuǎn)基因鼠特異性CTL的產(chǎn)生
[0134] 利用實(shí)施例3中制備得到的昆蟲細(xì)胞表達(dá)的gp96蛋白進(jìn)行動(dòng)物免疫。
[0135] 實(shí)施例中用于動(dòng)物免疫的多肽購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司，純度為95%以上。
[0136] 實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物免疫多肽為66?1?599-607多肽片段，其氨基酸序列如3￡〇10勵(lì).2所 示;對(duì)照組的動(dòng)物免疫多肽為乙肝病毒HBc82-90肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0137] 一、分組免疫
[0138] HLA-A2 ? 1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠（購(gòu)自Jackson laboratory)進(jìn)行分組，每組10只，分別免 疫。
[0139] 第一次免疫多肽EGFR599-607多肽片段(50微克/只）、gp96蛋白（20微克/只）；第二 次免疫多肽EGFR599-607多肽片段（50微克/只）、gp96蛋白（20微克/只）；第三次免疫多肽 EGFR599-607多肽片段(50微克/只）、gp96蛋白（20微克/只）。對(duì)照組免疫相同劑量的gp96和 乙肝病毒ffi5c82 -90多妝。
[0140]進(jìn)行蛋白免疫前，將用于免疫的gp96蛋白在組裝體系中進(jìn)行組裝。組裝體系的溶 劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，KH2P〇4〇.24g/L，Na2HP〇4. 12H20 3.63g/L;組裝條件為55°C反應(yīng)lOmin，之后室溫放置30分鐘。免疫方式為皮下注射，第一次 免疫時(shí)間為實(shí)驗(yàn)第一周、第二次免疫時(shí)間為實(shí)驗(yàn)第三周、第三次免疫時(shí)間為實(shí)驗(yàn)第四周。
[0141] 二、免疫相關(guān)因子的分析
[0142] 取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行ELISP0T分析。（ELISP0T檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司，產(chǎn)品號(hào) 551083,操作方法見試劑盒產(chǎn)商說明書），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。與對(duì)照組幾乎沒有特異性IFN-y 分泌相比，實(shí)驗(yàn)組EGFR599-607多肽片段能引起很強(qiáng)的特異性IFN-y分泌，說明EGFR599-607多肽片段可以在小鼠體內(nèi)激起較強(qiáng)的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于特異性殺傷腫瘤細(xì) 胞。
[0143] 實(shí)施例5、多肽免疫的抗腫瘤效果
[0144]對(duì)10例肺癌患者進(jìn)行鑒定。取病人血液并通過BB7.2單克隆抗體(購(gòu)自Abeam，貨號(hào) 為ab27728)染色，流式檢測(cè)，分析其細(xì)胞表面HLA-A2分子的表達(dá)。選擇HLA-A2分子陽(yáng)性表達(dá) 的患者進(jìn)行追蹤。待患者術(shù)后，取部分腫瘤組織做石蠟切片，通過免疫組化檢測(cè)其EGFR表 達(dá)水平。選擇其中EGFR強(qiáng)陽(yáng)性的患者腫瘤組織進(jìn)行裸鼠移植實(shí)驗(yàn)。
[0145] 本實(shí)施例中用于動(dòng)物免疫的gp96蛋白是實(shí)施例3中制備得到的gp96蛋白。本實(shí)施 例中用于動(dòng)物免疫的多肽均購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司，純度為95%以上。實(shí)驗(yàn)組的動(dòng) 物免疫多肽為66?1?599-607多肽片段，其氨基酸序列如3￡〇10勵(lì).2所示;對(duì)照組的動(dòng)物免 疫多肽為乙肝病毒HBc82-90肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。本實(shí)施例中用于轉(zhuǎn)輸?shù)?脾臟淋巴細(xì)胞來源于實(shí)施例4中免疫后的小鼠。
[0146] 一、人腫瘤組織裸鼠移植
[0147] 取新鮮腫瘤組織置于無菌平皿內(nèi)（平皿內(nèi)放置少許生理鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)液），將腫 瘤組織剪成2-3mm的小塊，接種于健康裸鼠前腋窩皮下。待移植的腫瘤生長(zhǎng)至100-200mm3 時(shí)，挑選腫瘤生長(zhǎng)均勻的小鼠平均分成兩組，每組10只，轉(zhuǎn)輸脾臟淋巴細(xì)胞。
[0148] 二、免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的分離
[0149] 無菌環(huán)境中取脾臟，將脾臟放于200目篩網(wǎng)上，在10mL無血清1640培養(yǎng)基中用玻璃 研磨棒研磨，將液體轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，lOOOrpm條件下離心10分鐘；棄上清，加入3mL紅 細(xì)胞裂解液于室溫裂解2-3分鐘，加入10mL PBS緩沖液終止反應(yīng)，顛倒混勻，1500rpm離心 10min;棄上清，用10mL無血清1640培養(yǎng)基(購(gòu)自Gibco，貨號(hào)為22400105)洗兩遍，lOOOrpm離 心10分鐘;棄上清，用5mL含體積分?jǐn)?shù)10%的FBS(購(gòu)自Hyclone)的無血清1640培養(yǎng)基重懸。 [0150] 三、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)輸
[0151] 將細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用PBS緩沖液清洗一遍，并用PBS緩沖液按lxl07/200yL的濃度重 懸;將200yL的細(xì)胞懸液慢速尾靜脈注射至移植腫瘤的裸鼠體內(nèi)。
[0152] 四、抗腫瘤效果評(píng)價(jià)
[0153]自初次免疫開始，每隔三天測(cè)量一次小鼠腫瘤大小，腫瘤大小按照0.5 X長(zhǎng)X寬X 寬計(jì)算。
[0154] 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的比較結(jié)果見圖4,與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的小鼠腫瘤大小在 轉(zhuǎn)輸淋巴細(xì)胞一周后開始下降，第3周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤大小對(duì)比如下，實(shí)驗(yàn)組VS對(duì) 照組=246±23 VS 364±37，P<0.01。說明EGFR599-607多肽片段具有顯著的抗腫瘤能力。
[0155] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 <110〉和泓（廈門）生物技術(shù)有限公司 <120〉一種人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽及其應(yīng)用 <160>9 <210>1 <211 >1210 <212>PRT <213> 人(Homo sapiens) <220> <221 >人表皮生長(zhǎng)因子受體蛋白 <400>1
[0156] Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Giu Lys Lys Val Cys Gin 20 25 30 Gly 丁hr Ser Asn Lys Leu Thr Gin Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gin Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 q 60 Leu Glu lie Thr Tyr Val Gin Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr He Gin Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu He Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Gtu Arg lie Pro Leu GIu Asn Leu Gin Tie He Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser 八sn TyrAsp 八laAsn ll5 l20 l25 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gin Glu He Leu 130 135 HO nis Cily Ala Va丨 Arg Phe Ser Asn Asn Pi'o Ala Leu Cys Asn Val (Tlu 145 150 155 160 Ser He Gin Tip Arg Asp He Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Mel Asp Phe Gin Asn His Leu Gly Ser Cys Gin Lys Cys Asp Pro 180 185 190
[0157] Ser Cys Pro Asn Giy Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gin 195 200 205 Lys Leu Thr Lys lie He Cys A!a Gin Gin Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gin Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 二M Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Mel Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gin Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 2S0 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Aia Asp Ser Tyr Glu Met Glu GIu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lvs Cys Lys Lys C'ys Glu Cfly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser He Asn 340 345 150 Ala. Thr Asn lie Lys. His'Phe Lys Asn Cys: Thr Ser lie Ser Gly .Asp. 355 360 36^ Leu. His lie: Leu Pro: Val Ala Phe Arg:Gly Asp' S:er .Phe Thr 扭s Tlir 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gin Olu Leu Asp lie Leu lys Thr Val Lys Glu
[0158] 385 糾 0 395 400 lie Thr Gly Phe Leu Leu He Gin Ala Tip Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 4 b Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu lie He Arg Gly Arg Thr Lys Gin 420 425 430 His Gly Gin Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn He Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie Ser Asp Gly Asp Val lie lie Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cvs Tyr Ala Asn Thr He Asn Trp L.ys Lvs Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gin Lys Thr Lys He He Ser Asn Arg Gly Glu 4S5 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gin Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 MO Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys lie Gin Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gin Ala Mel Asn lie Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys lie Gin Cys Ala His Tyr [le Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590
[0159] Lys Thr Cys Pro Ala Cily Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly 1 lis Val Cys I lis Leu Cys 1 lis Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Glv Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys lie Pro Ser lie Ala Thr Gly N4et Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly lie Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 lie Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gin Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gin Ala Leu Leu 690 695 700 Arg He Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys lie Lys Val Leu Gly Ser 7:05 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr L>.s Gly Leu Tip lie Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys lie Pro Val Ala lie Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu lie Leu Asp Glu Ala Tyi Val Met Ala Ser 75t> 760 765 ￥al Asp Asn Pro His Val Gys Arg Leu Leu Gly lie Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Tlvr Val Gin Leu Tie Thr Gin Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp [0160] 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn He Gly Ser Gin Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gin He Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gin His V^I Lys ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 8前 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro lie Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser lie Leu His Arg lie Tyr Thr His Gin Ser Asp S?5 890 895 Val Trp Ser T>r Gly Thr Trp Glu Leu Met 丁hr Phe C% Ser 900 90d 910 Lys Pro Tyr Asp Gly lie Pro Ala Ser Glu lie Ser Ser lie Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gin Pro Pro lie Cys Thr lie Asp Val Tyr 930 935 940 Met fie Met Val L.ys Cys Trp Met lie Asp Ala Asp Ser Arg Pro I.ys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu lie lie Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gin 965 970 975 Arg Tyr Leu Val He Gin Gly Asp Glu Arg Mel His Leu Pro Ser Pro 980 985 990
[0161 ] Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu He Pro G!n Gin Gly Phe 1010 1015 1020 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Tlir Pro Leu Leu Ser Ser Leu 1025 1030 1035 S er Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys lie A$p Arg Asn 1040 1045 1050 Gly Leu Gin Ser Cys Pro He Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gin Arg 105S 1U6U 106; Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser He Asp 1070 1075 1080 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr lie Asn Gin Ser Val Pro 10B5 1090 1095 Lys Arg Pro Ala Gly Sei，Val Gin Asn Pro Val Tyi* His Asn Gin 1100 110^ mo Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp FJro His Tyr Gin Asp Pro 1115 1120 1125 His Scr Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gin 1130 1135 1140 Pro Thr Cys Val Asn S:er 丁hr Phe Asp Ser Pr? Ala His Tip Ala 1145 11 Mi 1155 Gin Lys Gly Ser His Gin He Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gin 1160 1165 1170 Gin Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly He Phe Lys
[0162] 1175 1180 118， Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gin 1190 1195 1200 Ser Ser Glu Phe He Gly Ala 1205 1210 <21Q>2 <211>9 <212>PRT 〈213>人工序列 <220> <221>EGFR599-607 多肽片段 <400>2
[0163] Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val 9 <210>3 <211>9 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <221 >乙肝病豢HBc82-90肽 <400>3 Arg G-ki Leu Va丄 Val. Ser Tyr Val Asn 9 <210>4 <211>825 <212>DNA <213>人(Homo sapiens) <220> <221〉HLA-A2 的重鏈 <400>4
[0164]
8:25 <210>5 <211>275 <212>PRT <213>.人（Homo sapiens) <220〉 <221> HLA-A2 的重鏈 <400>5 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe lie Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gin 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gin Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp lie Glu Gin Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 50 .5.5. 60 Arg Lys Vfd Lys Ala His Ser Gin Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thi' 65 70 75 80 Leu Arg Gly 7'vr Tyr Asn Gin Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gin 85 90 95 Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr His Gin Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr lie Ala Leu Lys Glu 115 120 125 Asp LeuArgSer Trp. Thr Ala A-la Asp Met A.]a Ala Gin Thr 丁 hr .Lys 130 135 140 His Lvs Trp Glu Ala Ala His ValAla Glu <31n Leu Arg Ala rT'yr Leu 145 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr I.eu Gin Arg Tlir Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His 180 185 190 Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe 195 200 205 Tyi' Pro Ala Glu lie Thr Leu Thr Trp Gin Arg Asp Gly Glu Asp Gin 210 215 220
[0165] Thr Gin Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe (.iln Lys Trp Ala Al.a. Val Val Val Pro Ser Gly Gin Glu (_Hn Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Ci!n His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 260 26^ 270 Arg Trp Glu 275 <210>6 <211>297 <212>DNA <213>A(Homo sapiens) <220>
[0166] <221>HU-A2 的輕鏈 <400>6
<210>7 <211>100 <212> PRT <213>A (Homo sap i ens) <220> <221〉HLA-A2 的輕鏈 <4QG>7 Met He Gla Arg Tfer Pro Lys lie Gin Val Tyr Ser Arg His Pro Ala 1 5 10 15 GIu Asn Glv Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Vkl Ser Gly Phe His 20 25 30 FJro Ser Asp Ife Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly GIu Arg He Glu 35 40 45 Lys Val Glu Ilis Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Ti*p Ser Phe Tyr 50 55 60 Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala 65 70 75 Cys Arg Val Asn ] lis Val Thr Leu Ser Gin Pro Lys lie Val Lys Trp 80 85 90 95
[0167] Asp iVrg Asp Met 100 <210>8 <211>2349 <212>DNA <213>A (Homo sapiens) <220〉 <221〉gp96 蛋白 <400>8

<210>9 <211>803 <212>PRT
[0168] .<21.3>人(Homo .sapiens.) <22Q> <221〉gp96 蛋白 <400>9 Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Oly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe 1 5 10 15 Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu 20 .25 ^0 Glu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val 35 40 45 ￥al Glu Arg Glu Glu Glu Ala lie Gin Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser 50 55 60 Gin lie Arg Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gin Ala 65 70 75 80 Glu Val Asn Arg Met Met Lys Leu lie lie Asn Ser Leu Tyr Lys Asn 85 90 95 Lys Glu He Phe Leu Arg Glu Leu He Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu 100 105 110 Asp Lys lie Arg Leu lie Sei' Le.u Thr Asp Glu Asn Ala Leu S.er Oly 115 120 125 Asn Glu Glu Leu Thr Val Lys lie Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu 130 135 140 Leu His Val Thr Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val 145 150 155 160 Lys Asn Leu Gly Thr lie Al.a Lys Ser Gly Thr .Se-rGlu.. Phe Leu Asn [0169] 165 170 175 Lys Met Thr Glu Ala Gin Glu Asp Gly Gin Ser Thr Ser Glu Leu lie 180 185 190 Gly Gin Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys 195 200 205 Val He Val Thr Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gin His He Tip Glu 210 215 220 Ser Asp Ser Asn Glu Phe Ser Val lie Ala 八sp Pro 八rg Gly 八sn Thr 225 230 235 240 l.eu Gly Arg Gly Thr Thr He Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser 245 250 255 Asp Tyr Leu Glu Leu Asp Thr lie Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser 2 翻 265 270 Gin Phe He Asn Phe Pro lie Tyi* Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr 275 280 2:85 Val Glu Glu Pro Met Glu Olu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu 290 295 300 Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys 305 310 315 320 Pro L.ys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Tip Asp Tip Glu L,eu Met 325 330 335 Asn Asp He Lys Pro lie Trp Gin Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu 340 345 350 Asp Glu Tyr Lys Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp 355 360 365
[0170] Pro Met Ala Tyr He Ilis Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys 370 375 380 Ser He Leu Phe Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu 385 390 395 400 Tyr Gly Ser Lys Lys Ser Asp Tyr He Lys Leu Tyi' Val Arg Arg Val 405 410 41S Phe lie Thr Asp Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asa Phe 420 425 430 Val Lys Gly Val Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg 435 440 445 Glu Thr Leu Gin Gin His Lys Leu Leu Lys Val lie Arg Lys Lys Leu 450 45S 460 Val Arg Lys Thr Leu Asp Met lie Lys Lys lie Ala Asp Asp Lys Tyr 465 470 475 480 Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe Giy T'hr Asn He Lvs Leu Gly Val 485 490 495 He Glu Asp His Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg FJhe 500 505 510 Gin Ser Scr His His Pro Thr Asp He Thr Ser Leu Asp Gin Tyr Val 515 520 525 Glu Arg Met Lys Glu Lys Gin Asp Lys lie T3T Phe Met Ala Gly Ser ^30 53d 540 Ser 八rg Lys Glu.Ala Glu .S.er Ser Pr.o Phe Val Glu.Arg Leu Leu Lys 545 550 555 560 Lys Gly Tyr Glu V^l He Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyi C> s [0171] 565 570 575 He Gin Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gin Asn Val Ala 580 5S5 590 Lys Glu Gly Val Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg 595 600 605 Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Tip Met Lys Asp 610 615 620 Lys Aia Leu Lys Asp Lys lie Glu Lys A!a Val Val Ser Gin Arg Leu 625 630 635 640 Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val A1h Ser Gin Tyr Gly Trp Ser Gly 645 650 655 Asn Met G!u Arg lie Met Lys Ala Gin Ala Tyr Gin Thr Gly Lys Asp 660 665 670 lie Ser Thi A,sn Tyr Tyr Ala Ser Gin Lys Lys Thr Phe Glu lie Asn 67) 680 685 Pro Arg His Pro Leu lie Arg Asp Met Leu Arg Arg lie Lys Glu Asp 690 695 WO Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr 705 710 715 720 Ala Thr Leu Arg Ser Glv Tyf Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly 725 730 735 Asp Arg lie Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn He Asp Pro A.sp
[0172] 〇 740 745 750 Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu 755 760 765 Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gin Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val 770 775 780 Glv Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lvs Glu Ser Thr Ala Glu Lys 785 790 800 Asp Glu Leu 803
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽，其特征在于，該多肽具有SEQ ID NO. 2所 示的氨基酸序列;或 該多肽具有在SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上取代、缺失、置換、插入和/或添加 一個(gè)至幾個(gè)氨基酸的衍生序列。2. -種人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽的編碼基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1 所述的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽。3. -種重組載體，其特征在于，所述重組載體克隆、分泌和/或表達(dá)權(quán)利要求1所述的人 表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽。4. 一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包括權(quán)利要求3所述的重組載體。5. -種權(quán)利要求1所述的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽在腫瘤治療中的應(yīng)用。6. -種疫苗，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的人表皮生長(zhǎng)因子受體的CTL表位多肽 和佐劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述佐劑包括gp96蛋白。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白為采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表 達(dá)分泌型的gp96蛋白。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白通過昆蟲桿狀病毒感染的昆 蟲細(xì)胞分泌表達(dá)。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白和人表皮生長(zhǎng)因子受體的 CTL表位多肽的質(zhì)量比為1:(0.5-10)。11. 根據(jù)權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白包括SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；和/或所述gp96蛋白的編碼基因包括SEQ ID NO.8所示的核苷酸序 列。12. -種權(quán)利要求7-11任一項(xiàng)所述gp96蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 利用昆蟲細(xì)胞分泌表達(dá)gp96蛋白，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清依次進(jìn)行HiTrap Q HP陰離子交換柱 和Superdex 200 10/300GL分子篩層析得到的。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述一種gp96蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下具體步驟： 1) 利用昆蟲桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞分泌表達(dá)gp96蛋白：構(gòu)建含有g(shù)p96蛋白的表達(dá)載 體和轉(zhuǎn)化子;所述轉(zhuǎn)化子為轉(zhuǎn)染有g(shù)p96蛋白的表達(dá)載體的細(xì)胞； 2) 將桿狀病毒侵染轉(zhuǎn)化子后，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27°C，培養(yǎng)時(shí)的轉(zhuǎn)速為100-120rpm/min，培養(yǎng)結(jié)束后，收集上清液； 3) 將上清液進(jìn)行HiTrap-Q Sepharose離子交換層析，具體包括如下步驟： (a) 將步驟2)得到的上清液上樣于層析柱，流速為lmL/min; (b) 用5mL PBS緩沖液洗滌步驟（a)的層析柱，流速為lmL/min，所述PBS緩沖液含有 20〇111]\1恥(：1，？85緩沖液的口!1為7.5 ; (c) 用10mL的PBS緩沖液洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lmL/min;所述PBS緩沖液含有 30〇111]\1恥(：1，？85緩沖液的口!1為7.5 ; (d) 用3mL的PBS緩沖液洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lmL/mi n，得到的洗脫液即為含 有g(shù)p96蛋白的提取物;所述PBS緩沖液含有600mM NaCl，PBS緩沖液的pH為7.5; 4) 將洗脫液進(jìn)行Superdex 200 10/300GL分子篩層析，具體包括如下步驟： (a) 將HiTrap-Q Sepharose離子交換層析所得gp96蛋白提取物通過50Kd超濾管濃縮， 用pH為7.5的PBS換液，濃縮終體積為lmL的濃縮液，所述濃縮液含有g(shù)p96蛋白； (b) 通過上樣環(huán)將上述步驟(a)的濃縮液上樣于層析柱，流速為0.25mL/min; (c) 用PBS緩沖液洗滌層析柱，流速為0.25mL/min，收取gp96蛋白；將收集的gp96蛋白用 pH為7.5的PBS緩沖液換液，濃縮，測(cè)定gp96蛋白濃度后分裝、貯存。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK105820234SQ201610281155
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】孟頌東, 王剛, 李鑫
【申請(qǐng)人】和泓（廈門）生物技術(shù)有限公司