一種自噬抑制劑與拉帕替尼組合物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物及其用途；該藥物組合物包含細(xì)胞自噬抑制劑和拉帕替尼；其中，所述的細(xì)胞自噬抑制劑選自3-MA、渥曼青霉素、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素A1、NH4Cl、氯喹和羥基氯喹中的一種或多種。所述藥物組合物，可通過(guò)抑制拉帕替尼誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的自噬、抵消腫瘤由于細(xì)胞自噬而引起的對(duì)拉帕替尼治療的拮抗作用，顯著增強(qiáng)拉帕替尼對(duì)腫瘤的治療效果。本發(fā)明的藥物組合物可增強(qiáng)拉帕替尼對(duì)腫瘤的殺傷作用，增強(qiáng)拉帕替尼的療效，可用于治療惡性腫瘤。
【專利說(shuō)明】一種自噬抑制劑與拉帕替尼組合物及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及新的治療腫瘤的藥物組合物；具體涉及一種自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物及其用途；該藥物組合物用于治療腫瘤。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，隨著腫瘤分子靶向治療的快速發(fā)展，分子靶向治療藥物層出不窮；通常分子靶向治療藥物按照藥物分子大小可分為大分子單克隆抗體(單抗)和小分子化合物兩類；其中，單克隆抗體通過(guò)識(shí)別受體的胞外可辨區(qū)，與生長(zhǎng)因子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體，抑制信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的激活，從而抑制癌細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散；但其經(jīng)常會(huì)使患者產(chǎn)生耐藥性，由FDA批準(zhǔn)的人源性單克隆抗體赫賽汀Trastuzumab (Herceptin)和紫杉醇類藥物的合用已經(jīng)成為治療乳腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)。所述赫賽汀同時(shí)也可與其他藥物合用來(lái)增加藥效，降低癌癥的復(fù)發(fā)；雖然赫賽汀有很好的治療效果，但臨床實(shí)踐顯示，有患者在連續(xù)一年用藥后會(huì)產(chǎn)生耐藥性[Baselga J, Swain SM.Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 anddiscovering ERBB3.Nat Rev Cancer 2009; 9: 463-475.]。有研究指出，由于小分子化合物不會(huì)引起免疫反應(yīng)，且可對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行直接修飾或結(jié)構(gòu)改造，其可直接透過(guò)細(xì)胞膜而直接作用于表皮生長(zhǎng)因子受體的胞內(nèi)激酶而直接對(duì)其所控制的細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行抑制；所述小分子靶向化合物可分為分裂激酶功能域受體酪氨酸激酶亞群抑制劑、表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶家族抑制劑、多靶點(diǎn)激酶抑制劑以及雙靶向酪氨酸激酶抑制劑。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了拉帕替尼(lapatinib, Tykerb)屬喹唑啉胺類化合物,是口服的小分子EGFR (ErbB-1)/HER-2 (ErbB-2)雙受體酪氨酸激酶抑制劑，其化學(xué)名:二對(duì)苯基磺酸拉帕替尼單水合物(lapatinib ditosyla temonohydrate)。拉帕替尼于2007年5月由美國(guó)FDA批準(zhǔn)與卡培他濱聯(lián)合治療HER2過(guò)度表達(dá)的乳腺癌，同時(shí)也能聯(lián)合葸環(huán)類、紫杉醇、曲妥珠單抗(Trastuzumab)等藥物來(lái)治療晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。拉帕替尼同時(shí)還能被用于治療對(duì)曲妥珠單抗產(chǎn)生耐藥性的HER2陽(yáng)性陽(yáng)性細(xì)胞，如SKBR3細(xì)胞并誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡。除了乳腺癌，研究還發(fā)現(xiàn)，拉帕替尼同樣對(duì)HER2過(guò)表達(dá)的胃癌也有治療效果[Rusnak Dff, Lackey K, Affleck K, et al.The effects of the novel, reversibleepidermal growth factor receptor/ErbB-2 tyrosine kinase inhibitor, GW2016, onthe growth of human normal and tumor-derived cell lines in vitro and in viv0.Mol Cancer Ther.2001; 1: 85-94.]。拉帕替尼通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)的EGFR和HER2的ATP位點(diǎn)阻止腫瘤細(xì)胞磷酸化和激活，阻斷EGFR和HER2受體的下游信號(hào)通路，主要包括了 PI3K/AKT, Ras/MEKK/JNK, Ras/Raf-1/MAPK以及Ras/Rac/Rho通路。上述通路的抑制直接導(dǎo)致月中瘤生長(zhǎng)收到抑制，同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[Gilmer TM, Cable L, Alligood K, et al.1mpact of common epidermal growth factor receptor and HER2 variants on receptoractivity and inhibit1n by lapatinib.Cancer Res.2008; 68: 571-579.]。
[0004]然而，在臨床治療中，除要考慮藥物的治療效果外，更重要的還需考慮藥物的安全性。有患者在服用了拉帕替尼后會(huì)產(chǎn)生一定的耐受性，臨床結(jié)果同時(shí)也顯示拉帕替尼引起常見(jiàn)的皮疹、惡心、嘔吐、疲勞和腹瀉等副作用；當(dāng)患者對(duì)拉帕替尼的藥效產(chǎn)生耐藥后，力口大用藥量將進(jìn)一步加劇其產(chǎn)生的毒副作用，有研究發(fā)現(xiàn)拉帕替尼所引起的副作用與拉帕替尼的服用劑量呈線性相關(guān)[Burris HA, 3rd, Hurwitz HI, Dees EC, et al.Phase Isafety, pharmacokinetics, and clinical activity study of lapatinib (GW572016),a reversible dual inhibitor of epidermal growth factor receptor tyrosinekinases, in heavily pretreated patients with metastatic carcinomas.J ClinOncol.2005; 23: 5305-5313.]。
[0005]細(xì)胞自卩遼(autophagy)又稱II 型程序性死亡(type II programmed cell death),是真核生物體內(nèi)常見(jiàn)的“自我消化”(cellular degradat1n)的現(xiàn)象；其能分解細(xì)胞內(nèi)受損或多余的細(xì)胞器和蛋白產(chǎn)生核苷酸，氨基酸等小分子物質(zhì)供細(xì)胞合成新的蛋白質(zhì)，并能維持細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)及基因技術(shù)的發(fā)展和對(duì)細(xì)胞自噬的深入認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)其與多種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體腔內(nèi)方式的不同，哺乳動(dòng)物細(xì)胞自卩遼可分為三種方式:大自卩遼(macroautophagy)、小自曬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自卩遼(chaperone-mediated autophagy, CMA)；所述的大自曬(以下簡(jiǎn)稱自曬)與腫瘤發(fā)展及治療關(guān)系最為密切[Sridhar S，BotbolY, Macian F，et al.Autophagy and disease: always two sides to a problem.JPathol.2012;226(2):255-73.]。自噬是胞漿大分子物質(zhì)和細(xì)胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學(xué)過(guò)程，該過(guò)程大致能分為4個(gè)階段:(I)在饑餓、缺氧、藥物干擾等某些因素的刺激下，自噬泡的雙層膜結(jié)構(gòu)開(kāi)始逐漸形成并包圍在被降解物的周圍；(2)自噬泡完全成型并將要被降解的物質(zhì)完全隔離于細(xì)胞質(zhì)；(3)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體；(4)自噬溶酶體最終被溶酶體中的水解酶溶解，降解產(chǎn)物可在細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)利用° [Martinez-Borra J, Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.AdvExp Med B1l.2012; 738:169-84.] 0自噬能使細(xì)胞對(duì)外部環(huán)境改變及各種刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。細(xì)胞在生長(zhǎng)條件下能發(fā)生較低水平的自噬，稱基礎(chǔ)自噬；然而，一旦受到外界的刺激，如饑餓、缺氧、高溫、高細(xì)胞密度或是生長(zhǎng)因子剝奪等，細(xì)胞自噬的水平將會(huì)迅速上調(diào)；如在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況下，細(xì)胞自噬能分解體內(nèi)壞死細(xì)胞器產(chǎn)生氨基酸等供細(xì)胞合成新的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞的存活[①Piacentini M, D’Eletto M, Falasca L, et al.Transglutaminase 2 at the crossroads between cell death and survival.AdvEnzymol Relat Areas Mol B1l.2011;78:197-246 ;② Cook KL, Shajahan AN, ClarkeR.Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.Expert Rev AnticancerTher.2011; 11 (8): 1283-94.Wirawan E, Vanden Berghe T, Lippens S, et al.Autophagy: for better or for worse.Cell Res.2012;22 (I):43-61.]。
[0006]研究發(fā)現(xiàn)，自噬能降解折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)、損傷的細(xì)胞器等，延緩機(jī)體衰老的發(fā)生。所述集體衰老相關(guān)疾病一神經(jīng)退行性疾病可被歸類為蛋白構(gòu)象錯(cuò)誤疾病，通常是由于大量折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)堆積從而引發(fā)細(xì)胞毒性而造成的。研究表明，大量衰老性疾病，如神經(jīng)退行性疾病和惡性腫瘤都與細(xì)胞自噬密切相關(guān)[①M(fèi)artinez-Borra J, Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med B1l.2012; 738:169-84.-’② Caballero B, Coto-Montes A.An insight into the role ofautophagy in cell responses in the aging and neurodegenerative brain.HistolHistopathol.2012;27 (3):263-75.!③ Mendelsohn AR, Larrick Jff.Rapamycin asan antiaging therapeutic: targeting mammalian target of rapamycin to treatHutchinson-Gilford progeria and neurodegenerative diseases.Rejuvenat1n Res.2011; 14(4):437-41.]。
[0007]細(xì)胞自噬在生物體的發(fā)育和分化過(guò)程中起了重要作用。據(jù)報(bào)道，自噬基因缺失或者突變的線蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育缺陷、衰老加速并縮短壽命；且自噬也參與果蠅變態(tài)的發(fā)生。自噬在哺乳動(dòng)物成年個(gè)體組織器官發(fā)育和分化中也起了重要作用[Mizushima N, Komatsu Μ.Autophagy: renovat1n of cells and tissues.Cell.2011;147 (4):728-41.]。
[0008]此外，作為程序性細(xì)胞死亡的一種，細(xì)胞自噬能通過(guò)多種途徑直接或是間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡° [Denton D, Nicolson S，Kumar S.Cell death by autophagy: facts andapparent artefacts.Cell Death Differ.2012; 19 (I): 87-95.]。細(xì)胞在一些特定的條件下，由于一系列因素的影響導(dǎo)致了各類基因突變從而導(dǎo)致的細(xì)胞各類遺傳性狀及功能改變；該類改變可能將具有正常功能和特性的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹至蜒杆?、抗凋亡等惡性特征的?xì)胞即癌細(xì)胞。有研究表明，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展和自噬的關(guān)系極為密切。
[0009]通常由于細(xì)胞自噬有利于細(xì)胞的存活，因此無(wú)論在正常細(xì)胞或是腫瘤細(xì)胞中，自噬都普遍被保留下來(lái)，并在一般情況下都維持著基礎(chǔ)自噬。但是，自噬究竟是抑制還是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展目前尚無(wú)定論；自噬初期可作為腫瘤發(fā)生的一種抑制因素，一些已知的腫瘤抑制因子，如PTEN、TSCl和TSC2能激活自噬，并對(duì)自噬的抑制可使蛋白降解減少，合成代謝增加，最終導(dǎo)致原癌細(xì)胞持續(xù)增殖。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同，但在癌變之后其自噬能力均減弱。自噬缺乏可引起自噬底物p62積聚，通過(guò)NF-k B信號(hào)途徑引起腫瘤形成[Trocoli A, Djavaher1-Mergny M.Thecomplex interplay between autophagy and NF-κ B signaling pathways in cancercells.Am J Cancer Res.2011; I (5):629-49.];然而,在腫瘤生長(zhǎng)到一定程度時(shí)，尤其是當(dāng)腫瘤內(nèi)還沒(méi)有形成足夠的血管為其擴(kuò)增提供營(yíng)養(yǎng)時(shí)，腫瘤細(xì)胞也可通過(guò)自噬來(lái)克服營(yíng)養(yǎng)缺乏和低氧的環(huán)境得以生存。研究還顯示，在缺乏血清或氨基酸的情況下約3 h，HeLa細(xì)胞中的自噬部分從4%上升到37%，結(jié)果表明，在營(yíng)養(yǎng)缺乏等條件下自噬也是腫瘤細(xì)胞的一種自我保護(hù)的機(jī)制[Baldwin AS.Regulat1n of cell death and autophagy by IKK andNF-κ B: critical mechanisms in immune funct1n and cancer.Tmmunol Rev.2012;246(1):327-45.]。
[0010]目前，抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬所體現(xiàn)的作用大致可概括為兩種:大部分情況下是對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)，某些情況下也能對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。有研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物5-FU以及單克隆抗體藥物曲妥珠單抗(Trastuzumab)和西妥昔單抗(Cetuximab)均能顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，且抑制由這3種藥物產(chǎn)生的細(xì)胞自噬能顯著增加腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的敏感性，[① Vazquez-Martin A, Oliveras-Ferraros C，Menendez JA.AutophagyFacilitates the Development of Breast Cancer Resistance to the Ant1-HER2Monoclonal Antibody Trastuzumab.PLoS One.2009; 4(7): e6251.!② Li J, Hou N,Faried A, Tsutsumi S, et al.1nhibit1n of Autophagy by 3-MA Enhances the Effectof 5-FU-1nduced Apoptosis in Colon Cancer Cells.Ann Surg Oncol.2009; 16(3):761 - 771。[0011 ] 迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)拉帕替尼誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬以及細(xì)胞自噬抑制劑與拉帕替尼制成復(fù)方藥物、組合物進(jìn)行聯(lián)合給藥或是序貫給藥的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種新型的藥物組合物，具體涉及一種自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物；該藥物組合物包含一種或多種細(xì)胞自噬抑制劑，其自身無(wú)明顯細(xì)胞毒性但能通過(guò)抑制細(xì)胞自噬來(lái)增強(qiáng)拉帕替尼的療效，從而降低拉帕替尼在治療腫瘤時(shí)的用量，減少其潛在的副作用和降低治療成本。
[0013]本發(fā)明基于目前主要用于腫瘤治療的化療藥物大多會(huì)產(chǎn)生耐藥性及對(duì)患者有較強(qiáng)的副作用；其中，雖然拉帕替尼的抗腫瘤作用得到了廣泛的論證，但其體內(nèi)親和力較低，起效劑量較大，存在一些潛在的毒副作用；因此，本發(fā)明提供一種自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物；該藥物組合物可加強(qiáng)拉帕替尼活性從而降低其用量和毒副作用；該藥物組合物可通過(guò)使用一種或者幾種自噬抑制劑與拉帕替尼制成復(fù)方藥物或是組合物，進(jìn)行聯(lián)合給藥或是序貫給藥，加強(qiáng)拉帕替尼的抗腫瘤療效。
[0014]本發(fā)明還基于細(xì)胞自噬與多種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切，本發(fā)明的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物中，細(xì)胞自噬抑制劑在拉帕替尼對(duì)HER2高表達(dá)的乳腺癌的治療過(guò)程中對(duì)拉帕替尼有抵抗作用，且使用細(xì)胞自噬抑制劑能加強(qiáng)拉帕替尼對(duì)肺癌、腦瘤、乳腺癌、胃癌、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤的療效，尤其是乳腺癌和胃癌。
[0015]具體而言，本發(fā)明的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特征在于，包含細(xì)胞自噬抑制劑和拉帕替尼；
所述的細(xì)胞自卩遼抑制劑選自3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素 Al (Bafilomycin Al)、NH4C1、氯喹(Chloroquine)和輕基氯喹(hydroxychloroquine)中的一種或多種；優(yōu)選為 3-MA (3-Methyladenine)、氯喹(Chloroquine)和輕基氯喹(hydroxychloroquine)中的一種或多種；
本發(fā)明中，所述的細(xì)胞自噬抑制劑與拉帕替尼組成藥物組合物、復(fù)方藥物或序貫使用(序貫使用能增強(qiáng)拉帕替尼治療惡性腫瘤的療效)，用于治療惡性腫瘤；
本發(fā)明中，所述的腫瘤包括但不限于乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和骨髓瘤，尤其是乳腺癌和胃癌，其中最優(yōu)為HER2過(guò)度表達(dá)或者發(fā)生其它病變的乳腺癌和胃癌；
本發(fā)明中，所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，可通過(guò)抑制拉帕替尼誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的自噬而抵消腫瘤由于細(xì)胞自噬而引起的對(duì)拉帕替尼治療的拮抗作用，從而顯著增強(qiáng)拉帕替尼對(duì)腫瘤的治療效果；
本發(fā)明所述的藥物組合物中，進(jìn)一步選自下述的形式進(jìn)行配制，包括:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質(zhì)體、納米微球等。
[0016]本發(fā)明進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所述藥物組合物中的拉帕替尼能顯著誘導(dǎo)乳腺癌SKBR3和胃癌N87細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬，而細(xì)胞自噬則會(huì)部分抵消拉帕替尼的抗腫瘤效果；自噬在拉帕替尼殺傷腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中起保護(hù)作用，抑制自噬能使拉帕替尼作用細(xì)胞的活力降低，增加凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯；通過(guò)使用自噬抑制劑抑制細(xì)胞自噬能增加乳腺癌SKBR3和胃癌N87細(xì)胞對(duì)拉帕替尼的敏感性，從而增強(qiáng)拉帕替尼的療效； 本發(fā)明中，采用一種或多種自噬抑制劑與拉帕替尼制成復(fù)方藥物、藥物組合物或聯(lián)合給藥或序貫給藥，用于治療惡性腫瘤，可增強(qiáng)拉帕替尼對(duì)腫瘤的殺傷作用，增強(qiáng)拉帕替尼的療效。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1顯示了拉帕替尼抑制SKBR3和N87細(xì)胞增殖，其中，
A:拉帕替尼抑制SKBR3增殖；
B:拉帕替尼抑制N87增殖。
[0018]圖2顯示了拉帕替尼誘導(dǎo)乳腺癌SKBR3細(xì)胞、胃癌N87細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬，其中， A:加藥組細(xì)胞中發(fā)出的熒光為明顯的點(diǎn)狀，而DMSO對(duì)照組的熒光卻呈彌散狀，無(wú)明顯的點(diǎn)狀出現(xiàn)；
B:與對(duì)照組相比，給予拉帕替尼的SKBR3和N87細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)水平增強(qiáng)。
[0019]圖3顯示了抑制自噬能增強(qiáng)拉帕替尼誘導(dǎo)的SKBR3和N87細(xì)胞死亡，其中，
A:拉帕替尼能顯著降低SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞活力，與拉帕替尼單獨(dú)使用組相比，拉帕替尼與自噬抑制劑3-MA或CQ聯(lián)合應(yīng)用組的SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞活力有顯著性下降；
B:拉帕替尼能顯著降低N87細(xì)胞的細(xì)胞活力，與拉帕替尼單獨(dú)使用組相比，拉帕替尼與自噬抑制劑3-MA或CQ聯(lián)合應(yīng)用組的N87細(xì)胞的細(xì)胞活力有顯著性下降。
[0020]圖4顯示了細(xì)胞自噬在拉帕替尼所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用，其中，* P <0.05，#P < 0.01，
A:拉帕替尼能抑制SKBR3細(xì)胞中HER2受體蛋白的磷酸化；
B:與單用拉帕替尼的對(duì)照組相比，拉帕替尼與20 μ M CQ或者2 mM 3-MA聯(lián)用后，均顯著增加cleaved_Caspase3的表達(dá)；
C:SKBR3的凋亡率從45.50%上升至72.48%，N87細(xì)胞的凋亡率從27.30%升至42.66%ο
[0021]圖5顯示了細(xì)胞自噬在拉帕替尼所誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯過(guò)程中的作用。

【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1:配制自噬抑制劑藥物
(1)配制氯喹:取適量氯喹溶于純水配成lOmmol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ M的濾器過(guò)濾除菌后保存于4°C，體外實(shí)驗(yàn)用PRM1-1640培養(yǎng)基稀釋500-1000倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(2)配制氯化銨:取適量氯化銨溶于水配成0.4mol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ M的濾器過(guò)濾除菌后保存于4°C ;體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋50-80倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(3)配制羥基氯喹:取適量羥基氯喹溶于純水配成lOmmol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ M的濾器過(guò)濾除菌后保存于4°C，體外實(shí)驗(yàn)室稀釋500-1000倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(4)配制3-MA:取適量3-MA干粉配制成0.2mol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ M的濾器過(guò)濾除菌后保存于_20°C ;體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋50-200倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(5)配制LY294002:取適量LY294002干粉配制成0.2mol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ M的濾器過(guò)濾除菌后保存于-20°C ;體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋50-100倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(6)配制巴伐洛霉素Al:取適量巴伐洛霉素Al干粉配制成0.5 μ g/mL的儲(chǔ)存液，用0.1 μ M的濾器過(guò)濾除菌后保存于-20°c，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋1000倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(7)自噬抑制劑與拉帕替尼聯(lián)合應(yīng)用于體內(nèi)或體外抗腫瘤時(shí)，自噬抑制劑3-MA的使用濃度范圍為0-1 mol/L,自噬抑制劑CQ的使用濃度范圍為0-50 mol/L，羥基氯喹的使用濃度范圍為0-50 mol/L, LY294002的使用濃度范圍為Ο-lmol/L，巴伐洛霉素Al的使用濃度范圍為 0-10mol/L。
[0023]實(shí)施例2:細(xì)胞培養(yǎng)
乳腺癌SKBR3細(xì)胞和胃癌N87細(xì)胞使用含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的PRM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞消化后以l*105cellS/mL的濃度轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h后各組細(xì)胞分別給予相應(yīng)濃度的拉帕替尼；聯(lián)合給藥時(shí)，給藥前I h加入20 μ M CQ或者2 mM 3-MA抑制SKBR3和N87細(xì)胞的細(xì)胞自噬；連續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h或72 h后進(jìn)行下一步處理。
[0024]實(shí)施例3:拉帕替尼能抑制SKBR3和N87細(xì)胞的增殖
將適當(dāng)濃度的SKBR3和N87細(xì)胞種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入拉帕替尼使拉帕替尼的終濃度為0-1.6 μ M，培養(yǎng)48 h，向每孔加入10 μ LMTT液，在培養(yǎng)箱內(nèi)放置4 h,之后用DMSO溶液溶解，570nm下測(cè)量光密度值(0.D.)，結(jié)果如圖1的A、B所示，拉帕替尼對(duì)SKBR3和N87細(xì)胞有良好的藥效并且拉帕替尼對(duì)SKBR3和N87細(xì)胞的殺傷作用具有良好的劑量依賴性。
[0025]實(shí)施例4:拉帕替尼能誘導(dǎo)乳腺癌SKBR3細(xì)胞、胃癌N87細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬乳腺癌SKBR3細(xì)胞、胃癌N87細(xì)胞用LC3-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，再用0.1 μ M拉帕替尼處理48 h，隨后在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光斑點(diǎn)，結(jié)果如圖2A所示，加藥組細(xì)胞中發(fā)出的熒光為明顯的點(diǎn)狀，而DMSO對(duì)照組的熒光卻呈彌散狀，無(wú)明顯的點(diǎn)狀出現(xiàn)。
[0026]將收集到的SKBR3和N87細(xì)胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細(xì)胞，并定量后按照每個(gè)泳道20 μ g進(jìn)行蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉I h，分別加入LC3 II和β-actin抗體，于4°C孵育12 h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5 h，用ECL顯色液顯色；SKBR3和N87細(xì)胞經(jīng)過(guò)拉帕替尼處理不同時(shí)間或不同濃度處理后，通過(guò)WesternBlot的檢測(cè)，結(jié)果如圖2B所示，與對(duì)照組相比，給予拉帕替尼的SKBR3和N87細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)水平增強(qiáng)。
[0027]實(shí)施例5:抑制自噬能增強(qiáng)拉帕替尼誘導(dǎo)的SKBR3和N87細(xì)胞死亡
SKBR3和N87細(xì)胞分別給予0.1 μ M的拉帕替尼，并在給藥前I h加入2mmol/L的3-MA和20 μ mol/L的CQ抑制細(xì)胞自噬；連續(xù)培養(yǎng)48 h后經(jīng)過(guò)MTT法測(cè)定各組的細(xì)胞活力，結(jié)果如圖3A、B所示，拉帕替尼能顯著降低SKBR3和N87細(xì)胞的細(xì)胞活力，與拉帕替尼單獨(dú)使用組相比，拉帕替尼與自噬抑制劑3-MA或CQ聯(lián)合應(yīng)用組的SKBR3和N87細(xì)胞的細(xì)胞活力有顯著性下降；表明自噬抑制劑和拉帕替尼的聯(lián)合給藥能更有效地抑制SKBR3和N87細(xì)胞的生長(zhǎng)，且只加抑制劑3-MA和CQ組的細(xì)胞活力與對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異；抑制劑本身對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性，自噬抑制劑和拉帕替尼的聯(lián)合給藥所降低的SKBR3和N87細(xì)胞的細(xì)胞活性并非是抑制劑和藥物的協(xié)同作用所致，而是因抑制自噬后增加SKBR3和N87細(xì)胞對(duì)拉帕替尼的藥物敏感性；結(jié)果表明，抑制自噬能增加拉帕替尼對(duì)SKBR3和N87細(xì)胞的殺傷作用。
[0028]實(shí)施例6:細(xì)胞自噬在拉帕替尼所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用
(I)拉帕替尼和自噬抑制劑聯(lián)用對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響
選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以10X 15個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于細(xì)胞6孔板內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁充分后，加入0.ΙμΜ的拉帕替尼(SKBR3細(xì)胞)再繼續(xù)培養(yǎng)48 h ;然后采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞全蛋白組，然后進(jìn)行Western-blot。
[0029]結(jié)果如圖4A所示，拉帕替尼能抑制SKBR3細(xì)胞中HER2受體蛋白的磷酸化；拉帕替尼促進(jìn)PARP的剪切，且呈明顯的量效關(guān)系；拉帕替尼下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)，且呈明顯的量效關(guān)系；隨拉帕替尼濃度增加，SKBR3細(xì)胞中LC3-1I的表達(dá)量增多；
(2)拉帕替尼和自曬抑制劑聯(lián)用對(duì)Caspase-3表達(dá)水平的影響
與單用拉帕替尼的對(duì)照組相比，拉帕替尼與20 μ M CQ或者2 mM 3-MA聯(lián)用后，均顯著增加cleaved-Caspasd的表達(dá)(如圖4B所示)，表明使用自噬抑制劑CQ或是3-MA抑制細(xì)胞自噬能增強(qiáng)拉帕替尼誘導(dǎo)的SKBR3和N87細(xì)胞的凋亡；
(3)流式細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果
①DMSO對(duì)照組中，SKBR3和N87細(xì)胞的凋亡較少；②加入0.1 μΜ的拉帕替尼后，SKBR3的凋亡率為45.50%,而Ν87細(xì)胞的凋亡率也為27.30% 0.1 μ M拉帕替尼與20μ M的CQ聯(lián)用后，與單用拉帕替尼相比，SKBR3的凋亡率上升了將近一倍，為87.61%，Ν87細(xì)胞的凋亡率也為從原先的27.30%上升到了 52.26% ;④加入2 mM的3-MA后，SKBR3和N87細(xì)胞的凋亡率分別為12.05%和12.90% ;⑤加入0.1 μ M的拉帕替尼的同時(shí)再加入2mM的3-MA后，SKBR3的凋亡率從原先的45.50%上升至72.48%，N87細(xì)胞的凋亡率也為從原先的27.30%上升到了 42.66% (如圖4C所示)；
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制細(xì)胞自噬能增強(qiáng)拉帕替尼誘導(dǎo)乳腺癌SKBR3和胃癌N87細(xì)胞犯人凋亡。
[0030]實(shí)施例7:細(xì)胞自噬在拉帕替尼所誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯過(guò)程中的作用
①對(duì)照組54.27%的SKBR3細(xì)胞處于Gl期，31.67%的細(xì)胞處于分裂期加入了 0.1μ M的拉帕替尼后，72.60% SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞周期處于Gl期(P < 0.05)，而處在細(xì)胞分裂期的細(xì)胞比例降低至16.63% ;③加入20 μ M的CQ后，有55.00% SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞周期處于細(xì)胞間期中的Gl期(P < 0.05)，處在細(xì)胞分裂期的細(xì)胞比例為28.00%，通過(guò)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢測(cè)出其與DMSO處理組相比無(wú)顯著性差異；④加入0.1 μ M的拉帕替尼的同時(shí)，再加入20 μ M的CQ，發(fā)現(xiàn)有81.13%SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞周期處于間期中的Gl期，而處在細(xì)胞分裂期細(xì)胞的比例下降到6.53%，通過(guò)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢測(cè)出其與拉帕替尼單獨(dú)處理組相比有顯著性的差異(P < 0.05);⑤加入2 mM的3-MA后，發(fā)現(xiàn)大約有57.87% SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞周期處于細(xì)胞間期中的Gl期，處在細(xì)胞分裂期的細(xì)胞比例為30.43%，通過(guò)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢測(cè)出其與DMSO對(duì)照組相比無(wú)顯著性的差異(P > 0.05);⑥加入0.1 μΜ的拉帕替尼的同時(shí)再加入2 mM的3-MA后，結(jié)果顯示，大約有78.43% SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞周期處于細(xì)胞間期中的Gl期，而處在細(xì)胞分裂期的細(xì)胞比例下降到6.64%，通過(guò)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢測(cè)出其與拉帕替尼單獨(dú)處理組相比有顯著性的差異(P < 0.05)(如圖5所示)；
結(jié)果表明，拉帕替尼與自噬抑制劑聯(lián)用對(duì)胃癌N87細(xì)胞周期的影響和乳腺癌SKBR3的影響類似；自噬抑制劑CQ或3-MA抑制細(xì)胞自噬能增強(qiáng)拉帕替尼所誘導(dǎo)的SKBR3和N87細(xì)胞周期的阻滯現(xiàn)象。
[0031]實(shí)施例8:配制自噬抑制劑和拉帕替尼藥物組合物 (O氯喹和拉帕替尼藥物組合物的配制
主藥拉帕替尼250g ，自噬抑制劑氯喹200g，淀粉為填充劑，兼做內(nèi)加崩解劑40g，10%淀粉漿為黏合劑24g，外加崩解劑干淀粉23g ，硬脂酸鎂為潤(rùn)滑劑3g，制成1000片，每片含拉帕替尼0.25g ；
(2)巴伐洛霉素Al和拉帕替尼藥物組合物的配制
拉帕替尼250g ，巴伐洛霉素Al 180g ，淀粉40g，10%淀粉漿25g ，外加崩解劑干淀粉20g，潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂4g，制成1000片，每片含拉帕替尼0.25g。
【權(quán)利要求】
1.一種自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特征在于，包含細(xì)胞自噬抑制劑和拉帕替尼； 所述的細(xì)胞自噬抑制劑選自3-MA、渥曼青霉素、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素Al、NH4C1、氯喹和羥基氯喹中的一種或多種。
2.按權(quán)利要求1所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特征在于，所述的細(xì)胞自噬抑制劑選自3-MA、氯喹和羥基氯喹中的一種或多種。
3.按權(quán)利要求1所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特征在于，所述的細(xì)胞自噬抑制劑與拉帕替尼制成復(fù)方藥物。
4.按權(quán)利要求3所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特征在于，所述復(fù)方藥物制成:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質(zhì)體或納米微球劑型。
5.按權(quán)利要求3所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物，其特征在于，所述的復(fù)方藥物中，自噬抑制劑與拉帕替尼序貫使用。
6.權(quán)利要求1所述的自噬抑制劑與拉帕替尼藥物組合物在制備治療腫瘤藥物中的用途。
7.按權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤選自乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。
8.按權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤選自HER2過(guò)度表達(dá)或者發(fā)生其它病變的乳腺癌或胃癌。
9.按權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的自噬抑制劑抑制拉帕替尼誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的自噬、抵消腫瘤由于細(xì)胞自噬而引起的對(duì)拉帕替尼治療的拮抗作用。
【文檔編號(hào)】A61K33/02GK104324035SQ201310310119
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2013年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月23日
【發(fā)明者】鞠佃文, 王曉丹, 王子玉, 曾賢, 李玉彬, 范佳君, 王紹飛 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)