眼內(nèi)抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型及其建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種眼內(nèi)抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型及其建立方法。利用眼部葡萄膜或視網(wǎng)膜抗原+弗氏完全佐劑免疫動(dòng)物后7-10天，足底注射內(nèi)毒素，誘發(fā)動(dòng)物自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎。眼部葡萄膜或視網(wǎng)膜抗原來(lái)自于天然提純、基因工程重組、化學(xué)合成的蛋白或多肽。視網(wǎng)膜抗原為人或動(dòng)物光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白、視網(wǎng)膜可溶性抗原等蛋白或多肽抗原。動(dòng)物為小鼠或大鼠。內(nèi)毒素為大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等革蘭氏陰性菌包壁成分。本發(fā)明建立的EAU模型，可以更好的模擬人類“自然”發(fā)病環(huán)境，有利于排除PTX對(duì)EAU研究的干擾。另外，用C57BL/6小鼠建立的模型，有利于應(yīng)用基因修飾和基因缺陷技術(shù)來(lái)研究EAU的病因和機(jī)制。
【專利說(shuō)明】眼內(nèi)抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型及其建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種眼內(nèi)抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型及其建立方法，屬于自身免疫性疾病模型的建立和研究領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]葡萄膜炎，特別是葡萄膜視網(wǎng)膜炎常累及葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管及玻璃體， 且多發(fā)生于青壯年，并可反復(fù)發(fā)作，是一種種類繁多、病因復(fù)雜多樣的眼科常見致盲疾病之一。其病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近二三十年來(lái)，利用視網(wǎng)膜抗原和/或細(xì)菌成分建立了多種葡萄膜炎的動(dòng)物模型，包括EIlXendotoxin-1nduced uveitisPEAlXexperimental autoimmunity uveoretinitis),為探索和研究葡萄膜炎的病理?yè)p害及其機(jī)制發(fā)揮重要作用(Immunol Cell Biol, 1998，76 (6):497-512)。
[0003]然而，這些模型在模擬人類葡萄膜炎的發(fā)病環(huán)境或病程上和人類葡萄膜炎的致病環(huán)境和發(fā)病過(guò)程存在許多差異，如=EIU起病快、病程短、炎癥消散迅速，與人類葡萄膜炎的病程長(zhǎng)、易慢性化、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)形成顯著差別(眼科研究，2009，27 (5):374-379)； EIU的病理?yè)p害主要是眼前節(jié)的虹膜睫狀體部的中性粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞滲出和浸潤(rùn)為主(Invest Ophthalmol Vis Sci, 1983，24(2): 196-202)。對(duì) EIU 誘發(fā)細(xì)胞因子反應(yīng)的研究表明，這些炎性因子均為天然免疫的促炎因子(Immunol Cell Biol, 1998， 76(6):497-512)，而且EIU小鼠脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)眼部的抗原或多肽抗原刺激無(wú)增殖反應(yīng)， 以上這些EIU的這些炎癥反應(yīng)和病理特征以及EIU起病急，病程短、消散快等一過(guò)性的病程特點(diǎn)，均表明EIU的病理?yè)p害均屬于非特異性炎癥反應(yīng)，而不是由自身抗原引發(fā)的自身免疫性疾病。
[0004]同時(shí)，傳統(tǒng)EAU模型不僅需要CFA (弗氏完全佐劑)，而且需要百日咳毒素 (Pertussis toxin, PTX)等罕見致病原作為輔助佐劑才能誘導(dǎo)成功(Methods Mol Med, 2004，102:395-419)，這種需要PTX的傳統(tǒng)EAU模型與人類葡萄膜炎的流行病學(xué)和發(fā)病環(huán)境有明顯差異，以其作為人類自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎的病因?qū)W和致病機(jī)理研究模型可能會(huì)產(chǎn)生偏差(Invest Ophthalmol Vis Sci, 1999，40:2898 - 2905)? 而且，PTX 是一種具有多效性的佐劑，它不僅具有對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的組胺致敏作用，破壞血眼屏障，增加血管的通透性，而且PTX在體內(nèi)具有強(qiáng)烈促白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)增多和增強(qiáng)T細(xì)胞的Thl反應(yīng)作用(Invest Ophthalmol Vis Sci, 1999，40:2898 - 2905);然而，PTX 也對(duì)趨化因子和粘附分子具有抑制作用，可抑制效應(yīng)淋巴細(xì)胞向靶組織的遷移和炎性細(xì)胞的招募，從而抑制EAU 的誘導(dǎo)(J Immunol.2001; 167 (I):250-6.)0因此，PTX在EAU的作用是抑制作用和促進(jìn)作用是綜合作用是結(jié)果，其作為輔助佐劑時(shí)，不僅需要優(yōu)化使用劑量，而且嚴(yán)格的限定時(shí)間。 此外，PTX的體內(nèi)研究表明，可增加IgE和IgGl的分泌，改變T細(xì)胞、B細(xì)胞的分布。微量的 PTX即可產(chǎn)生強(qiáng)烈的生物學(xué)效應(yīng)，而且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，如致組胺的超敏狀態(tài)甚至可延續(xù)至84 天(Infect Immun.1981 Sep; 33 (3):820-6.)?總之，由于PTX生物活性的多向性，其對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的影響廣泛而持久，PTX作為佐劑增強(qiáng)EAU的作用是多種生物效應(yīng)綜合作用的結(jié)果，因此以PTX作為輔助佐劑，可能對(duì)EAU本身的自身免疫反應(yīng)機(jī)制造成干擾和扭曲，不利于對(duì)EAU的病因?qū)W和致病機(jī)制以及資料的研究。
[0005]濰坊眼科醫(yī)院滿輝等(國(guó)際眼科雜志；2013 ；13(1):34_37)在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis, EAU模型中,觀察葡萄膜炎病變中炎癥細(xì)胞凋亡的發(fā)生，研究大鼠虹膜組織中炎癥細(xì)胞腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)的表達(dá)與炎癥細(xì)胞凋亡的關(guān)系，探討RAIL凋亡途徑可能參與炎癥細(xì)胞的凋亡。方法:以I mg/kg內(nèi)毒素注射于大鼠后足墊建立EIU模型，分別于注射后不同時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠眼內(nèi)的炎癥反應(yīng)。吸取房水觀察細(xì)胞數(shù)。摘取眼球，行HE (hematoxylin eosin)染色觀察大鼠虹膜組織的病理改變；TUNEL (terminal deoxynucIeotidyl transferase mediated dUTP nick-endlabeling)法檢測(cè)炎癥細(xì)胞凋亡情況；同時(shí)運(yùn)用SABC法檢測(cè)在內(nèi)毒素誘導(dǎo)后的不同時(shí)間TRAIL在炎癥細(xì)胞上的表達(dá)，并行圖像分析。結(jié)果:內(nèi)毒素注射6h開始山現(xiàn)炎癥，以后炎癥加重，于18-24h達(dá)到炎癥高峰，48h炎癥明顯消退。房水中的細(xì)胞數(shù)也在24h組達(dá)到最多。HE染色顯示:內(nèi)毒素注射后6h，即出現(xiàn)炎癥細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目在24h組最多，多數(shù)為多形核中性粒細(xì)胞，少數(shù)為單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，48h組炎癥細(xì)胞幾乎消失。TUNEL染色顯示:在內(nèi)毒素注射后6h組即有炎癥細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性著色，24h組凋亡數(shù)達(dá)到最多。免疫組化顯示=TRAIL蛋白在大鼠的虹膜色素上皮層呈弱陽(yáng)性著色；TRAIL在炎癥細(xì)胞上呈陽(yáng)性著色，24h組在炎癥細(xì)胞中的著色數(shù)量及著色強(qiáng)度達(dá)到最高。結(jié)論:以I mg/kg的內(nèi)毒素注射于SD大鼠后足墊可誘導(dǎo)出葡萄膜炎反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在24h組最為強(qiáng)烈。炎癥細(xì)胞凋亡可能是EIU炎癥迅速消退的原因之一。TRAIL可能參與了炎癥細(xì)胞的凋亡。
[0006]首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院眼科許邦麗等(眼科新進(jìn)展:2012 ；32(4):310-313)觀察小鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎(endotoxin-1nduced uveitis)模型中Toll受體-4 (Toll-like receptor 4, TLR-4)、髓樣分化因子 88 (myeloid differentiationfactor 88，MyD88)、CD163的共表達(dá)。方法:6_8周齡雄性C3H/HeN(野生型)小鼠25只，C3H/HeJ(TLR-4基因缺陷型)小鼠5只，分別腹腔注射霍亂弧菌內(nèi)毒素細(xì)胞壁脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)急性前葡萄膜炎動(dòng)物模型，處死小鼠后虹膜、睫狀體鋪片，用免疫熒光二標(biāo)記的方法檢測(cè)虹膜、睫狀體組織內(nèi)不同時(shí)間⑶163、TLR-4、MyD88的表達(dá)，用對(duì)虹膜內(nèi)CD163、TLR- 4和MyD88陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。結(jié)果:C3H/HeN小鼠LPS注射后12h結(jié)膜囊內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，24-48h達(dá)到高峰，72h炎癥逐漸消退，而C3H/HeJ小鼠LPS注射后沒有發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)。在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的C3H/HeJ小鼠虹膜中未檢測(cè)到CD163、TLR-4和MyD88陽(yáng)性細(xì)胞。C3H/HeN小鼠腹腔注射LPS后在虹膜鋪片內(nèi)Oh未見CD163、TLR-4與MyD88陽(yáng)性表達(dá)，12h后可見陽(yáng)性細(xì)胞(40.3±8.9,45.2±6.3,42.5±4.I)，24h陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(121.0±39.5、138.6±28.3、125.5±36.1)較12h明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P〈0.05) ；48h 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(132.3±54.5、129.9±36.2、122.1±29.3)與 24h 相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05) ;72h陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(12.8±3.2,10.4±5.6,9.3±5.2)較48h減少，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P〈0.01)。結(jié)論:小鼠EIU模型中，LPS激活了⑶163標(biāo)記的巨噬細(xì)胞膜表面的TLR-4，TLR-4與MyD88途徑可能是EIU主要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
[0007]首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院眼科王婧等(眼科；2011 ；20 (4) =262-266)觀察野生型C3H/HeN小鼠和Toll樣受體4(TLR4)基因缺陷型C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在脂多糖(LPS)刺激下激活狀態(tài)的差異，從體外途徑探討TLR4傳導(dǎo)信號(hào)在前葡萄膜炎發(fā)病中的可能作用機(jī)制。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究。研究對(duì)象健康成年C3H/He和C3H/HeJ小鼠。方法:常規(guī)提取兩種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)，按處理因素不同隨機(jī)分六組:C3H/HeN小鼠LPS組、 正常對(duì)照組、抗TLR4單克隆抗體加LPS組、抗TLR4單克隆抗體組；C3H/HeJ小鼠LPS組、 正常對(duì)照組。各組在不同處理后lh、3h、6h、12h、24h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過(guò)免疫熒光組織化學(xué)染色進(jìn)行觀察。主要指標(biāo)TLR4傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵分子TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、核因子-K B (NF-k B)免疫熒光強(qiáng)度及表達(dá)位置差異。結(jié)果:所有組TLR4均表達(dá)于細(xì)胞膜，MyD88 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。C3H/HeN小鼠LPS組和C3H/HeJ小鼠LPS組TLR4熒光強(qiáng)度比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；余各組織TLR4熒光強(qiáng)度兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C3H/HeN小鼠腹腔巨噬胞LPS組隨LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，各觀察時(shí)間點(diǎn)MyD88熒光強(qiáng)度逐漸減弱，總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；余各組各時(shí)間點(diǎn)MyD88熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。C3H/HeN小鼠正常對(duì)照組、 抗TLR4單克隆抗體組，C3H/HeJ小鼠正常對(duì)照組腹腔巨噬細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)NF- k B均表達(dá)于胞質(zhì)，C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞LPS刺激Ih后NF-k B表達(dá)于胞核，3h依舊表達(dá)于胞核，此后無(wú)法檢測(cè)到NF- K B表達(dá)。C3H/HeN小鼠抗TLR4單克隆抗體加LPS組、C3H/HeJ小鼠LPS 組巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激Ih后NF- K B轉(zhuǎn)移至胞膜，直至24h —直表達(dá)于胞膜。結(jié)論:腹腔巨噬細(xì)胞TLR4傳導(dǎo)途徑中核因子的轉(zhuǎn)位可能與前葡萄膜炎的發(fā)病有關(guān)，特異性阻斷途徑或許為如匍萄I吳炎的治療提供新思路。
[0008]安徽醫(yī)科大學(xué)中第二附屬醫(yī)院眼科詹邶等(安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào):2011 ；46(2): 138-141)探討白細(xì)胞介素(IL-23、IL-17)在實(shí)驗(yàn)性內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎(EIU)動(dòng)物模型眼部表達(dá)的特點(diǎn)。方法:SD大鼠隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照組、EIU模型組。傷寒內(nèi)毒素致敏誘導(dǎo)大鼠建立EIU模型，于建模后6、12、24、48、60 h用裂隙燈顯微鏡進(jìn)行眼前節(jié)檢查，并根據(jù)Hoekzema方法進(jìn)行眼部炎癥評(píng)分，RT-PCR法檢測(cè)大鼠眼部IL_23mRNA、IL-17mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:EIU組大鼠雙眼在免疫后6-48 h均可見眼部炎癥反應(yīng)，最高眼部炎癥評(píng)分為 (5.40±0.44)。與對(duì)照組相比，EIU組大鼠葡萄膜組織中IL-23 mRNA及IL-17 mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，眼部炎癥嚴(yán)重程度與IL-23mRNA 及IL-17mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論:IL_23 mRNA及IL-17 mRNA參與EIU發(fā)病過(guò)程。
[0009]首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院眼科陳巍等(中華眼科雜志:2010 ;46 (4): 355-361)探討在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的Wistar大鼠葡萄膜炎中Toll樣受體4(TLR4)陽(yáng)性細(xì)胞與虹膜組織中巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化和分布。方法:實(shí)驗(yàn)研究。Wistar大鼠50只，用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常對(duì)照(Oh)組、6h組；12h組、24h組及48h組。除Oh 組外其余各組均足墊墊部注射霍亂弧菌內(nèi)毒素200 y g，注射后于裂隙燈顯微鏡下觀察雙眼前節(jié)炎癥反應(yīng)變化。按實(shí)驗(yàn)分組于0.6、12、24、48h處死大鼠。取虹膜-睫狀體及脈絡(luò)膜組織。通過(guò)葡萄膜炎鋪片免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TLR4和巨噬細(xì)胞的標(biāo)記⑶163的表達(dá)。人工計(jì)數(shù)虹膜中TLR4+與CD163 +的細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞密度，計(jì)算圓形和多形性的CD163+細(xì)胞占所有⑶163+細(xì)胞的百分比。進(jìn)一步采用免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)TLR4和⑶163共表達(dá)的情況。通過(guò)單因素方差分析分別對(duì)大鼠虹膜內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞密度以及圓形、多形性⑶163+細(xì)胞的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。結(jié)果:正常大鼠虹膜睫狀體組織不表達(dá)TLR4。6h組有2只大鼠虹膜內(nèi)可見少量TLR4+細(xì)胞，12-48h組所有大鼠虹膜內(nèi)TLR4+細(xì)胞明顯增多(F=167.2， P〈0.001)，虹膜內(nèi) TLR4+細(xì)胞密度分別為(506.1 ±39.5)個(gè)/mm2(12h 組)、(492.3±54 .5) 個(gè) / mm2 (24h 組)及(663.8 土 50.2)個(gè) /mm2 (48h 組)。在注射 LPS 后 12_48h 期間 TLR4 +細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。0-48h組大鼠虹膜內(nèi)均有⑶163+細(xì)胞，Oh組圓形和多形性⑶163 +細(xì)胞百分比為13%，12-48h組其百分比約為80%，且圓形細(xì)胞主要位于虹膜基質(zhì)層。免疫熒光雙標(biāo)記可見TLR4和⑶163的共表達(dá)，TLR4位于細(xì)胞膜，⑶163位于細(xì)胞質(zhì)。5組大鼠脈絡(luò)膜內(nèi)均未見TLR4表達(dá)。結(jié)論:內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎中虹膜內(nèi)TLR4表達(dá)增高，部分虹膜固有巨噬細(xì)胞表達(dá)TLR4。TLR4可能在葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。
[0010]首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院眼科許穎知等(眼科新進(jìn)展；2010:30(4):308-312)通過(guò)分析內(nèi)毒素誘導(dǎo)的C3H/HeN小鼠的前葡萄膜炎模型中房水和血清中腫瘤壞死因子-a (tumor necrosis factor-α，TNF-α )、白細(xì)胞介素(interleukin)，IL-1、IL-6、IL-10、干擾素-Y (interfeixm-Y，IFN- y )的濃度，探討急性前葡萄膜炎可能的發(fā)病機(jī)制。方法:取180只C3H/Hen小鼠，分為對(duì)照組(n=30)和實(shí)驗(yàn)組(n=150)，將霍亂弧菌內(nèi)毒素(18001株，古典生物型，小川血清型)溶于無(wú)菌生理鹽水中，終濃度為2 X 103g/L，實(shí)驗(yàn)組小鼠足底注射IOOyL制作內(nèi)毒素誘導(dǎo)的前葡萄膜炎模型；對(duì)照組注射等量生理鹽水。于誘導(dǎo)后4h、8h、16h、24h、48h斷頸處死實(shí)驗(yàn)組小鼠(各30只)，以10只小鼠為一單樣本，微量進(jìn)樣器抽取前房水:眼球摘除后微量進(jìn)樣器于眼窩處取外周血。對(duì)照組于注射生理鹽水后即刻處死小鼠，樣本收集方法同實(shí)驗(yàn)組。微球流式技術(shù)檢測(cè)小鼠房水及血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IFN-y的濃度。結(jié)果:所有實(shí)驗(yàn)組小鼠均成功誘導(dǎo)出急性前葡萄膜炎。在小鼠房水中，TNF-α于4h達(dá)峰值，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002) ;4h、8h、16h及24h時(shí)，在房水和血清內(nèi)的濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。IL-l、IL-6在血清中均于16h達(dá)峰值，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P=0.001、0.000);且誘導(dǎo)后各時(shí)間點(diǎn)在房水內(nèi)的濃度均高于血清。IL-10在房水中于24h達(dá)峰值，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，與相同時(shí)間點(diǎn)血清內(nèi)的濃度相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。IFN- Y于4h、24h在房水和血清中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033、0.032)。各細(xì)胞因子在房水中的表達(dá)變化基本與炎癥進(jìn)程相符。結(jié)論:細(xì)胞因子在眼內(nèi)炎癥發(fā)生過(guò)程中起著重要作用，網(wǎng)絡(luò)調(diào)控將成為治療方向 。
[0011]Yadav UC 等(Invest Ophthalmol ViS SCI 2011 ；52(11):8076-85)報(bào)道醛糖還原酶缺乏對(duì)保護(hù)自身免疫性或內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎小鼠的保護(hù)作用。
Merida S等(Free Radic Res.2013; May 17)報(bào)道硫辛酸對(duì)脂多糖誘導(dǎo)葡萄膜炎的Thl細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥的作用是通過(guò)選擇性減少Thl細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子釋放實(shí)現(xiàn)的。
[0012]Mangano K 等(Br J Pharmacol.2008; 155 (5): 722-30)報(bào)道免疫調(diào)節(jié)劑，vgx-1027對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的Lewis大鼠葡萄膜炎的影響。
[0013]Miyazaki A等(Graefes Arch Clin Exp.0phthalmol.2008 ; 246(5):747-57)報(bào)道血管緊張素II I型受體拮抗劑對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎的抗炎作用。
[0014]海軍總醫(yī)院眼科秦力維等(國(guó)際眼科雜雜志；2012 ；12(10):1847-1850) 了解實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis, EAU)不同進(jìn)展階段小鼠T細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，對(duì)葡萄膜炎治療方案的優(yōu)化及療效評(píng)價(jià)提供指導(dǎo)方法:用CFA+PTX+IRBP對(duì)6-10周齡雌性C57BL/6小鼠后肢及尾部皮下進(jìn)行三點(diǎn)免疫建立EAU模型，于免疫3，7，14，21，28d取外周血行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果用特異性抗原IRBP免疫后，EAU疾病在第14d左右產(chǎn)生，在第21d達(dá)最高峰，以后開始逐漸緩解，隨著EAU疾病的發(fā)生，⑶4 +⑶25 +調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、⑶4 +⑶3 +輔助T細(xì)胞數(shù)量均有增加，⑶4 +⑶25 +調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加更為明顯，⑶4 +⑶25 + Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量第21d達(dá)到高峰，第28d開始下降，⑶4 +⑶25 + Foxp3 + / ⑶4 +⑶25 + FoXp3 +比值從第3d開始逐漸增加，到第21d達(dá)到高峰，從第28d開始下降。結(jié)論=EAU疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸與⑶4 +⑶25 + 7ToxpS + Treg細(xì)胞密切相關(guān)，⑶4 +⑶25 + 7ToxpS + Treg細(xì)胞為闡明EAU的緩解機(jī)制、預(yù)防和治療人類葡萄膜炎提供了新思路。
[0015]解放軍第一一七醫(yī)院眼科陳杰等(感染?炎癥?修復(fù)；2012 ；1:3(2):87-92)探討 FasL基因轉(zhuǎn)染的抗原特異性樹突狀細(xì)胞(DC)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)的抑制作用。方法:用攜帶FasL基因的腺病毒轉(zhuǎn)染DC和負(fù)載自體抗原一光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(IRBP) R16肽段的DC，制備FasL轉(zhuǎn)染的DC(FasL-DC)和抗原負(fù)載FasL-DC( “殺傷性〃DC)。檢測(cè)FasL基因在DC中的表達(dá)及其對(duì)DC存活、表型成熟和T細(xì)胞增殖的影響。 通過(guò)IRBP和完全弗氏佐劑皮下注射免疫，誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生EAU。在體外檢測(cè)抗原負(fù)載的FasL-DC及FasL中和抗體對(duì)誘導(dǎo)EAU小鼠的抗原致敏的和活化的致敏T細(xì)胞的增殖和凋亡作用。結(jié)果=FasL-DC可高效表達(dá)FasL ；FasL的表達(dá)既未誘導(dǎo)DC的凋亡，也不影響其表型成熟和刺激T細(xì)胞的功能；在體外抗原負(fù)載的FasL-DC對(duì)抗原致敏和活化的致敏T 細(xì)胞均有特異性殺傷作用，F(xiàn)asL中和抗體可阻斷對(duì)T細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)論:抗原負(fù)載的 FasL-DC對(duì)EAU的自身抗原特異性T細(xì)胞有明顯的殺傷作用，為EAU的臨床治療提供了新思路。
[0016]廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院眼科任亞琳等(國(guó)際眼科雜志；2012:12(7): 1242-1244)初步探討3 -arrestinl在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis, EAU)中的表達(dá)。方法:成功建立EAU動(dòng)物模型后,通過(guò)免疫組織化學(xué)和RT-PCR的方法檢測(cè)P-arrestinl在EAU小鼠脾臟細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果:免疫組織化學(xué)和RT-PCR均提示P -arrestinl在EAU小鼠脾臟細(xì)胞中的表達(dá)較正常小鼠增高結(jié)論: & -arrestinl可能在EAU的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
[0017]首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院/北京同仁眼科中心/北京市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳海婷等(中華眼科雜志:2012 ；48(3):234-240)探討實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)中影響抗原特異性CD4+輔助性T(Th) 17細(xì)胞分化的調(diào)控因素。方法:隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究。向小鼠背部及脅腹部多點(diǎn)皮下注射光受體視黃醇類結(jié)合蛋白(IRBP)制作EAU 模型，提取小鼠致敏14d的脾臟CD4 + T細(xì)胞，置于含有IRBP抗原的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入不同組合的調(diào)控細(xì)胞因子，分為8組:對(duì)照組、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)- 組、白細(xì)胞介素IL-6 組、IL-23 組、TGF-P +IL-6 組、TGF-P +IL-6+IL-23 組、IL-27 組和全反式維 A 酸(ATRA)組。 培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞與上清液，通過(guò)流式細(xì)胞儀與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)Thl7細(xì)胞的分化及細(xì)胞因子的水平。利用獨(dú)立樣本單因素t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果:流式細(xì)胞儀和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，TGF-和IL-6共同存在的條件下Thl7細(xì)胞的百分比由7.55% 升至13.08% (t=-2.842，P=0.048)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-17的濃度由50.66iig / L升至 164.121/1(七=-9.493，卩=0.009)，！11-細(xì)胞的百分比由 6.33% 降至 3.43% (t=_6.059， P=0.004)，調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞的百分比由 4.96% 降至 1.52% (t=5.683，P=0.005) ;IL-23 進(jìn)一步促進(jìn)了 TGF-P和IL-6誘導(dǎo)的Thl7細(xì)胞分化，與單純極化條件培養(yǎng)組相比，Thl7細(xì)胞的百分比由 7.55%升至 18.37% (t=-3.329，P=0.029)，Thl 細(xì)胞(t=7.410，P=0.002)、Th2 細(xì)胞(t=-3.863,P=0.018)百分比均明顯降低；而IL-27組Thl7細(xì)胞的百分比由7.55%降至
1.92% (t=4.425，P=0.041)，Thl 細(xì)胞百分比由 6.33%降至 0.63% (t=13.847，P=0.001)，而凋節(jié)性T細(xì)胞百分比由4.96%升至9.98% (t=-5.073，P=0.015) ,ATRA組Thl7細(xì)胞的百分比由7.55%降至4.06% (t=2.163，P=0.099)。結(jié)論:抗原特異性Thl7細(xì)胞的分化是不同于Thl和Th2細(xì)胞的獨(dú)立的分化過(guò)程，TGF-β、IL-6和IIL-23可誘導(dǎo)或促進(jìn)Thl7細(xì)胞的分化，而IL-27抑制其分化。
[0018]綜上所述，國(guó)內(nèi)外可見內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎的動(dòng)物模型分析及應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道，涉及醛糖還原酶缺乏對(duì)保護(hù)自身免疫性或內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎小鼠保護(hù)作用的研究；國(guó)內(nèi)外可見實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎或誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎的動(dòng)物模型分析及應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道，都未涉及用內(nèi)毒素聯(lián)合自身抗原誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎的小鼠模型的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]為了克服現(xiàn)有模型的不足，本發(fā)明提供了一種眼內(nèi)抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型及其建立方法。我們利用更為普遍的革蘭氏陰性菌的胞壁成分一內(nèi)毒素(endotoxin)也即脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)替代PTX在C57BL/6小鼠中成功誘導(dǎo)了 EAU，為葡萄膜炎的病因和發(fā)病機(jī)制研究提供了一個(gè)更符合自然發(fā)病環(huán)境的對(duì)照模型。
[0020]一種眼內(nèi)抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型的建立方法，利用眼部葡萄膜或視網(wǎng)膜抗原+弗氏完全佐劑免疫動(dòng)物后7-10天，足底注射內(nèi)毒素，誘發(fā)動(dòng)物自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎。
[0021]所述的動(dòng)物自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎的鑒定的過(guò)程如下:通過(guò)遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)、特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、組織病理?yè)p害和EAU評(píng)分進(jìn)行鑒定，并與LPS誘導(dǎo)的前葡萄膜炎、單用IRBP1-20+ CFA免疫和IRBP1-20+ CFA+PTX免疫誘導(dǎo)的EAU進(jìn)行比較。
[0022]所述的眼部葡萄膜或視網(wǎng)膜抗原來(lái)自于天然提純、基因工程重組、化學(xué)合成的蛋白或多肽。
為人或動(dòng)物光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白、視網(wǎng)膜可溶性抗原(S-Ag 或稱 arrestin)、Rhodopsin、Phosducin、Recoverin 等蛋白或多肽抗原的肽段。
[0024]所述的動(dòng)物為小鼠或大鼠。
[0025]所述的內(nèi)毒素來(lái)源于革蘭氏陰性菌。
[0026]所述的內(nèi)毒素為革蘭氏陰性菌的包壁成分。
[0027]所述的內(nèi)毒素為大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等革蘭氏陰性菌包壁成分。
[0028]一種所述的方法建立的葡萄膜視網(wǎng)膜抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型。
[0029]一種所述的葡萄膜視網(wǎng)膜抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型應(yīng)用于藥物治療、發(fā)病機(jī)制研究。
[0030]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明以大腸桿菌LPS作為輔助佐劑聯(lián)合視網(wǎng)膜多肽和CFA建立的EAU模型，可以更好的模擬人類“自然”發(fā)病環(huán)境，有利于排除PTX對(duì)EAU研究的干擾。另外，由于C57BL/6小鼠易于轉(zhuǎn)基因和基因敲除等操作，用C57BL/6小鼠建立的模型，有利于應(yīng)用基因修飾和基因缺陷技術(shù)來(lái)研究EAU的病因和機(jī)制。這一新型模型可以作為傳統(tǒng)模型的一個(gè)補(bǔ)充，在病因和致病機(jī)制研究上提供新思路?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1A為正常的虹膜睫狀體的病理切片圖，圖中虹膜睫狀體未見血管擴(kuò)張及炎性滲出(HE X 100倍)。
[0032]圖1B為正常對(duì)照組的視網(wǎng)膜的病理切片圖，圖中視網(wǎng)膜及玻璃體無(wú)炎性滲出(HE X 100 倍)。
[0033]圖2A為內(nèi)毒素注射后24小時(shí)虹膜睫狀體的病理切片圖，圖中虹膜睫狀體血管擴(kuò)張，睫狀體部可見蛋白及纖維素滲出(箭頭)X200倍)。
[0034]圖2B為內(nèi)毒素注射后24小時(shí)視網(wǎng)膜的病理切片圖，圖中視神經(jīng)乳頭附近及視網(wǎng)膜未見血管炎和玻璃體內(nèi)的炎性滲出(HE X 200倍)。
[0035]圖3A為IBRP多肽和CFA免疫的虹膜睫狀體的病理切片圖，圖中虹膜睫狀體未見血管擴(kuò)張及炎性滲出(HE X 100倍)。
[0036]圖3B為IBRP多肽和CFA免疫的視網(wǎng)膜的病理切片圖，圖中視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張，輕微血管周圍炎，神經(jīng)纖維層腫脹(箭頭)(HE X200倍)。
[0037]圖4A為免疫后7天注射內(nèi)毒素的虹膜睫狀體病理切片圖，圖中虹膜睫狀體未見血管擴(kuò)張及炎性滲出(HE X 100倍)。
[0038]圖4B為免疫后7天注射內(nèi)毒素視網(wǎng)膜的病理切片圖，圖中重度的顯著炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，明顯的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂、皺褶和脫離，光感受器細(xì)胞損傷，視網(wǎng)膜全層破壞、受損(HE X 200 倍)。
[0039]圖5A為免疫的同時(shí)注射PTX的視網(wǎng)膜的病理切片圖，圖中均可見重度的顯著炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，明顯的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂、皺褶和脫離，光感受器細(xì)胞損傷，視網(wǎng)膜全層破壞、 受損(HE X 200倍)。
[0040]圖5B為淋巴細(xì)胞過(guò)繼試驗(yàn)的EAU模型的視網(wǎng)膜病理切片圖，圖中可見重度的顯著炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，明顯的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂、皺褶和脫離，光感 受器細(xì)胞損傷，視網(wǎng)膜全層破壞、受損(HE X 200)。
[0041 ] 圖6為各處理組的EAU評(píng)分圖，圖中，LPS-EAU組的EAU評(píng)分顯著高于EAU組和EIU 組；EAU組小鼠僅顯示輕微病理改變；EIU組小鼠的眼后節(jié)未見葡萄膜視網(wǎng)膜炎的病理改變。
[0042]圖1為各組的DTH反應(yīng)的耳廓增厚圖，LPS-EAU小鼠和EAU小鼠的耳廓腫脹程度明顯高于EIU小鼠；LPS-EAU組和EAU組之間沒有顯著差別；EIU組和注射PBS的對(duì)照組均無(wú)明顯耳廓腫脹。
[0043]圖8 A為IRBP多肽刺激正常組小鼠脾淋巴細(xì)胞的克隆形成圖，圖中脾淋巴細(xì)未見明顯克隆形成。
[0044]圖8 B為IRBP多肽刺激EIU組小鼠脾淋巴細(xì)胞的克隆形成圖，圖中脾淋巴細(xì)未見明顯克隆形成。
[0045]圖8C為IRBP多肽刺激EAU組小鼠脾淋巴細(xì)胞的克隆形成圖，圖中脾細(xì)胞可見大量淋巴細(xì)胞克隆形成。
[0046]圖8D為IRBP多肽刺激LPS-EAU組小鼠脾淋巴細(xì)胞的克隆形成圖，圖中脾細(xì)胞可見大量淋巴細(xì)胞克隆形成。[0047]圖9為IRBP多肽刺激各組小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性增殖反應(yīng)圖，LPS-EAU組小鼠和EAU組的脾淋巴細(xì)胞增殖明顯高于EIU小鼠和正常對(duì)照組，LPS-EAU組和EAU組無(wú)顯著差另1J。
【具體實(shí)施方式】
[0048]以下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0049]1.材料
1)主要試劑弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant, CFA),脂多糖(E.coli0111:B4 lipopolysaccharide, LPS)和百日咳毒素(Pertussis toxin, PTX)均為 Sigma公司產(chǎn)品；光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(interphotoreceptor retinoid-bindingprotein)多肽片斷(GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD，IRBP 1-20)由上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?。3H脫氧胸苷(3H-TdR)為Amstrang公司產(chǎn)品；
2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組C57BL/6(H-2b)小鼠25只(購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，清潔級(jí)，雌性，年齡6?8周。按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組(control)、單純內(nèi)毒素注射組(EIU)、多肽+ CFA組(EAU)、多肽+ CFA + LPS組(LPS-EAU)、多肽+ CFA +PTX組，每組各5只。靜息飼養(yǎng)3天，以適應(yīng)環(huán)境。
[0050]實(shí)施例1LPS-EAU模型
(1)將500μ g IRBP1-20多肽與等體積的弗氏完全佐劑，充分研磨成乳劑，總體積為0.2ml，在雙后肢和尾根部多處皮下注射，免疫小鼠；
(2)以無(wú)菌、無(wú)熱源的生理鹽水溶解LPS至10mg/ml,在免疫后第7天，以30μ1LPS (300 μ g)足底注射； (3)在免疫后21天摘除眼球。新鮮摘除的眼球在4%戊二醛的磷酸鹽緩沖液中固定I小時(shí)，然后在10%甲醛的磷酸鹽緩沖液中固定過(guò)夜或固定至包埋。固定后組織進(jìn)行石蠟包埋，經(jīng)瞳孔-視盤軸作矢狀切面切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理改變，如圖4A、B所示。
[0051]實(shí)施例2 EIU模型
(1)以無(wú)菌、無(wú)熱源的生理鹽水溶解LPS至10mg/ml，足底注射40μI LPS (400 μ g)；
(2)注射內(nèi)毒素(LPS)24小時(shí)摘除眼球。新鮮摘除的眼球在4%戊二醛的磷酸鹽緩沖液中固定I小時(shí)，然后在10%甲醛的磷酸鹽緩沖液中固定過(guò)夜或固定至包埋。固定后組織進(jìn)行石蠟包埋，經(jīng)瞳孔-視盤軸作矢狀切面切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理改變，如圖2A、B所示，而正常對(duì)照如圖1A、B所示。
[0052]實(shí)施例3 EAU模型
(1)將SOOygIRBP1-20多肽與等體積的弗氏完全佐劑，充分研磨成乳劑，總體積為
0.2 ml，在雙后肢和尾根部多處皮下注射，免疫小鼠；
(2)在免疫后21天摘除眼球。新鮮摘除的眼球在4%戊二醛的磷酸鹽緩沖液中固定I小時(shí)，然后在10%甲醛的磷酸鹽緩沖液中固定過(guò)夜或固定至包埋。固定后組織進(jìn)行石蠟包埋，經(jīng)瞳孔-視盤軸作矢狀切面切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理改變，如圖3A、B所示，而正常對(duì)照如圖1A、B所示。
[0053]實(shí)施例4 PTX-EAU模型(I)將500ii g IRBP1-20多肽與等體積的弗氏完全佐劑，充分研磨成乳劑，總體積為0.2 ml，在雙后肢和尾根部多處皮下注射，免疫小鼠；
(2 )以含I %小鼠血清的PBS溶解PTX，取0.5 ii g，在免疫小鼠的同時(shí)腹腔內(nèi)注射。(3 ) 在免疫后21天摘除眼球。新鮮摘除的眼球在4%戊二醛的磷酸鹽緩沖液中固定I小時(shí)，然后在10%甲醛的磷酸鹽緩沖液中固定過(guò)夜或固定至包埋。固定后組織進(jìn)行石蠟包埋，經(jīng)瞳孔-視盤軸作矢狀切面切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理改變。如圖5A 所示。
[0054]實(shí)施例5淋巴細(xì)胞過(guò)繼試驗(yàn)EAU模型
(1)將500iig IRBP1-20多肽與等體積的弗氏完全佐劑，充分研磨成乳劑，總體積為0.2 ml，在雙后肢和尾根部多處皮下注射，免疫小鼠；
(2)以無(wú)菌、無(wú)熱源的生理鹽水溶解LPS至10mg/ml,在免疫后第7天，以30iil LPS (300 ug)足底注射；
(3)小鼠免疫后14天,處死小鼠，取淋巴結(jié)或脾臟淋巴細(xì)胞作為供體細(xì)胞,裂解紅細(xì)胞，過(guò)200目篩網(wǎng)獲取單個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌，懸浮于含有1%小鼠血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度。加入IRBP 1-20，終濃度為20iig/ml，培養(yǎng)72小時(shí)。去除貼壁細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞移至新培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，再次去除貼壁細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞移至新培養(yǎng)板， 培養(yǎng)48小時(shí)；
(4)收集細(xì)胞，PBS洗滌，重新懸浮細(xì)胞，以4-5XIO7細(xì)胞/小鼠，腹腔注射至受體小
鼠；
(5)細(xì)胞注射后14天，新鮮摘除的眼球在4%戊二醛的磷酸鹽緩沖液中固定I小時(shí)，然后在10%甲醛的磷酸鹽緩沖液中固定過(guò)夜或固定至包埋。固定后組織進(jìn)行石蠟包埋，經(jīng)瞳孔-視盤軸作矢狀切面切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察病理改變，如圖5B所
[0055]實(shí)施例6 EAU評(píng)分
Caspi組織病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。O分:無(wú)炎癥，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常；0.5分:炎性細(xì)胞輕度浸潤(rùn)視網(wǎng)膜，有或無(wú)感受器受損；1分:炎性細(xì)胞輕度浸潤(rùn)，視網(wǎng)膜折疊和點(diǎn)狀脫離；脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜可見個(gè)別肉芽腫和血管周圍炎；2分:輕到中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和(或)受損部位擴(kuò)展至外核層，視網(wǎng)膜折疊脫離，斑點(diǎn)狀光感受器細(xì)胞損傷；小到中等大小的肉芽腫，血管周圍炎，脈管炎；3分:中度到顯著炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，明顯的視網(wǎng)膜折疊和脫離，中等程度光感受器細(xì)胞損傷，中等程度的肉芽腫；4分:重度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和(或)視網(wǎng)膜全層破壞、受損，彌漫性視網(wǎng)膜脫離伴滲出，廣泛的光感受器細(xì)胞損傷，較大的肉芽腫。介于兩個(gè)等級(jí)之間的計(jì)0.5分，如圖6所示。
[0056]實(shí)施例7模型鑒定
1.遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)(DTH):各組小鼠處死前48小時(shí)，測(cè)量耳廓厚度，在一側(cè)耳廓皮內(nèi)分別注射IRBP 1-20 IOu I (IOiig);正常對(duì)照組小鼠注射等體積的PBS。48小時(shí)后再以螺旋測(cè)微器測(cè)量耳廓厚度。注射前后耳廓的厚度反映DTH的程度，如圖7所示；
2.特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng):處死小鼠，取脾臟，過(guò)200目篩網(wǎng)獲取單個(gè)細(xì)胞， Tris-NH4Cl裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌，懸浮于含有1%小鼠血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X105/0.2ml。加入IRBP 1-20，終濃度為20 y g/ml，培養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束前18小時(shí)加入3H脫氧胸苷(? TdR)，觀察克隆形成情況，各組結(jié)果如圖8A、8B、8C、8D所示，并檢測(cè)細(xì)胞3H TdR的摻 入值，檢測(cè)結(jié)果以cpm表示，如圖9所示。
【權(quán)利要求】
1.一種眼內(nèi)抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于，利用眼部葡萄膜或視網(wǎng)膜抗原+弗氏完全佐劑免疫動(dòng)物后7-10天，足底注射內(nèi)毒素，誘發(fā)動(dòng)物自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎。
2.如權(quán)利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的動(dòng)物自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎的鑒定的過(guò)程如下:通過(guò)遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)、特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、組織病理?yè)p害和EAU評(píng)分進(jìn)行鑒定，并與LPS誘導(dǎo)的前葡萄膜炎和單用IRBP1-20+ CFA免疫誘導(dǎo)的EAU進(jìn)行比較。
3.如權(quán)利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的眼部葡萄膜或視網(wǎng)膜抗原的來(lái)自于天然提純、基因工程重組、或者化學(xué)合成。
4.如權(quán)利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的視網(wǎng)膜抗原為人類光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白或者人類光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白的肽段。
5.如權(quán)利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的動(dòng)物為小鼠或大鼠。
6.如權(quán)利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述的內(nèi)毒素來(lái)源于革蘭氏陰性菌。
7.如權(quán)利要求6所述的建立方法，其特征在于，所述的內(nèi)毒素為蘭氏陰性菌的包壁成分。
8.如權(quán)利要求6所述的建立方法，其特征在于，所述的內(nèi)毒素為大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌。
9.一種如權(quán)利要求1所述的方法建立的葡萄膜視網(wǎng)膜抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型。
10.一種如權(quán)利要求9所述的葡萄膜視網(wǎng)膜抗原免疫聯(lián)合內(nèi)毒素誘導(dǎo)的動(dòng)物模型應(yīng)用于藥物治療、發(fā)病機(jī)制研究。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK103432577SQ201310318922
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月27日
【發(fā)明者】陳杰, 宋斗, 王金泉, 孫衛(wèi)民, 張意, 劉聰, 張超雄 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第一一七醫(yī)院