能夠更好地在醫(yī)療制品中檢測(cè)非內(nèi)毒素致熱污染物的改進(jìn)的單核細(xì)胞活化測(cè)試的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及能夠更好地在醫(yī)療制品中檢測(cè)非內(nèi)毒素致熱污染物的改進(jìn)的單核細(xì)胞活化測(cè)試。具體地，本發(fā)明描述了能夠在醫(yī)療制品中更好地檢測(cè)非內(nèi)毒素?zé)嵩母倪M(jìn)的單核細(xì)胞活化測(cè)試，其中樣品與含有單核細(xì)胞的試劑一起孵育在包含至少一個(gè)含有聚丙烯的表面的分析測(cè)試系統(tǒng)中。本發(fā)明還涉及了在這些測(cè)試中使用的分析系統(tǒng)，其包括至少一個(gè)微量滴定孔，所述孔具有至少一個(gè)含有聚丙烯的內(nèi)表面，其形狀使得含有單核細(xì)胞的試劑在孔中集中，以提供更多的細(xì)胞與細(xì)胞接觸。本發(fā)明還涉及可以用于檢測(cè)樣品中非內(nèi)毒素?zé)嵩嬖诘脑\斷試劑盒。
【專利說明】能夠更好地在醫(yī)療制品中檢測(cè)非內(nèi)毒素致熱污染物的改進(jìn)的單核細(xì)胞活化測(cè)試
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年12月20日、中國(guó)國(guó)家申請(qǐng)?zhí)枮?00680048872.9、發(fā)明名稱為“能夠更好地在醫(yī)療制品中檢測(cè)非內(nèi)毒素致熱污染物的改進(jìn)的單核細(xì)胞活化測(cè)試”申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]總的來說，本發(fā)明涉及能夠在醫(yī)療制品中更好地檢測(cè)非內(nèi)毒素?zé)嵩母倪M(jìn)的單核細(xì)胞活化測(cè)試，其中樣品與含有單核細(xì)胞的反應(yīng)試劑孵育在含有至少一個(gè)含聚丙烯的表面的分析系統(tǒng)中。本發(fā)明還涉及在這些測(cè)試中使用的分析系統(tǒng)，其包括至少一個(gè)微量滴定孔，所述孔具有至少一個(gè)含有聚丙烯的內(nèi)表面并且具有的形狀使得含有單核細(xì)胞的試劑在孔中集中，以提供更多的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞接觸。本發(fā)明還涉及可以用于檢測(cè)樣品中非內(nèi)毒素?zé)嵩拇嬖诘脑\斷試劑盒。
[0003]發(fā)明背景
[0004]當(dāng)某些化學(xué)或生物學(xué)化合物與人類或其它哺乳動(dòng)物的循環(huán)系統(tǒng)相接觸時(shí)，它們引起被稱為炎性反應(yīng)或炎癥的全身性反應(yīng)。炎性反應(yīng)是保護(hù)身體免于感染和/或傷害的防御性機(jī)制；炎癥增加了流向感染或受傷部位的血液，帶去幫助愈合過程的必需的流體、蛋白和白血細(xì)胞(白細(xì)胞)。例如，與炎性反應(yīng)有關(guān)的一種癥狀是體溫升高或發(fā)燒，它作為針對(duì)引起過熱的病原的防御機(jī)制起作用。炎性反應(yīng)可以與多種“流感樣”癥狀有關(guān)，包括發(fā)燒、寒戰(zhàn)、疲乏、頭痛、失去食欲和肌肉僵硬。引發(fā)發(fā)燒的化學(xué)或生物學(xué)化合物在歷史上被稱為“熱原”或“致熱”化合物，用于指這些化合物可以引起的發(fā)燒反應(yīng)。但是，某些化學(xué)的或生物學(xué)的化合物一般來說是促炎性的，并會(huì)或不會(huì)引起發(fā)燒作為它們引起的炎性反應(yīng)的一部分。
[0005]在某些情況下，根據(jù)個(gè)體的敏感性以及個(gè)體所暴露的熱原的類型和濃度，個(gè)體可能在暴露于熱原后發(fā)生威脅生命的類似休克的癥狀。可以被吸入、注射或輸注的醫(yī)療制品，以及醫(yī)療裝置例如膜或植入材料造成了熱原性的特別風(fēng)險(xiǎn)。即使是營(yíng)養(yǎng)品也可能表現(xiàn)出熱原性風(fēng)險(xiǎn)。在醫(yī)療制品和營(yíng)養(yǎng)品中包含的熱原被稱為外源性熱原；反之，內(nèi)源性熱原是免疫系統(tǒng)的信使化合物，介導(dǎo)個(gè)體對(duì)外源性熱原的炎性反應(yīng)。除了制品本身或它的生產(chǎn)中的副產(chǎn)物的致熱性質(zhì)之外，制品的污染通常也能引起熱原性。由制品的污染引起的熱原性可以由來自細(xì)菌、病毒、真菌、或甚至來自宿主的多種不同類型的熱原中的任何一種所引起。即使制品通過加熱或化學(xué)方法“滅菌”，這個(gè)問題仍然存在；通常遇到的致熱化合物細(xì)菌內(nèi)毒素(主要由來自革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖(LPS)構(gòu)成)，在細(xì)菌被殺死后可以存留。因此，對(duì)用于腸胃外使用的各種藥物、營(yíng)養(yǎng)品和醫(yī)療制品進(jìn)行熱原測(cè)試是必要的，以確保這些制品的安全性。
[0006]通常情況下，作為熱原的化合物起到熱原的作用是通過在與組織、細(xì)胞或體液接觸后，刺激單核細(xì)胞中的內(nèi)源性熱原、例如前列腺素和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。正是這些內(nèi)源性產(chǎn)生的熱原在受影響的生物體中介導(dǎo)了炎性反應(yīng)。這些內(nèi)源熱原中最重要和廣為人知的是細(xì)胞因子白介素-1 (IL-1)、白介素-6 (IL-6)、白介素-8 (IL-8)和腫瘤壞死因子(TNF)以及低分子量的脂類介質(zhì)前列腺素E2 (PGE2)。這些化合物通常通過ELISA或稱酶聯(lián)免疫吸附分析(用于IL-l、IL-6或TNF)和EIA或稱酶法免疫分析(用于PGE2)進(jìn)行分析。
[0007]為了避免任何腸胃外給藥的藥物或藥物制品的致熱反應(yīng)并確保它們的安全性，必須對(duì)致熱污染進(jìn)行監(jiān)控，以鑒定被細(xì)菌污染物污染的每個(gè)批次。目前常規(guī)用于監(jiān)測(cè)批量生產(chǎn)的藥物制品中的熱原污染有兩種基于動(dòng)物的藥典(Pharmacopial)方法，鱟阿米巴細(xì)胞裂解物測(cè)試(Limulus amebocyte lysate (LAL) test)、也被稱為細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試(BET),以及兔熱原測(cè)試。
[0008]兔測(cè)試是一種體內(nèi)測(cè)試，由給統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性數(shù)量的兔注射樣品化合物并觀察在試驗(yàn)動(dòng)物中引起的平均體溫升高而構(gòu)成。盡管兔測(cè)試對(duì)廣譜的致熱劑包括非內(nèi)毒素?zé)嵩哂蟹磻?yīng)性，但兔測(cè)試的靈敏度(ng內(nèi)毒素/ml)與其它熱原檢驗(yàn)(LAL檢驗(yàn)為pg內(nèi)毒素/ml)相比相對(duì)較低。此外，物種之間致熱反應(yīng)與化合物的相關(guān)性最多只是近似的。例如，已經(jīng)記錄到在物種之間引發(fā)致熱反應(yīng)的細(xì)菌內(nèi)毒素的劑量變化多達(dá)10，000倍。相對(duì)的不靈敏性、定量結(jié)果差、兔種類之間的易變性以及動(dòng)物試驗(yàn)所涉及的倫理問題，使得兔測(cè)試近年來遭到冷遇。
[0009]與檢測(cè)廣范圍熱原的兔測(cè)試相反，LAL測(cè)試僅檢測(cè)內(nèi)毒素?zé)嵩?。?xì)菌內(nèi)毒素，例如來自革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖(LPS)，是描述得最多的致熱化合物之一(Moltz等，Neurosc1.Biobehav.Rev., 1993, 17, 237-269 ；Tilders 等，Psychoneuroendocrinology.1994, 19, 209-232 ；Rothwell,Crit.Rev.Neurobiol1994, 8, 1-10 ；Zeisberger 和Roth, Neuropsychobio1qy, 1993, 28, 106-109)。因此認(rèn)為，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素用直接 LAL 測(cè)試代替昂貴和耗時(shí)的兔實(shí)驗(yàn)通常是有用的。這種方法具有明顯的限制。LAL測(cè)試是非常靈敏的體外測(cè)試；但是，它只能檢測(cè)來自革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素，并且對(duì)于某些仍然能夠刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生致熱細(xì)胞因子的制品給出了假陰性的結(jié)果。LAL測(cè)試還容易受到例如測(cè)試物質(zhì)的高蛋白水平或受到葡聚糖的干擾(Roslansky和Novitsky,.1.Clin.Microbiol..1991，29，2477 ；Fennrich 等，Dev.Biol.Stand.1999.101, 131)。另一方面，鱟測(cè)試太靈敏了，容易產(chǎn)生由于與產(chǎn)品質(zhì)量無關(guān)的雜質(zhì)而引起的假陽性結(jié)果(Fujiwara等，Yakugaku Zasshi, 1990, 110, 332-340)。
[0010]因此，存在著對(duì)具有高靈敏度、高特異性、并能夠檢測(cè)廣范圍的熱原的特點(diǎn)的不基于動(dòng)物的測(cè)試系統(tǒng)的需求。出于這種目的以及為了增進(jìn)對(duì)人類炎性反應(yīng)的了解，發(fā)展了基于人類單核細(xì)胞的體外活化的測(cè)試系統(tǒng)。大約20年前，研究人員使用外周血單核細(xì)胞(PBMC)通過監(jiān)測(cè)致熱細(xì)胞因子的釋放來檢測(cè)內(nèi)毒素(Dinarello等，T.Clin.Microbiol., 1984, 20, 323:Duff 和 Atkins.T.Tmmuno1.Methods, 1982, 52, 323)。從那以后，已經(jīng)發(fā)展了幾種不同的測(cè)試系統(tǒng)，使用不同來源的人類單核細(xì)胞，包括人類外周全血(WB)、PBMC、或單核細(xì)胞細(xì)胞系例如 M0N0MAC-6 (MM6) (Ziegler-Heitbrock 等，Int.T.Cancer.1988.41.456)或 THP-1 (Tsuchiva 等，Int.T.Cancer.1980.26.171),并使用不同的讀出結(jié)果，包括致熱細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α、TNF-α、IL-6, IL-1 β以及非致熱的代謝物新喋呤(Hartung 等，The Report and Recommendations of ECVAMWorkshop43, 2001, 29, 99 ；Poole 和 Gaines Das.Eur T Parenteral Sciences, 2001, 6, 63 ；Poole 等，T.1mmuno1.Methods, 2003, 274, 209 ；Gaines Das 等，T ImmunolMethods.2004, 288，165)。最近，在一項(xiàng)合作的歐洲研究Human (e)研究中，六種最突出的單核細(xì)胞活化測(cè)試，每種都使用了上述細(xì)胞來源和讀出結(jié)果的不同組合，評(píng)估了它們?cè)趽接胁煌瑵舛鹊募儍?nèi)毒素的醫(yī)療制品中檢測(cè)內(nèi)毒素的能力。
[0011]在這六種測(cè)試的五種中，細(xì)胞被培養(yǎng)在具有平底孔的96孔聚苯乙烯板中(Hoffmann 等，T.jjmmnoL.Methods, 2005, 298, 161)。在第六種測(cè)試中(基于 Fennrich 等，Dev.Biol.Stand., 1999 ;Fennrich 等，ALTEX, 1999 ;Hartung 等，2001),在大部分評(píng)估中使用具有錐形底的聚苯乙烯制成的Eppendorf離心管(1.2ml),在一部分研究中使用了具有圓形底的聚丙烯管(1.5ml)來代替在研究中使用的Endosafe'M本外熱原測(cè)試(IPT)試劑盒的制造商Charles River Laboratories的聚乙烯管。這種替代沒有被報(bào)道對(duì)測(cè)試具有任何顯著的影響，在那以后當(dāng)Charles River Laboratories為了減小體積修改了EndosafeKIPT后，聚丙烯管被平底的聚苯乙烯96孔板所代替。在該測(cè)試中單核細(xì)胞的來源是全血，讀出結(jié)果是IL-1 β。全血與摻有不同濃度內(nèi)毒素的各種藥物一起孵育。
[0012]Carlin和Viitanen公開了基于全血或M0N0MAC-6細(xì)胞作為單核細(xì)胞來源、IL-6作為讀出結(jié)果的單核細(xì)胞活化測(cè)試，用于評(píng)估疫苗Infanrix的內(nèi)在熱原性，該疫苗含有革蘭氏陽性和革蘭氏陰性抗原，包括各種非內(nèi)毒素?zé)嵩?、即白喉類毒素、百日咳類毒素和破傷風(fēng)類毒素(Pharmeurooa, 2003.15，3，418-423)。細(xì)胞以低細(xì)胞密度培養(yǎng)在無內(nèi)毒素的組成未公開的Eppendorf生物純級(jí)管中。疫苗的熱原性不是疫苗在生產(chǎn)或儲(chǔ)存過程中的污染的結(jié)果。Hartung和Wendel公開了基于全血作為單核細(xì)胞來源、IL-1 β作為優(yōu)選的讀出結(jié)果的單核細(xì)胞活化測(cè)試，用于檢測(cè)純態(tài)的內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩?，即來自馬流產(chǎn)沙門菌(Salmonella abortus equi)的LPS、來自鏈球菌致熱原(Streptococcuspyrogens)的鏈球菌溶血素 O (SL0)、以及胞壁酰二肽(MDP) (Hartung 和 Wendel, In VitroToxicology.1996，9，4，353-359 ;美國(guó)專利N0.5，891，728)。細(xì)胞被培養(yǎng)在聚丙烯管中。
[0013]Yamamoto等公開了基于全血或來自不同人類細(xì)胞系、優(yōu)選28SC細(xì)胞系的細(xì)胞作為單核細(xì)胞的來源、IL-6作為優(yōu)選的讀出結(jié)果的單核細(xì)胞活化測(cè)試，用于檢測(cè)內(nèi)毒素?zé)嵩? Ton.T.1nfect.Pis..2003, 56，93-100)。內(nèi)毒素測(cè)試據(jù)說預(yù)測(cè)了內(nèi)毒素和腸胃外藥物、特別是干擾素之間的體內(nèi)協(xié)同的可能性，使得藥物增加了內(nèi)毒素的致熱效應(yīng)。細(xì)胞與純態(tài)內(nèi)毒素或純態(tài)內(nèi)毒素與人類干擾素的混合物一起培養(yǎng)。細(xì)胞系的細(xì)胞被培養(yǎng)在具有平底孔的聚苯乙烯96孔板中。血細(xì)胞被培養(yǎng)沒有特定材料的管中。
[0014]Nakagawa等描述了基于全血或MM6-CA8細(xì)胞(M0N0MAC-6的亞克隆)作為單核細(xì)胞來源、IL-6作為優(yōu)選的讀出結(jié)果的單核細(xì)胞活化測(cè)試，用于檢測(cè)純態(tài)的內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩?，即來自大腸桿菌(E.coli) 055:B5的LPS和來自金黃色葡萄球菌(S.aureus)的不溶性妝聚糖(PG) (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunol..2002, 9, 3, 588-597)。MM6-CA8細(xì)胞培養(yǎng)在聚苯乙烯96孔板中。血細(xì)胞培養(yǎng)在聚丙烯管中；所用的體積(225yL血液，25 μ L測(cè)試溶液，750 μ L±k水)排除了標(biāo)準(zhǔn)96孔板(250 μ L/孔)的使用。
[0015]最近，多種不同的來源表明在熱原測(cè)試中應(yīng)該避免聚丙烯。例如，CharlesRiver Laboratories推薦避免聚丙烯，因?yàn)榫郾┍砻娴氖杷拘钥蓪?dǎo)致內(nèi)毒素由于與LPS的脂A成分有關(guān)的疏水性結(jié)構(gòu)域而吸附在這樣的表面上(Charles RiverLaboratories.Endosafe Times.Sept.2004)。生物安全測(cè)試的制造商 Harlan Sera-Lab 指出，聚丙烯管可以干擾LAL分析(Harlan Sera-Lab, 2004年目錄)。并且,歐洲透析和移植護(hù)士協(xié)會(huì)(the European Dialysis and Transplant Nurses Association)以及歐洲腎臟護(hù)理協(xié)會(huì)(the European Renal Care Association)推薦在內(nèi)毒素測(cè)試中避免聚丙烯而使用聚苯乙烯，因?yàn)榫郾揭蚁┮话悴晃絻?nèi)毒素(EDTNA/ERCA準(zhǔn)則)。
[0016]因此，對(duì)具有高靈敏度、高特異性、并能夠在醫(yī)療制品中檢測(cè)廣范圍的致熱性污染物的特點(diǎn)的不基于動(dòng)物的熱原測(cè)試，存在著需求。
[0017]發(fā)明簡(jiǎn)述
[0018]本 申請(qǐng)人:開發(fā)了靈敏的體外熱原測(cè)試，檢測(cè)醫(yī)療制品中存在的致熱性污染物。總的來說，本發(fā)明涉及在樣品中檢測(cè)非內(nèi)毒素?zé)嵩姆椒ǎㄟ^將單核細(xì)胞，即以含有單核細(xì)胞的試劑形式，與待測(cè)樣品在含有至少一個(gè)含有聚丙烯的表面的第一個(gè)分析系統(tǒng)中混合，使得單核細(xì)胞與表面相接觸。將單核細(xì)胞與樣品孵育，以便單核細(xì)胞在孵育過程中產(chǎn)生細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源介質(zhì)。將第一個(gè)分析系統(tǒng)的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到第二個(gè)分析系統(tǒng)中，該系統(tǒng)含有至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源介質(zhì)或標(biāo)記物的抗體處理過的表面。第二個(gè)分析系統(tǒng)分析與表面上的抗體結(jié)合的細(xì)胞因子或內(nèi)源介質(zhì)的存在。當(dāng)本方法中使用的單核細(xì)胞是PBMC或單核細(xì)胞系細(xì)胞時(shí)，單核細(xì)胞以高細(xì)胞密度存在于分析系統(tǒng)中。
[0019]總的來說，本發(fā)明還涉及了在腸胃外施用的醫(yī)療制品中檢測(cè)非內(nèi)毒素?zé)嵩姆椒?，通過將全血作為含有單核細(xì)胞的試劑與待測(cè)醫(yī)療制品在含有至少一個(gè)含聚丙烯的表面的第一個(gè)分析系統(tǒng)中混合，使得血液與表面相接觸。將血液與醫(yī)療制品孵育，使得血液在孵育過程中產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6。將第一個(gè)分析系統(tǒng)的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到第二個(gè)分析系統(tǒng)中，該系統(tǒng)含有至少一個(gè)用針對(duì)IL-6的抗體處理過的表面。第二個(gè)分析系統(tǒng)分析與表面上的抗體結(jié)合的IL-6的存在。
[0020]本發(fā)明進(jìn)一步涉及即以含有單核細(xì)胞的試劑形式培養(yǎng)單核細(xì)胞的方法，用于非內(nèi)毒素?zé)嵩瓬y(cè)試，在該測(cè)試中通過將單核細(xì)胞與待測(cè)樣品在含有至少一個(gè)含有聚丙烯的表面的分析系統(tǒng)中混合，來使單核細(xì)胞與表面相接觸。
[0021]本發(fā)明還涉及培養(yǎng)單核細(xì)胞作為非內(nèi)毒素?zé)嵩瓬y(cè)試的一部分的方法，在該測(cè)試中將單核細(xì)胞與樣品在含有至少一個(gè)微量滴定孔的分析系統(tǒng)中混合，該孔的形狀使得與平底微量滴定孔相比，含有單核細(xì)胞的試劑被集中，孔的表面含有聚丙烯，使得單核細(xì)胞與表面相接觸。當(dāng)在這些培養(yǎng)方法中使用的單核細(xì)胞是外周血單核細(xì)胞(PBMC)或單核細(xì)胞系細(xì)胞時(shí)，單核細(xì)胞以高細(xì)胞密度存在于分析系統(tǒng)中。
[0022]本發(fā)明還涉及了在腸胃外施用的醫(yī)療制品中檢測(cè)非內(nèi)毒素?zé)嵩姆椒?，通過將作為含有單核細(xì)胞試劑的全血與待測(cè)醫(yī)療制品在分析系統(tǒng)中混合，該系統(tǒng)含有至少一個(gè)含聚丙烯的表面和至少一個(gè)用針對(duì)IL-6的抗體處理過的表面，使得血液與含有聚丙烯的表面相接觸，并分析該分析系統(tǒng)中與表面上的抗體結(jié)合的IL-6的存在。
[0023]本發(fā)明還提供了含有微量滴定板的診斷試劑盒，該板含有多個(gè)微量滴定孔，孔的形狀使得與平底的微量滴定孔相比，每個(gè)孔中含有的培養(yǎng)基被集中，每個(gè)孔的表面含有聚丙烯，在微量滴定板的孔中含有低溫保存的單核細(xì)胞，即以含有低溫保存的單核細(xì)胞的試劑的形式，使得單核細(xì)胞與孔的表面相接觸。當(dāng)試劑盒中的單核細(xì)胞是外周血單核細(xì)胞(PBMC)或單核細(xì)胞系細(xì)胞時(shí)，單核細(xì)胞以高細(xì)胞密度存在于孔中。
[0024]本發(fā)明還提供了一種診斷試劑盒，含有用于在腸胃外施用的醫(yī)療制品中檢測(cè)非內(nèi)毒素?zé)嵩姆治鱿到y(tǒng)，該分析系統(tǒng)含有微量滴定板，該板含有多個(gè)微量滴定孔，孔的形狀使得與平底的微量滴定孔相比，每個(gè)孔中含有的培養(yǎng)基集中；含有聚丙烯的每個(gè)孔的表面；在微量滴定板的孔中含有的低溫保存的全血，作為含低溫保存的單核細(xì)胞的試劑，以便血液與孔的表面相接觸；和針對(duì)IL-6的抗體。
[0025]本發(fā)明的其它目標(biāo)和特點(diǎn)在后文中將部分變得明顯并部分被指出。
[0026]附圖簡(jiǎn)述
[0027]圖1是描述在在具有圓底孔的聚丙烯板上使用外周血單核細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有4種不同的細(xì)胞密度(I百萬、50萬、25萬和13萬個(gè)PBMC/250 μ I孔)的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖，IL-6作為讀出結(jié)果。IL-6反應(yīng)是針對(duì)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(I個(gè)內(nèi)毒素單位/ml)和Extraneal ?陽性對(duì)照(即被非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜脑撝破返呐?。
[0028]圖2是說明在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用全血進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中IL-6對(duì)具有低細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS、Extraneal ?陰性對(duì)照(即該制品的干凈的批次)、Extraneal.陽性對(duì)照、血紅蛋白(Hb)陰性對(duì)照(即該制品的干凈的批次)和血紅蛋白(Hb)陽性對(duì)照(即被非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜脑撝破返呐?。
[0029]圖3是說明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用外周血單核細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有低細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS、Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照以及Hb陽性和陰性對(duì)照。
[0030]圖4是說明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用M0N0MAC6細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有低細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS、Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照以及Hb陽性和陰性對(duì)照。
[0031]圖5是說明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用THP-1細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有低細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS、Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照以及Hb陽性和陰性對(duì)照。
[0032]圖6是說明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用THP-12A9細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，TNF-α對(duì)具有低細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。TNF-α反應(yīng)是針對(duì)LPS、Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照以及Hb陽性和陰性對(duì)照。
[0033]圖7是說明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用M0N0MAC6-CA8克隆細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有低細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS以及Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照。
[0034]圖8是說明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用28SC細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有低細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS以及葡聚糖陽性和陰性對(duì)照。
[0035]圖9是描繪了在具有圓底孔的聚丙烯板上使用外周血單核細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有高細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS、Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照以及葡聚糖陽性和陰性對(duì)照。
[0036]圖10是描繪了在具有圓底孔的聚丙烯板上使用全血進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有低細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS以及Extraneal 日性和陰性對(duì)照。
[0037]圖1lA是描繪了在使用外周血單核細(xì)胞(每孔I百萬個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)聚丙烯板(黑色柱)和聚苯乙烯板(灰色柱)的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS、Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照以及Hb陽性和陰性對(duì)照。
[0038]圖1lB是描繪了在使用外周血單核細(xì)胞(每孔I百萬個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-Ιβ對(duì)聚丙烯板(黑色柱)和聚苯乙烯板(灰色柱)的反應(yīng)的圖。IL-Ιβ反應(yīng)是針對(duì)LPS、Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照以及Hb陽性和陰性對(duì)照。
[0039]圖12A是說明了在具有圓底孔的聚丙烯板上使用外周血單核細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，TL-6對(duì)具有高細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS以及ExtraneaI ?「日丨生和陰性對(duì)照。
[0040]圖12B是說明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用外周血單核細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有低細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS以及Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照。
[0041]圖13A是說明了在具有圓底孔的聚丙烯板上使用外周血單核細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有高細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS以及Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照。
[0042]圖13B是說明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用外周血單核細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有高細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS以及Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照。
[0043]圖14A是說明了在具有圓底孔的聚丙烯板上使用外周血單核細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有高細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS以及Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照。
[0044]圖14B是說明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用外周血單核細(xì)胞進(jìn)行的單核細(xì)胞活化測(cè)試中，IL-6對(duì)具有高細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-6反應(yīng)是針對(duì)LPS以及Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照。
[0045]圖15是說明了在具有平底孔的聚苯乙烯板上使用全血進(jìn)行的商業(yè)化的IPT測(cè)試中，IL-1 β對(duì)具有高細(xì)胞密度的測(cè)試樣品的反應(yīng)的圖。IL-1 β反應(yīng)是針對(duì)LPS、Extraneal ?陽性和陰性對(duì)照、血紅蛋白陽性和陰性對(duì)照、鹽水對(duì)照以及革蘭氏陽性對(duì)照。
[0046]發(fā)明詳述
[0047]熱原刺激血液?jiǎn)魏思?xì)胞(以及其它的白細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和釋放大量的炎性反應(yīng)的內(nèi)源致熱性介質(zhì)，包括細(xì)胞因子(例如TNF-α、IL-1 β和IL_6)。這些致熱性介質(zhì)被釋放到循環(huán)中，引發(fā)了級(jí)聯(lián)事件，導(dǎo)致在受到影響的個(gè)體中發(fā)生炎性反應(yīng)。本發(fā)明的單核細(xì)胞活化測(cè)試依賴于測(cè)量這些內(nèi)源性熱原作為炎性反應(yīng)標(biāo)記物。按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，將樣品與含有單核細(xì)胞的試劑在含有包含聚丙烯的表面的第一個(gè)分析系統(tǒng)中孵育，在分析系統(tǒng)中含有單核細(xì)胞的試劑以高細(xì)胞密度存在。然后將第一個(gè)分析系統(tǒng)的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到第二個(gè)分析系統(tǒng)中，該系統(tǒng)含有用抗細(xì)胞因子抗體包被的表面，第二個(gè)分析系統(tǒng)分析被抗體結(jié)合到表面上的細(xì)胞因子的存在。
[0048]本發(fā)明的熱原測(cè)試被用于檢測(cè)非內(nèi)毒素?zé)嵩?，即革蘭氏陽性細(xì)菌(例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))或它們的組分(例如胞壁肽、脂胞壁酸、腸毒素、鏈球菌溶血素)、免疫刺激劑例如植物血凝素或佛波醇酯(phorbolesteras),以及內(nèi)毒素。因?yàn)闇y(cè)試?yán)昧藛魏思?xì)胞對(duì)各種不同熱原的細(xì)胞因子反應(yīng)而不是特異性針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)，因此使用本發(fā)明的測(cè)試可以檢測(cè)廣譜的致熱劑。[0049]本發(fā)明的熱原測(cè)試已經(jīng)顯示出與常規(guī)測(cè)試相比，更有效地檢測(cè)醫(yī)療制品的污染批次中的非內(nèi)毒素?zé)嵩?。本文的例子顯示出這些常規(guī)的測(cè)試不能將Extraneal ?腹膜透析溶液、血紅蛋白或葡聚糖的陽性對(duì)照樣品與同樣的腸胃外物質(zhì)的陰性對(duì)照樣品區(qū)分開來。Extraneal ?陽性對(duì)照樣品從被非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜漠a(chǎn)品批次中獲得；被污染的批次在人類中引起了不良反應(yīng)，但是按照只檢測(cè)內(nèi)毒素?zé)嵩腖AL測(cè)試卻被檢測(cè)為熱原存在為陰性(Martis等，Lancet.365 (9459)，588)。血紅蛋白陽性對(duì)照也是從被非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜漠a(chǎn)品批次中獲得；被污染的批次在兔中引起了發(fā)熱反應(yīng)，但是按照LAL測(cè)試被檢測(cè)為熱原存在為陰性。葡聚糖陽性對(duì)照是已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在人類中引起發(fā)燒的葡聚糖制品，但是按照LAL測(cè)試被檢測(cè)為熱原存在為陰性。測(cè)試方法檢測(cè)醫(yī)療制品中非內(nèi)毒素污染物的能力是非常有價(jià)值的，因?yàn)樗軌蛟卺t(yī)療產(chǎn)品批次被發(fā)放用于患者之前鑒定被污染的產(chǎn)品批次。已知的測(cè)試在檢測(cè)純的非內(nèi)毒素和內(nèi)毒素?zé)嵩⒓丛谏厦嬗懻撨^的Nakagawa等公開的來自金黃色葡萄球菌的肽聚糖(PG)和來自大腸桿菌的LPS，或者在檢測(cè)混有內(nèi)毒素的產(chǎn)品、即在上面討論過的Human(e)研究的6種測(cè)試中摻有不同不同濃度內(nèi)毒素的各種藥物的情況下，都很好地發(fā)揮作用。假如醫(yī)療制品被內(nèi)毒素污染，LAL測(cè)試能夠有效地起作用(Mascoli, CC, Weary, Μ.Ε., T Parenter Drug Assoc.2003, 33, 81 ；Mascoli, CC, Weary, M.E.,Prog Clin Biol Res.2003, 29，387)。但是，當(dāng)醫(yī)療制品被非內(nèi)毒素?zé)嵩廴緯r(shí)，這些測(cè)試不能檢測(cè)到熱原。不受特定理論的束縛，據(jù)信非內(nèi)毒素?zé)嵩c醫(yī)療制品相互作用，導(dǎo)致了對(duì)熱原的“屏蔽”，并且不能檢測(cè)非內(nèi)毒素污染物。
[0050]本發(fā)明的熱原測(cè)試克服了這種屏蔽效應(yīng)，能夠檢測(cè)醫(yī)療制品中的非內(nèi)毒素污染物:例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，PBMC以高細(xì)胞密度被培養(yǎng)在圓底的聚丙烯孔中，本發(fā)明的熱原測(cè)試能夠區(qū)分Extraneal ?溶液和葡聚糖的陽性和陰性對(duì)照樣品(參見圖9)。進(jìn)行測(cè)試的現(xiàn)有試劑盒都不能區(qū)分Extraneal⑧或血紅蛋白的陽性和陰性對(duì)照(參見圖1_8)。再一次不受特定理論的束縛，據(jù)信高細(xì)胞密度提供了更多的細(xì)胞進(jìn)行更強(qiáng)的細(xì)胞與細(xì)胞的接觸。細(xì)胞與細(xì)胞的接觸增加促進(jìn)了細(xì)胞之間更多的通訊，從而導(dǎo)致了針對(duì)致熱污染物的炎性反應(yīng)增強(qiáng)。細(xì)胞彼此之間通過可溶性介質(zhì)例如細(xì)胞因子和通過細(xì)胞與細(xì)胞的接觸來進(jìn)行通訊，其中細(xì)胞因子也可以參與。圓底的孔、或總的來說其形狀使得細(xì)胞集中的孔，與平底的孔相比，提供了更多的細(xì)胞與細(xì)胞的接觸。并且，據(jù)信聚丙烯增加了非內(nèi)毒素?zé)嵩纳锢枚?。再一次不受特定理論的束縛，據(jù)信聚苯乙烯板按常規(guī)用于細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行表面處理使得它們的表面具有較低的疏水性，能夠更好地結(jié)合細(xì)胞，但是也使它們的表面結(jié)合和中和非內(nèi)毒素?zé)嵩?。聚丙烯板沒有進(jìn)行表面處理，因此它比聚苯乙烯板保留了更多的疏水性，并且中和非內(nèi)毒素?zé)嵩目赡苄越档土恕?br> [0051]1、熱原測(cè)試的成分
[0052]其特征為上面描述的三個(gè)要素:高細(xì)胞密度、圓底(或者不同的適當(dāng)形狀)和聚丙烯的某種組合的熱原測(cè)試，即PBMC以高細(xì)胞密度存在于圓底聚丙烯孔中，這使得改進(jìn)了對(duì)醫(yī)療制品中非內(nèi)毒素污染的檢測(cè)。本發(fā)明的熱原測(cè)試可以被用于測(cè)試各種不同醫(yī)療制品中非內(nèi)毒素污染的存在，包括血液制品、用于腸胃外施用的醫(yī)療制品、透析液、疫苗、靜脈內(nèi)溶液以及與身體或體液接觸的任何液體。
[0053]A、細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)
[0054]由含有單核細(xì)胞的試劑分泌的任何可以被檢測(cè)的炎性反應(yīng)內(nèi)源性介質(zhì)都可以用作本發(fā)明的熱原測(cè)試的基礎(chǔ)。但是，優(yōu)選使用細(xì)胞因子或內(nèi)皮素標(biāo)記物，因?yàn)樗鼈円子诒槐景l(fā)明的方法所檢測(cè)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)全血中的單核細(xì)胞與內(nèi)毒素或非內(nèi)毒素?zé)嵩跤a(chǎn)生了幾類細(xì)胞因子，包括但不限于促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL_6)、抗炎細(xì)胞因子(IL_4、IL-10、IL-13、IL-lra、TGF)、Thl (IL-2、IFN、IL_12)、Th2 (IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13)、IL-Ιβ、IL-lra、IL-8和PGE2。用于本發(fā)明的優(yōu)選的細(xì)胞因子標(biāo)記物包括TNF-a、IL-1 β、IL-lra、IL-6、IL-8和PGE2。IL-6是本發(fā)明的分析中特別優(yōu)選的細(xì)胞因子標(biāo)記物。IL-6在相對(duì)短的孵育時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生可檢測(cè)的量。免疫反應(yīng)性IL-6，與免疫反應(yīng)性IL-1 β和TNF-α不同，以大量完全分泌到細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基/血液中，允許了它的完全評(píng)估。相反，免疫反應(yīng)性TNF-α和IL-1 β主要保留在細(xì)胞內(nèi)，增加了這樣的可能性，即影響細(xì)胞通透性的測(cè)試制劑可能更容易干擾以(免疫反應(yīng)性的)TNF-α或IL-Ιβ作為讀出結(jié)果而不是IL_6的測(cè)試(參見圖2和3)。然而，TNF-α或IL_1 β也可以在本發(fā)明中用作細(xì)胞因子標(biāo)記物。在單核細(xì)胞熱原反應(yīng)中，TNF-α比IL-6更早產(chǎn)生。因此，分析TNF-α的本發(fā)明實(shí)施方案使用的孵育時(shí)間(大約I到2小時(shí))比分析IL-6的實(shí)施方案更短。不同的致熱污染物在細(xì)胞培養(yǎng)中可以引發(fā)不同的細(xì)胞因子反應(yīng)。因此，本發(fā)明可以被定制成當(dāng)藥物制品可能被引起特定細(xì)胞因子分泌的特定熱源污染時(shí)，檢測(cè)這些細(xì)胞因子的形成。
[0055]B、針對(duì)細(xì)胞因子或內(nèi)源性介質(zhì)的抗體
[0056]一旦確定了要分析的細(xì)胞因子，必須制造針對(duì)該細(xì)胞因子的抗體用于本發(fā)明。在嚴(yán)緊條件下純化的多克隆抗體，如在此以其全文引為參考的美國(guó)專利N0.6，696，261的實(shí)施例I中描述的那些，在熱原測(cè)試中可以很好地工作。因?yàn)榉蛛x多克隆抗體的動(dòng)物的血液是天然無熱原的(如果從健康動(dòng)物取得)，人們必須在純化過程中僅僅防止原材料被熱原污染，以獲得無熱原產(chǎn)品。無熱原的緩沖液和固定相被用于親和層析柱中，按照美國(guó)專利N0.6,696, 261的實(shí)施例1中描述獲得無熱原的多克隆抗體?；蛘?，可以使用來自雜交瘤培養(yǎng)物的單克隆抗體。但是當(dāng)使用單克隆抗體時(shí)，必須小心地將抗體與任何可能存在于雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中的污染熱原分離開。
[0057]為了用于本發(fā)明，針對(duì)細(xì)胞因子的抗體被施加到分析系統(tǒng)的表面上。方法，例如用于將抗體結(jié)合在分析系統(tǒng)表面例如微量滴定孔上的包被，在生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】中是眾所周知的。許多分析系統(tǒng)是可商購(gòu)的，并且制造商通常提供了用于將抗體包被到系統(tǒng)表面上的材料和說明。因?yàn)橐子谧x數(shù)以及需要的樣品體積少，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中使用了微量滴定板，其中孔的內(nèi)表面的一部分被抗體包被。為了完全利用本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)選微量滴定孔是微量滴定板的一部分，微量滴定板是類似的孔的平面陣列，其位置使得孔的陣列可以用自動(dòng)免疫分析讀板儀器讀數(shù)(參見，例如美國(guó)專利N0.5，281，540，在此引為參考)。自動(dòng)化的儀器例如ELISA讀板器(例如Ultramark Microplate Reader,可以從Bio-RadLaboratories, Inc.獲得),使分析評(píng)估過程自動(dòng)化,并極大地減少了每次測(cè)試的花費(fèi)。如果需要，微量滴定孔的板可以通過用無熱原緩沖液深度清洗使其無熱原(如果在被提供時(shí)不是無熱原的話)。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗IL-6多克隆抗體包被在ELISA板的孔上。但是，也可以接受其它免疫診斷測(cè)試形式(例如，其中抗體被包被在測(cè)量桿或珠子上)用于本發(fā)明。
[0058]除了 “捕獲”抗體之外，在制作用于本發(fā)明的微量滴定板系統(tǒng)時(shí)還可以使用其它用于分析細(xì)胞因子的抗體和試劑。例如，在對(duì)微量滴定板施加捕獲抗體之后，板的剩余的結(jié)合位點(diǎn)可以用另一種蛋白“封閉”。封閉之后，可以對(duì)微量滴定板施加標(biāo)記的檢測(cè)抗體(例如生物素化的或酶標(biāo)記的抗體)，連同保護(hù)性的上光化合物。因此，如下所述當(dāng)樣品在微量滴定孔中孵育時(shí)，在樣品孵育期間，釋放的細(xì)胞因子被結(jié)合在孔上的捕獲抗體所捕獲，并同時(shí)被檢測(cè)抗體所標(biāo)記。
[0059]C、含有單核細(xì)胞的試劑
[0060]作為本發(fā)明熱原測(cè)試的第一步，通過將含有單核細(xì)胞的試劑與待測(cè)樣品在分析系統(tǒng)中混合，來培養(yǎng)含有單核細(xì)胞的試劑中包含的細(xì)胞。本發(fā)明的含有單核細(xì)胞的試劑選自:PBMCs、單核細(xì)胞系細(xì)胞、全血、或表達(dá)或能夠被導(dǎo)致表達(dá)Toll樣受體(TLRs)的任何細(xì)胞系，包括其中這些受體已經(jīng)被誘導(dǎo)或克隆了的細(xì)胞，所述Toll樣受體參與介導(dǎo)針對(duì)促炎性和致熱劑的反應(yīng)。優(yōu)選，單核細(xì)胞系選自M0N0MAC-6(MM6)、THP-1和28SC。含有單核細(xì)胞的試劑中的單核細(xì)胞優(yōu)選來自將要施用待測(cè)產(chǎn)品的相同物種(即對(duì)于藥物制品來說為人類，對(duì)于獸醫(yī)制品來說為貓、狗、馬等)的單核細(xì)胞。但是，來自其它物種的具有所需的熱原反應(yīng)性的單核細(xì)胞也可以使用。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，含有單核細(xì)胞的反應(yīng)試劑含有PBMC。
[0061]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，含有單核細(xì)胞的試劑是全血，分析系統(tǒng)包括了至少一個(gè)含有聚丙烯的表面，使得含有單核細(xì)胞的反應(yīng)試劑與表面相接觸。
[0062]在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有單核細(xì)胞的試劑是存在高細(xì)胞密度的PBMC，分析系統(tǒng)包括了至少一個(gè)含有聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯或另一種類似的材料的表面，該表面與PBMC相接觸。
[0063]當(dāng)含有單核細(xì)胞的試劑是PBMC或細(xì)胞系細(xì)胞時(shí)，試劑以高細(xì)胞密度存在于分析系統(tǒng)中，以促進(jìn)更多的細(xì)胞與細(xì)胞接觸，正如上面詳細(xì)解釋的那樣。在某些實(shí)施方案中，含有單核細(xì)胞的試劑以每個(gè)孔至少大約125,000個(gè)細(xì)胞、至少大約250，000、500，000、600，000,700, 000、800，000,900, 000,1, 000，000,1, 100，000,1, 200，000,1, 300，000、
I,400，000、1，500，000、1，600，000、1，700，000、1，800，000、1，900，000 或 2，000，000 個(gè)細(xì)胞的每孔細(xì)胞密度存在于分析系統(tǒng)中。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到當(dāng)在孔中的試劑體積中存在的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物不足以適當(dāng)維持孔中的細(xì)胞時(shí)，最大細(xì)胞密度是過量的。
[0064]當(dāng)含有單核細(xì)胞的試劑是全血時(shí)，反應(yīng)試劑以比PBMC或細(xì)胞系細(xì)胞低的細(xì)胞密度存在于分析系統(tǒng)中。在含有單核細(xì)胞的試劑是血液的某些實(shí)施方案中，試劑以每個(gè)孔至少大約100, 000個(gè)外周血單核細(xì)胞、至少每孔大約200，000,210, 000,220, 000,230, 000、240，000,250, 000,260, 000,270, 000,280,000,290,000,300,000,310,000,320,000、330，000,340, 000,350, 000,360, 000,370, 000,380, 000,390, 000 或400，000 個(gè)PBMC 的細(xì)胞密度存在于分析系統(tǒng)中。不被具體的理論所束縛，據(jù)信全血可以使用比PBMC或細(xì)胞系細(xì)胞低的細(xì)胞密度，因?yàn)閱魏思?xì)胞是在它們的天然環(huán)境中，所有可以影響它們對(duì)熱原的反應(yīng)的血清成分都存在于溶液中。此外，當(dāng)含有單核細(xì)胞的試劑包含全血時(shí)，用于熱原測(cè)試的讀出結(jié)果是IL_6。
[0065]優(yōu)選當(dāng)血液被用作含有單核細(xì)胞的試劑時(shí)，血液是新鮮的或不超過24小時(shí)，更優(yōu)選不超過4小時(shí)。此外，當(dāng)使用全血時(shí)，可以包含抗凝劑以推遲或阻止凝血；適合的抗凝劑包括檸檬酸鹽(例如終濃度為0.38%)、肝素(肝素鈉)或法安明(fragmin)(低分子量肝素)?？鼓砑觿┛梢员皇褂枚挥绊憜魏思?xì)胞對(duì)測(cè)試樣品中的熱原的反應(yīng)。全血也可以用適當(dāng)?shù)木彌_液或其它稀釋劑例如RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基或生理鹽水進(jìn)行稀釋。全血優(yōu)選被稀釋到孵育的最終體積的至少50%、更優(yōu)選到大約5%到大約25%、并更優(yōu)選大約20% (參見美國(guó)專利N0.6，696，261的圖1)。通過稀釋全血，大部分的供體的IL-6反應(yīng)曲線可以被帶到緊湊的范圍內(nèi)，這可以用來定量范圍較寬的熱原污染濃度(參見美國(guó)專利N0.6，696，261的圖3)。
[0066]2、雙分析系統(tǒng)
[0067]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，熱原性測(cè)試是在兩個(gè)分析容器系統(tǒng)中進(jìn)行，使得樣品與含有單核細(xì)胞的試劑的孵育步驟和含有單核細(xì)胞的試劑產(chǎn)生的細(xì)胞因子的捕獲步驟發(fā)生在兩個(gè)不同的分析容器系統(tǒng)中。孵育步驟在上面描述的培養(yǎng)步驟之后；測(cè)試樣品與含有單核細(xì)胞的試劑(例如PBMC)的孵育在與培養(yǎng)步驟相同的分析系統(tǒng)中進(jìn)行。用于本發(fā)明的熱原測(cè)試的最適孵育時(shí)間根據(jù)分析條件、即被分析的細(xì)胞因子而變化。例如，當(dāng)將全血與內(nèi)毒素一起孵育、讀出結(jié)果是IL-6時(shí)，在孵育6小時(shí)后含有單核細(xì)胞的試劑產(chǎn)生最少的額外細(xì)胞因子；在經(jīng)過4小時(shí)孵育后，試劑已經(jīng)分泌足夠量的IL-6，允許對(duì)熱原污染物進(jìn)行定量。當(dāng)全血與非內(nèi)毒素?zé)嵩黄鸱跤⑹褂萌魏巫x出結(jié)果時(shí)，在大約16到24小時(shí)的孵育后，試劑已經(jīng)分泌了足夠量的IL-6，允許對(duì)熱原污染物進(jìn)行定量。對(duì)于分析IL-6產(chǎn)生的本發(fā)明的實(shí)施方案來說，優(yōu)選的孵育時(shí)間是大約6到大約24小時(shí)，更優(yōu)選為大約12到大約24小時(shí)，最優(yōu)選為大約16到大約24小時(shí)。如果分析另一種細(xì)胞因子，應(yīng)該根據(jù)該特定細(xì)胞因子的產(chǎn)生而對(duì)孵育時(shí)間進(jìn)行最適化。這樣的最適化在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)。如果被分析的細(xì)胞因子不由單核細(xì)胞釋放，則可以通過凍融或通過在孵育期末加入濃度不會(huì)破壞配體與抗體的結(jié)合的去污劑來裂解細(xì)胞。
[0068]一旦孵育步驟完成，分析系統(tǒng)(第一個(gè)分析系統(tǒng))的內(nèi)含物，即含有單核細(xì)胞的試劑和測(cè)試樣品，被轉(zhuǎn)移到第二個(gè)分析系統(tǒng)中，第二分析系統(tǒng)含有至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)例如內(nèi)皮素的抗體處理過的表面。分析第二個(gè)分析系統(tǒng)中在用抗細(xì)胞因子或抗內(nèi)源介質(zhì)抗體包被的表面上細(xì)胞因子或內(nèi)源性介質(zhì)的存在。優(yōu)選，在分析包被了抗體的表面上結(jié)合的細(xì)胞因子之前，在程序中的所有點(diǎn)處維持嚴(yán)格的無菌條件。如果用捕獲抗體包被的ELISA板用作本發(fā)明的實(shí)施方案，將板清洗，并向ELISA板中加入與酶偶聯(lián)的第二種抗細(xì)胞因子抗體(除非第二種標(biāo)記的“檢測(cè)”抗體在上光之前或與第一分析系統(tǒng)的內(nèi)含物一起首先加入到板中)。再次清洗ELISA板，向ELISA板中加入底物將產(chǎn)生顏色。經(jīng)過短時(shí)間孵育之后，終止反應(yīng)，在ELISA讀板器上測(cè)量溶液的光密度。這個(gè)過程在美國(guó)專利N0.6，696，261的實(shí)施例2中有進(jìn)一步的描述。或者，可以使用非酶法的免疫分析技術(shù)。例如，免疫分析“三明治”的第二抗體可以用熒光基團(tuán)或放射性同位素標(biāo)記。清洗之后，在孔中捕獲的細(xì)胞因子的量可以通過檢測(cè)孔中存在的熒光或輻射的量來定量。幾種基于酶法和非酶法的分析系統(tǒng)可以商購(gòu)，并可以被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地修改以用于本發(fā)明。
[0069]3、單分析系統(tǒng)
[0070]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，熱原性測(cè)試在單分析容器系統(tǒng)中進(jìn)行，使得樣品與含有單核細(xì)胞的試劑的孵育步驟和含有單核細(xì)胞的試劑產(chǎn)生的細(xì)胞因子的捕獲步驟發(fā)生在同一個(gè)分析容器系統(tǒng)中。分析系統(tǒng)含有至少一個(gè)含聚丙烯的表面和至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體處理過的表面。孵育步驟在上面描述的培養(yǎng)步驟之后，并在與培養(yǎng)步驟相同的分析系統(tǒng)中進(jìn)行。如上面對(duì)雙分析容器系統(tǒng)的內(nèi)容所述，用于本發(fā)明的熱原測(cè)試的最適孵育時(shí)間根據(jù)分析條件、即被分析的細(xì)胞因子而變化?？偟膩碚f，關(guān)于雙分析容器系統(tǒng)討論的有關(guān)孵育步驟的教示也同樣適用于單分析容器系統(tǒng)。產(chǎn)生特定細(xì)胞因子的孵育時(shí)間應(yīng)該最適化，這樣的最適化在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)。如果待分析的細(xì)胞因子不由單核細(xì)胞釋放，可以通過凍融、或通過在孵育期末加入濃度不會(huì)破壞配體與抗體的結(jié)合的去污劑來裂解細(xì)胞。
[0071]一旦孵育步驟完成，則在含有至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)例如內(nèi)皮素的抗體處理過的表面的分析系統(tǒng)中，分析用抗細(xì)胞因子或抗內(nèi)源性介質(zhì)抗體包被的表面上細(xì)胞因子或內(nèi)源性介質(zhì)的存在。優(yōu)選，在分析包被了抗體的表面上結(jié)合的細(xì)胞因子之前，在程序中的所有點(diǎn)上維持嚴(yán)格的無菌條件?？偟膩碚f，對(duì)于雙分析容器系統(tǒng)的分析步驟進(jìn)行的討論，即關(guān)于ELISA板和非酶法免疫分析技術(shù)的討論，也同樣適用于單分析容器系統(tǒng)。
[0072]總的來說，單分析容器系統(tǒng)和雙分析容器系統(tǒng)可以互換。
[0073]4、分析容器
[0074]本發(fā)明的分析系統(tǒng)含有至少一個(gè)與含有單核細(xì)胞的試劑接觸的表面。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，分析系統(tǒng)包括至少一個(gè)微量滴定孔，并且表面至少是微量滴定孔內(nèi)部的一部分。在特定的實(shí)施方案中，微量滴定孔的表面含有聚丙烯涂層或者整個(gè)微量滴定孔由聚丙烯構(gòu)成。在某些實(shí)施方案中，分析系統(tǒng)含有至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體處理過的表面，施加抗體的表面至少是微量滴定孔內(nèi)部的一部分。優(yōu)選，微量滴定孔的形狀使得與平底的微量滴定孔相比，含有單核細(xì)胞的試劑集中了。
[0075]在某些實(shí)施方案中，微量滴定孔包括開放的頂端，上部區(qū)域從開放的頂端向下延伸，底壁從最低點(diǎn)以上的位置到最低點(diǎn)的直徑逐漸減小。
[0076]在某些實(shí)施方案中，微量滴定孔包括開放的頂端，從開口的頂端向下延伸的上部區(qū)域具有頂端和底端，而底部區(qū)域具有頂端和最低點(diǎn)，底部區(qū)域從上部區(qū)域的底端延伸，從底部區(qū)域的頂端到最低點(diǎn)，直徑逐漸減小得比上部區(qū)域更快。
[0077]在某些實(shí)施方案中，所述微量滴定孔的底壁不是平的，優(yōu)選為曲面的，有時(shí)為拋物面的。在某些特定的實(shí)施方案中，底壁是向下延伸的，或微量滴定孔的側(cè)面是向內(nèi)傾斜的。
[0078]5、診斷試齊I丨倉
[0079]上述實(shí)施方案中的任何一個(gè)都可以整合到診斷試劑盒中用于進(jìn)行熱原測(cè)試。試劑盒被用于檢測(cè)各種不同的非內(nèi)毒素?zé)嵩?，包括革蘭氏陽性細(xì)菌(例如金黃色葡萄球菌)或它們的組分(例如胞壁肽、脂胞壁酸、腸毒素、鏈球菌溶血素)，以及各種不同醫(yī)療制品、包括血液制品或其它腸胃外用品例如透析液、疫苗和靜脈溶液液中的內(nèi)毒素?zé)嵩?。總的來說，這樣的試劑盒包括微量滴定板，該板含有多個(gè)微量滴定孔，它們的形狀使得每個(gè)孔中含有的培養(yǎng)基與平底微量滴定孔相比集中，孔含有至少一個(gè)含有聚丙烯的表面。微量滴定板的孔包含含有低溫保存的單核細(xì)胞試劑，該試劑含有低溫保存的全血、低溫保存的外周血單核細(xì)胞或低溫保存的單核細(xì)胞系細(xì)胞，它們與孔的表面接觸。在某些實(shí)施方案中，微量滴定板的孔含有聚丙烯。當(dāng)含有低溫保存的單核細(xì)胞的試劑包含低溫保存的外周血單核細(xì)胞或低溫保存的單核細(xì)胞系細(xì)胞時(shí)，試劑以高細(xì)胞密度存在于孔中。含有低溫保存的全血作為含有單核細(xì)胞的試劑的試劑盒還含有針對(duì)IL-6的抗體，因?yàn)镮L-6是優(yōu)選的讀出結(jié)果。
[0080]在具體的實(shí)施方案中，孔包括單核細(xì)胞不能透過的屏障。屏障含有至少一個(gè)由無熱原材料構(gòu)成的表面，通常是膜、格柵、濾網(wǎng)或篩。屏障優(yōu)選為無菌的。適合用于微量滴定板的屏障的材料在本【技術(shù)領(lǐng)域】?jī)?nèi)是已知的。屏障對(duì)于流體是可透過的，它使得低溫保存的細(xì)胞可以不用移出孔就被清洗；二甲基亞砜(DMSO)洗浴低溫保存的細(xì)胞并作為防腐劑，它可以被取出以便不干擾測(cè)試。測(cè)試樣品被加到屏障上方，透過屏障，與屏障之下的細(xì)胞相接觸，并可能刺激這些細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子擴(kuò)散到屏障上方的培養(yǎng)基中。通常，通過抽吸溶液使阻擋層之上和之下的溶液完全混合。然后，對(duì)屏障之上的混合好的培養(yǎng)基的等份試樣進(jìn)行分析，分析細(xì)胞因子和炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的存在。
[0081]6、細(xì)胞因子產(chǎn)生數(shù)據(jù)的解讀
[0082]A、標(biāo)準(zhǔn)曲線方法
[0083]為了恰當(dāng)解讀本發(fā)明的熱原測(cè)試中產(chǎn)生的細(xì)胞因子產(chǎn)生數(shù)據(jù)，通過將含有單核細(xì)胞的試劑與USP標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素進(jìn)行孵育，產(chǎn)生內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線。其目的是為了根據(jù)針對(duì)已知熱原觀察到的反應(yīng)，來對(duì)測(cè)試樣品中測(cè)量到的細(xì)胞因子產(chǎn)生反應(yīng)進(jìn)行定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以從使用顯著不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素產(chǎn)生的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性數(shù)量的數(shù)據(jù)點(diǎn)，通過使用標(biāo)準(zhǔn)最佳擬合數(shù)據(jù)分析軟件來產(chǎn)生。產(chǎn)生這樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法在本【技術(shù)領(lǐng)域】?jī)?nèi)是一般常識(shí)。本 申請(qǐng)人:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10、4、1、0.25,0.06,0.03和OEU/ml的內(nèi)毒素?cái)?shù)據(jù)點(diǎn)適合用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是通過類似范圍的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性數(shù)量的濃度都將是合適的。一旦產(chǎn)生了標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線從細(xì)胞因子反應(yīng)內(nèi)推出等同的非內(nèi)毒素濃度(以等同的內(nèi)毒素單位定量)。因?yàn)榛谌暮袉魏思?xì)胞的試劑的反應(yīng)從供體到供體可以有顯著變化，重要的是對(duì)使用具體批次的含有單核細(xì)胞的試劑進(jìn)行每套分析產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。但是，因?yàn)楸景l(fā)明的優(yōu)選的ELISA板實(shí)施方案使用了非常少量的人類血液(大約40 μ L/孔)，因此單一單位的捐血就可以用于幾百個(gè)孔。使用USP內(nèi)毒素產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線幫助了將數(shù)據(jù)相對(duì)于內(nèi)毒素單位(EU，被USP/FDA定義，與WHO定義的國(guó)際單位IU —致)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，這是用于表示內(nèi)毒素/熱原污染的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
[0084]B、參比枇次方法
[0085]或者，在本發(fā)明的熱原測(cè)試中產(chǎn)生的細(xì)胞因子產(chǎn)生數(shù)據(jù)，可以通過將產(chǎn)品的測(cè)試批次引發(fā)的細(xì)胞因子反應(yīng)與產(chǎn)品的參比批次、包括污染的參比批次和未污染的參比批次引發(fā)的細(xì)胞因子反應(yīng)相比較來解讀。首先，鑒定醫(yī)療制品的兩個(gè)參比批次:對(duì)參比批次進(jìn)行熱原測(cè)試，并測(cè)量這些批次引發(fā)的細(xì)胞因子反應(yīng)。然后，對(duì)測(cè)試批次進(jìn)行熱原測(cè)試，將這些批次引發(fā)的反應(yīng)與參比批次引發(fā)的反應(yīng)進(jìn)行比較。一般來說，測(cè)試批次如果引發(fā)的反應(yīng)比污染的參比批次更小并且反應(yīng)與未污染的參比批次類似，它將被視為未污染的。每個(gè)測(cè)試批次可以被測(cè)試一次或幾次。例如，按照一種參比批次方法，如果產(chǎn)品引發(fā)的IL-6釋放在四個(gè)供體中的四個(gè)或八個(gè)供體中的七個(gè)中不超過未污染的參比批次的兩倍時(shí)，它被視為未污染的；該測(cè)試使用四個(gè)不同供體的血液四份平行進(jìn)行。優(yōu)選的參比批次方法在Gaines-Das等2004中有描述，其中需要測(cè)試樣品來刺激比參比少的IL-6的釋放。在該文中，測(cè)試制品需要用來自四個(gè)不同供體的PBMNC通過測(cè)試。如果測(cè)試制品使用四個(gè)供體中的三個(gè)的PBMNC通過了測(cè)試，則將使用另外四個(gè)供體的PBMNC繼續(xù)進(jìn)行測(cè)試，這四個(gè)供體沒有一個(gè)在第一次測(cè)試時(shí)提供PBMNC，測(cè)試制品需要用來自八個(gè)不同供體中的七個(gè)的PBMNC通過測(cè)試。
[0086]有利的是，本發(fā)明的單核細(xì)胞活化測(cè)試能夠更好地檢測(cè)在醫(yī)療制品例如血液制品、靜脈溶液和疫苗中存在的各種各樣的熱原，包括非內(nèi)毒素?zé)嵩?br> [0087]定義
[0088]在本文中使用的術(shù)語“純的”內(nèi)毒素或非內(nèi)毒素?zé)嵩⒒颉凹儜B(tài)”熱原，是指已經(jīng)脫去了與它相關(guān)的蛋白的內(nèi)毒素。純的內(nèi)毒素也被稱為脂多糖(LPS)。
[0089]術(shù)語“含有單核細(xì)胞的試劑”是指免疫系統(tǒng)的單核白細(xì)胞的任何溶液。優(yōu)選，這些細(xì)胞來自要施用待測(cè)制品的生物體(即對(duì)于藥物制品來說為人類，對(duì)于獸醫(yī)制品來說為貓、狗或馬等)。含有單核細(xì)胞的試劑的例子是人類全血。
[0090]術(shù)語“分析系統(tǒng)”是指任何可以用于單核細(xì)胞活化測(cè)試的容器和表面，包括細(xì)胞與測(cè)試樣品一起培養(yǎng)和孵育的容器，以及帶有可以用于免疫分析的結(jié)合的抗體的容器和表面。優(yōu)選，對(duì)于進(jìn)行免疫分析來說，這樣的容器是微量滴定孔板，在孔的表面結(jié)合有抗體，其中可以平行地進(jìn)行大量的比色酶聯(lián)免疫分析，并且可以通過ELISA讀板機(jī)器進(jìn)行自動(dòng)評(píng)估。但是也可以設(shè)想其它的免疫分析系統(tǒng)，特別是在包被的表面不是容器壁的必需部分的情況下。例如，含有抗體包被的聚苯乙烯珠子或測(cè)量桿的較大的試管可以用于本發(fā)明。
[0091]術(shù)語“單核細(xì)胞系”包含了任何具有內(nèi)源性⑶14和/或Toll樣受體(TLR)或已經(jīng)用CD14和/或TLR和/或炎性/致熱介質(zhì)的報(bào)告基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。細(xì)胞系不必須是單核細(xì)胞，只要它具有或已經(jīng)被轉(zhuǎn)染了存在于單核細(xì)胞上的“熱原受體”的成分就行；這些成分包括TLRs和⑶14。例如，人類胚胎腎臟(HEK)細(xì)胞已經(jīng)具有了大多數(shù)TLR，可以用它們不具有的TLR——TLR2和TLR4以及⑶14進(jìn)行穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染，使它們能夠充分像單核細(xì)胞，在本發(fā)明的方法中起作用。
實(shí)施例
[0092]實(shí)施例1
[0093]PBMC的制各。PBMC從不超過4小時(shí)的肝素化人類外周血通過使用Ficoll PaquePlusCPharmacia #17_1440_02)進(jìn)行密度梯度離心而分離。細(xì)胞用不含鈣和鎂的Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(Gibco #14190)洗兩次，重新懸浮在最低必需培養(yǎng)基(MEM) (Gibco#11090)、HEPES緩沖液(Gibco #15630)和5 μ L供體自己的熱失活血漿(即終濃度為2%)中。將PBMC稀釋到所需的細(xì)胞密度(每毫升8百萬、4百萬、2百萬和I百萬個(gè)PBMC)。
[0094]細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)在下述的微量滴定板上四份平行進(jìn)行:Corning Costar#3790，#3359。在每個(gè)孔中加入含有I百萬、50萬、25萬或13萬個(gè)細(xì)胞的125 μ L細(xì)胞懸浮液，然后加入125 μ L測(cè)試樣品或標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(0.0064-20EU/mL)。將250 μ L混合物輕輕混合，在潮濕空氣和5%C02中在37±1°C下孵育。培養(yǎng)的時(shí)間是16到24小時(shí)，該時(shí)間后獲得培養(yǎng)流體的等份試樣，稀釋到2倍和50倍，分析IL-6。
[0095]IL-6 的 ELISA0 將 96 孔板(Immulon4，Dynex #011-010-3855)用 150 μ L 的 3 μ g/mL小鼠單克隆IgG(R&D Systems #MAB206，溶解在碳酸氫鹽緩沖液中，pH9.5)通過在2_8°C孵育過夜進(jìn)行包被。將板用300 μ L清洗緩沖液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4)清洗3次。通過加入200 μ L阻斷溶液(0.02g/L牛血清白蛋白，組分V，無蛋白酶)將板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷。板再用300 μ L同樣的清洗緩沖液洗3次，在每個(gè)孔中加入100 μ L樣品(之前在樣品稀釋液中稀釋2倍和50倍)或標(biāo)準(zhǔn)品(7.8-1000pg/mL, IL-6的WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，#89/548)。在每個(gè)未使用的孔中加入100 μ L樣品稀釋液。將板用密封蓋(sealer，F(xiàn)alcon#3073)蓋住，然后振蕩(大約300rpm)孵育I小時(shí)±5分鐘。
[0096]然后將板吸空,用300 μ L清洗緩沖液洗5次。然后在每個(gè)孔中加入100 μ L0.2 μ g/mL的生物素化山羊抗人IL-6抗體(R&D Systems，#BAF206)，再次用密封蓋蓋住板，振蕩(大約300rpm)孵育I小時(shí)±5分鐘。
[0097]然后將板吸空，用300 μ L清洗緩沖液洗5次。然后在每個(gè)孔中加入100 μ L0.02 μ g/mL的堿性磷酸酶(Rockland #S000~05),將板再次用密封蓋蓋住，振蕩(大約300rpm)孵育I小時(shí)±5分鐘。
[0098]將板吸空，用300 μ L清洗緩沖液洗5次。然后在每個(gè)孔中加入200 μ Llmg/mL的pNPP，該pNPP溶解在含有0.5mM MgCl2的二乙醇胺緩沖液中。將板再次用密封蓋蓋住，于室溫振蕩(大約300rpm)孵育，直到IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大濃度(1000pg/mL)在405nm處具有大約2.5和3.0之間的光密度，在該點(diǎn)處通過在每個(gè)孔中加入50 μ L2M的NaOH來終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后30分鐘內(nèi)使用設(shè)置到405nm的微孔板讀板器測(cè)定每個(gè)孔的光密度。
[0099]圖1顯示了細(xì)胞密度對(duì)IL-6對(duì)于內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(lEU/ml)和Extraneal ?陽性對(duì)照的反應(yīng)的影響。Extraneal ?陽性對(duì)照被非內(nèi)毒素?zé)嵩廴?，并在該藥品該批次的人類接受者中引起了藥物不良反?yīng)，但是在LAL測(cè)試中給出了陰性反應(yīng)(Martis等，2005)。值是4個(gè)重復(fù)孔的平均值+平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。每個(gè)孔25萬到I百萬個(gè)PBMC的細(xì)胞密度對(duì)IEU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)相似。陽性對(duì)照樣品檢測(cè)最好的是使用每個(gè)孔I百萬>50萬>25萬>13萬個(gè)細(xì)胞。
[0100]實(shí)施例2—對(duì)比熱原測(cè)試
[0101]本文描述的方法按本【技術(shù)領(lǐng)域】的當(dāng)前狀況進(jìn)行重復(fù)。這些方法都不能將Extraneal⑧透析溶液、血紅蛋白和/或葡聚糖的陽性產(chǎn)品對(duì)照與陰性產(chǎn)品對(duì)照區(qū)分開來。
[0102]HofTman等，2005的分析按照其中的描述進(jìn)行了重復(fù)，使用了帶有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板和IL-6讀出結(jié)果。含有單核細(xì)胞的試劑以低細(xì)胞密度使用，在圖2-5中是全血(每個(gè)孔75，000個(gè)細(xì)胞)、PBMC (每個(gè)孔100，000個(gè)細(xì)胞)、M0N0MAC6 (每個(gè)孔250，000個(gè)細(xì)胞)或THP-1 (每個(gè)孔250，000個(gè)細(xì)胞)。注意到在圖5中，IL-6讀出結(jié)果被新喋呤所取代，因?yàn)樵诒景l(fā)明的方法中IL-6是內(nèi)源的熱原(與新喋呤相反)，并且讀出結(jié)果更牢靠。在圖6中，低細(xì)胞密度的THP-12A9細(xì)胞(每個(gè)孔250，000個(gè)細(xì)胞)被用作含有單核細(xì)胞的試劑，TNF為讀出結(jié)果。
[0103]Nakagawa等的分析按照其中的描述進(jìn)行了重復(fù)，使用每毫升1，000，000個(gè)M0N0MAC-CA8克隆細(xì)胞作為含有單核細(xì)胞的試劑，IL-6作為讀出結(jié)果，以及具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板。參見圖7。
[0104]Yamamoto等的分析按照其中的描述進(jìn)行了重復(fù)，使用每毫升1，000, 000個(gè)28C細(xì)胞作為含有單核細(xì)胞的試劑，IL-6為讀出結(jié)果，以及具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板。參見圖8。但是，28C細(xì)胞被鈣三醇(100ng/nl)而不是Y -干擾素所引發(fā)，因?yàn)楹笳邔?duì)于內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品不能給出劑量反應(yīng)曲線。
[0105]實(shí)施例3—本發(fā)明的熱原測(cè)試
[0106]20%的人類全血培養(yǎng)物(200 μ I) (40 μ 1=大約60，000PBMC/孔=大約300, 000PBMC/ml)在 96 孔圓底聚丙烯板(Costar#3790, Corning Incorporated, USA)上進(jìn)行四份平行培養(yǎng)。每個(gè)孔中加入:MEM-HEPES (60μ I)、來自單一供體的血液(40μ I)、用MEM-HEPES1:1稀釋的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品或Extraneal ?樣品(100 μ I,即在孔中Extraneal ?溶液的最終稀釋倍數(shù)為4倍)。通過輕輕旋轉(zhuǎn)使孔的內(nèi)含物混合(不使孔交叉污染)，在含有5%C02的氣氛下在37°C不振蕩(令細(xì)胞沉降)孵育16-24小時(shí)。在組織培養(yǎng)孵育結(jié)束時(shí)，從每個(gè)孔取出100 μ I的澄清的上清液等份試樣，通過ELISA分析IL-6。
[0107]用于葡聚糖樣品的方法與上面實(shí)施例1中描述的相同。細(xì)胞的分離和培養(yǎng)相似，除了細(xì)胞密度是每個(gè)孔400，000個(gè)細(xì)胞以及在ELISA中使用的樣品稀釋度是10倍之外。IL-6ELISA的不同之處在于它使用了用克隆16單克隆抗體包被的板(用于捕獲IL-6)，以及與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的綿羊多克隆抗體作為檢測(cè)抗體。在全血/IL-6測(cè)試(NIBSC)和PBMC/IL-6測(cè)試(Novartis)中使用的ELISA與Hoffmann等2005年的論文中描述的相同。
[0108]圖9顯示了 Extraneal ?陰性對(duì)照樣品和Extraneal ?陽性對(duì)照樣品、以及葡聚糖陰性對(duì)照樣品和葡聚糖陽性對(duì)照樣品的比較性的結(jié)果。可以看出，本發(fā)明的熱源測(cè)試可以輕易地區(qū)分這些陽性和陰性對(duì)照。測(cè)試按照上面描述的方案使用來自單一供體的血液四份平行進(jìn)行。值是四個(gè)重復(fù)孔的平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0109]圖10顯示了 Extraneal㊣陰性對(duì)照樣品和Extraneal⑩陽性對(duì)照樣品的比較性的結(jié)果?？梢钥闯觯景l(fā)明的熱原測(cè)試可以容易地區(qū)分這些陽性和陰性對(duì)照。測(cè)試按照上面描述的方案使用來自單一供體的血液四份平行進(jìn)行。值是四個(gè)重復(fù)孔的平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。要注意的是，當(dāng)含有單核細(xì)胞的試劑是全血并且使用圓底的聚丙烯孔時(shí)，低細(xì)胞密度就足以將陽性Extraneal⑩對(duì)照與陰性區(qū)分開來。
[0110]實(shí)施例4一本發(fā)明的熱原測(cè)試:對(duì)于單一供體來說聚丙烯板對(duì)聚苯乙烯板和IL-6對(duì)IL-Ιβ的比較性結(jié)果
[0111]按照實(shí)施例1中的方法制備測(cè)試樣品，只是使用的細(xì)胞密度為每個(gè)孔I百萬個(gè)細(xì)胞，某些樣品進(jìn)行IL-1 β讀出，某些樣品被放置在具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板中。圖1lA顯示出對(duì)于在聚丙烯板中進(jìn)行的測(cè)試來說，對(duì)陽性對(duì)照的IL-6反應(yīng)與陰性對(duì)照明確區(qū)分開，但是對(duì)于在聚苯乙烯板中進(jìn)行的測(cè)試來說則不能區(qū)分開。值是四個(gè)重復(fù)孔的平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖1lB顯示出對(duì)于在聚丙烯板中進(jìn)行的測(cè)試來說，對(duì)陽性對(duì)照的IL-1 β反應(yīng)與陰性對(duì)照明確區(qū)分開，但是對(duì)于在聚苯乙烯板中進(jìn)行的測(cè)試來說則不能區(qū)分開。但是在圖1lB中的反應(yīng)的強(qiáng)度比圖1lA中的反應(yīng)的強(qiáng)度要弱得多，表明與IL-6相比，IL-1 β是差的讀出結(jié)果值。值是四個(gè)重復(fù)孔的平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0112]實(shí)施例5—本發(fā)明的熱原測(cè)試:對(duì)于多個(gè)供體來說聚丙烯板對(duì)聚苯乙烯板的比較性結(jié)果
[0113]按照實(shí)施例1中的方法制備測(cè)試樣品，只是使用的細(xì)胞密度為每個(gè)孔88萬和I百萬個(gè)細(xì)胞，使用了三個(gè)供體，某些樣品被放置在具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板中，IL-6的ELISA使用了用克隆16單克隆抗體包被的板和與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的綿羊多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，如同Hoffmann等的2005年的論文中所述。圖12A和12B分別顯示了對(duì)于具有圓底孔的聚丙烯微量滴定板和具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板的IL-6反應(yīng)，PBMC細(xì)胞密度為每個(gè)孔供體A的88萬個(gè)細(xì)胞。對(duì)于供體A來說，當(dāng)使用聚苯乙烯板時(shí)，熱原測(cè)試不能區(qū)分開陽性和陰性對(duì)照，但是當(dāng)使用聚丙烯板時(shí)能夠區(qū)分開這些對(duì)照。圖13A和13B分別顯示了對(duì)于具有圓底孔的聚丙烯微量滴定板和具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板的IL-6反應(yīng)，PBMC細(xì)胞密度為每個(gè)孔供體B的I百萬個(gè)細(xì)胞。盡管對(duì)于供體B來說兩種熱原測(cè)試都能區(qū)分開陽性和陰性對(duì)照，但是當(dāng)使用聚丙烯板時(shí)對(duì)陽性對(duì)照的IL-6反應(yīng)是對(duì)陰性對(duì)照的反應(yīng)的大約6倍，而使用聚苯乙烯板時(shí)僅僅為對(duì)陰性對(duì)照的反應(yīng)的大約2倍。圖14A和14B分別顯示了對(duì)于具有圓底孔的聚丙烯微量滴定板和具有平底孔的聚苯乙烯微量滴定板的IL-6反應(yīng)，PBMC細(xì)胞密度為使每個(gè)孔供體C的88萬個(gè)細(xì)胞。盡管對(duì)于供體B來說兩種熱原測(cè)試都能區(qū)分開陽性和陰性對(duì)照，但是使用聚丙烯板與使用聚苯乙烯板相比，對(duì)陽性對(duì)照的IL-6反應(yīng)是大約2倍高。注意的是在聚丙烯中，對(duì)Extraneal ?陽性對(duì)照的反應(yīng)超過了對(duì)LPS標(biāo)準(zhǔn)品最大劑量即0.4EU/ml的反應(yīng)，而在聚苯乙烯中，對(duì)Extraneal ?陽性對(duì)照的反應(yīng)小于對(duì)LPS標(biāo)準(zhǔn)品最小劑量即0.lEU/ml的反應(yīng)。
[0114]實(shí)施侈!I 6—對(duì)比十牛熱原測(cè)I試:IPT (Charles River Laboratories)
[0115]用于進(jìn)行本測(cè)試的方法被描述在Endosafe ? -1PT體外熱原測(cè)試指導(dǎo)說明書中(可以從 Charles River Laboratories 商購(gòu)，(PIIPT10002)),使用了用 IL-1 β 和聚苯乙烯微量滴定板用于全血刺激的分析程序。圖15顯示出IPT測(cè)試不能區(qū)分開Extraneal⑧和血紅蛋白的陽性和陰性對(duì)照，盡管試劑盒能夠與LPS標(biāo)準(zhǔn)品和試劑盒中來自革蘭氏陽性細(xì)菌的脂胞壁酸陽性對(duì)照反應(yīng)。
[0116]實(shí)施例7—使用低溫保存的細(xì)胞的本發(fā)明的熱原測(cè)試
[0117]在具有圓底的250 μ L孔的96孔聚丙烯板的每個(gè)孔中加入在血漿和二甲基亞砜中(或在全血和二甲基亞砜中)的細(xì)胞懸浮液(例如I百萬個(gè)PBMC或單核細(xì)胞)，然后密封并低
溫保存。
[0118]在測(cè)試日，將板融化，達(dá)到室溫，取下密封，將96孔插件牢固地壓到位。插件具有聚丙烯壁和平的底面，該底面對(duì)于細(xì)胞通過來說是屏障，但是液體能夠通過。
[0119]通過用新鮮 的培養(yǎng)基充滿插件、上下吸培養(yǎng)基以混合細(xì)胞屏障上下的溶液、然后吸取并丟棄細(xì)胞屏障之上的溶液來將DMSO從細(xì)胞中洗掉。通過重復(fù)該清洗步驟5次，細(xì)胞被洗得基本上不含DMS0，然后保留在已知體積的新鮮培養(yǎng)基中。
[0120]將測(cè)試樣品或標(biāo)準(zhǔn)品和更多的新鮮培養(yǎng)基加到插件中，然后通過上下吸該溶液混合細(xì)胞屏障上下的溶液，使樣品或(熱原)標(biāo)準(zhǔn)品中的熱原與細(xì)胞接近。
[0121]將板在含有5% 二氧化碳?xì)怏w的加濕的空氣下在37± I°C孵育16-24小時(shí)。在孵育過程中，細(xì)胞的沉降使得細(xì)胞彼此接觸，促進(jìn)了熱原刺激的IL-6的釋放。在孵育時(shí)期結(jié)束時(shí)，通過上下吸細(xì)胞屏障之上的溶液使細(xì)胞屏障上下的溶液完全混合，然后取出細(xì)胞調(diào)節(jié)過的培養(yǎng)基的等份試樣進(jìn)行IL-6分析。
[0122]低溫保存的PBMC是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢匀菀椎卦诟杀先澜邕\(yùn)輸。與聚苯乙烯不同，聚丙烯烴得起液氮而不破裂。在達(dá)到后，PBMC只需要被融化并洗去DMS0，再加上提供的板插件就可以準(zhǔn)備用于測(cè)試中。通過運(yùn)輸每個(gè)孔中最適數(shù)量的細(xì)胞以及將細(xì)胞與板插件一起使用，為終端用戶提供了改進(jìn)的測(cè)試試劑盒。在常規(guī)試劑盒中，細(xì)胞在試管中運(yùn)輸，一旦融化后，必須通過離心使細(xì)胞沉積、并使它們分散在干凈的培養(yǎng)基中來進(jìn)行清洗。通常細(xì)胞要以這種方式清洗2到3次。然后必須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并重新懸浮成所需的細(xì)胞密度，然后才可以將它們分配到孔中。與可能導(dǎo)致細(xì)胞損失、活化和細(xì)胞死亡的常規(guī)測(cè)試相t匕，本發(fā)明的熱原測(cè)試降低了勞動(dòng)強(qiáng)度、減少了時(shí)間耗費(fèi)并極大地降低了對(duì)細(xì)胞的創(chuàng)傷。
[0123]在介紹本發(fā)明的要素或其優(yōu)選實(shí)施方案時(shí)，冠詞〃a〃、〃an〃、〃該〃和〃所述〃是指有一個(gè)或多個(gè)要素。術(shù)語〃包含〃、〃包括〃和〃具有〃其目的是包含性的，是指除了列出的要素之外還可以有其它的要素。因?yàn)樵谏鲜龅姆椒ê统煞种锌梢宰鞒龈鞣N不同的改變而不背離本發(fā)明的范圍，因此在上面的說明書中包含的所有的事物都應(yīng)該被解釋為舉例說明性的，而沒有限制的意義。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)熱原的存在或用于確保藥物、營(yíng)養(yǎng)品或醫(yī)療制品的安全性的體外熱原測(cè)試，包括下列步驟: (a)將含有單核細(xì)胞的試劑與待測(cè)樣品在第一個(gè)分析系統(tǒng)中組合，所述第一個(gè)分析系統(tǒng)包含至少一個(gè)微量滴定孔，其形狀使得與平底的微量滴定孔相比，含有單核細(xì)胞的試劑被集中以提供更多的細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，其中所述微量滴定孔的表面包含聚丙烯涂層或者整個(gè)微量滴定孔由聚丙烯構(gòu)成； (b)將含有單核細(xì)胞的試劑與樣品孵育； (C)將第一個(gè)分析系統(tǒng)的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到第二個(gè)分析系統(tǒng)中，所述第二個(gè)分析系統(tǒng)包含至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體處理過的表面；以及 (d)分析第二個(gè)分析系統(tǒng)中與表面上的抗體結(jié)合的細(xì)胞因子或內(nèi)源性介質(zhì)的存在。
2.用于檢測(cè)熱原的存在或用于確保藥物、營(yíng)養(yǎng)品或醫(yī)療制品的安全性的體外熱原測(cè)試，包括下列步驟: (a)將含有單核細(xì)胞的試劑與待測(cè)樣品在第一個(gè)分析系統(tǒng)中組合，所述第一個(gè)分析系統(tǒng)包含(i)至少一個(gè)微量滴定孔，其形狀使得與平底的微量滴定孔相比，含有單核細(xì)胞的試劑被集中以提供更多的細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，其中所述微量滴定孔的表面包含聚丙烯涂層或者整個(gè)微量滴定孔由聚丙烯構(gòu)成，以及(ii)至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體處理過的表面； (b)將含有單核細(xì)胞的試劑與樣品孵育；以及 (C)分析分析系統(tǒng)中與表面上的抗體結(jié)合的細(xì)胞因子或內(nèi)源性介質(zhì)的存在。
3.診斷試劑盒,包括: 低溫保存的含有單核細(xì)胞的試劑； 含有多個(gè)微量滴定孔的微量滴定板，所述微量滴定孔的形狀使得與平底的微量滴定孔相比，含有單核細(xì)胞的試劑被集中以提供更多的細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，其中每個(gè)微量滴定孔包含的底壁是非平面的，其中所述微量滴定孔的表面包含聚丙烯涂層或者整個(gè)微量滴定孔由聚丙烯構(gòu)成，并且或者所述分析系統(tǒng)還包含至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體處理過的表面，或者所述試劑盒包括第二個(gè)分析系統(tǒng)，所述第二個(gè)分析系統(tǒng)包含至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體處理過的表面,其中細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)是由含有單核細(xì)胞的試劑暴露于含有熱原的樣品時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的診斷試劑盒，其中每個(gè)微量滴定孔包含的底壁是曲面的、拋物面的或向下延伸的。
5.用于檢測(cè)熱原的存在或用于確保藥物、營(yíng)養(yǎng)品或醫(yī)療制品的安全性的診斷試劑盒，其包括分析系統(tǒng)，所述分析系統(tǒng)包括含有多個(gè)微量滴定孔的微量滴定板，每個(gè)孔的形狀使得當(dāng)含有單核細(xì)胞的試劑存在于微量滴定孔中時(shí)，與平底的微量滴定孔相比，含有單核細(xì)胞的試劑被集中以提供更多的細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，其中孔的表面包含聚丙烯涂層或者整個(gè)孔由聚丙烯構(gòu)成，并且或者所述分析系統(tǒng)還包含至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體處理過的表面，或者所述試劑盒包括第二個(gè)分析系統(tǒng)，所述第二個(gè)分析系統(tǒng)包含至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體處理過的表面,其中細(xì)胞因子或內(nèi)源性介質(zhì)是由含有單核細(xì)胞的試劑產(chǎn)生的細(xì)胞因子或內(nèi)源性介質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的診斷試劑盒，其包括含有單核細(xì)胞的試劑，任選其中所述含有單核細(xì)胞的試劑是低溫保存的。
7.權(quán)利要求3或6的診斷試劑盒，其中將低溫保存的含有單核細(xì)胞的試劑與微量滴定板分開提供給終端用戶，任選其中通過在干冰上運(yùn)輸將低溫保存的含有單核細(xì)胞的試劑提供給終端用戶。
8.權(quán)利要求3或6的診斷試劑盒，其中將低溫保存的含有單核細(xì)胞的試劑等分成最佳的每孔細(xì)胞數(shù)而提供給終端用戶。
9.權(quán)利要求3或6的診斷試劑盒，其中低溫保存的含有單核細(xì)胞的試劑包含低溫保存的外周血單核細(xì)胞、低溫保存的單核細(xì)胞系細(xì)胞、或低溫保存的全血。
10.權(quán)利要求9的診斷試劑盒，其中低溫保存的單核細(xì)胞系包括選自以下的人類單核細(xì)胞系:MONOMAC-6，THP-1，28SC，包含內(nèi)源性⑶14或Toll樣受體的細(xì)胞系，以及轉(zhuǎn)染有CD14、Toll樣受體或炎性或致熱性介質(zhì)的報(bào)告基因的細(xì)胞系。
11.權(quán)利要求3或5的診斷試劑盒，其還包括針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體。
12.權(quán)利要求11的診斷試劑盒，其中細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)選自白介素-1(IL-1)、白介素-1ra (IL_lra)、白介素-6 (IL-6)、白介素-8 (IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α )和內(nèi)皮素。
13.權(quán)利要求11的診斷試劑盒，其中用所述抗體處理微量滴定板的微量滴定孔的至少一個(gè)表面。
14.權(quán)利要求11或12的診斷試劑盒，其還包含第二個(gè)微量滴定板，所述第二個(gè)微量滴定板包含至少一個(gè)用所述抗體處理過的表面。
15.權(quán)利要求3或5的診斷試劑盒，其中所述多個(gè)微量滴定孔中的每個(gè)微量滴定孔包括開放的頂部，從開放的頂部向下延伸的上部區(qū)域，以及從最低點(diǎn)以上的位置向最低點(diǎn)直徑逐漸減小的底壁。
16.權(quán)利要求3或5的診斷試劑盒，其中所述多個(gè)微量滴定孔中的每個(gè)微量滴定孔包括開放的頂部，從具有頂端和底端的開放的頂部向下延伸的上部區(qū)域，以及具有頂端和最低點(diǎn)的底部區(qū)域，該底部區(qū)域從上部區(qū)域的底端延伸，并且從底部區(qū)域的頂端向著最低點(diǎn)直徑逐漸減小比上部區(qū)域減小的更快。
17.權(quán)利要求3或5的診斷試劑盒，其中所述多個(gè)微量滴定孔中的每個(gè)微量滴定孔的底壁是非平面的、曲面的、拋物面的或向下延伸的，或者所述微量滴定孔的側(cè)面是向內(nèi)傾斜的。
18.用于檢測(cè)熱原的存在或用于確保藥物、營(yíng)養(yǎng)品或醫(yī)療制品的安全性的測(cè)試樣品的方法，包括下列步驟: 將含有單核細(xì)胞的試劑與待測(cè)樣品在第一個(gè)分析系統(tǒng)中組合，所述第一個(gè)分析系統(tǒng)包含至少一個(gè)微量滴定孔，其形狀使得與平底的微量滴定孔相比，含有單核細(xì)胞的試劑被集中以提供更多的細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，其中所述微量滴定孔的表面包含聚丙烯涂層或者整個(gè)微量滴定孔由聚丙烯構(gòu)成； 將含有單核細(xì)胞的試劑與樣品孵育； 將第一個(gè)分析系統(tǒng)的內(nèi) 含物轉(zhuǎn)移到第二個(gè)分析系統(tǒng)中，所述第二個(gè)分析系統(tǒng)包含至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體處理過的表面；以及 分析第二個(gè)分析系統(tǒng)中與表面上的抗體結(jié)合的細(xì)胞因子或內(nèi)源性介質(zhì)的存在，從而測(cè)試樣品。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述樣品是藥物、營(yíng)養(yǎng)品或醫(yī)療制品。
20.權(quán)利要求18的方法，其中細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)是促炎性細(xì)胞因子或Thl細(xì)胞因子。
21.權(quán)利要求20的方法，其中細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)是TNF-a、IL_2、IFN、或 IL-8。
22.權(quán)利要求18的方法，其中微量滴定孔包括開放的頂部，從開放的頂部向下延伸的上部區(qū)域，以及從最低點(diǎn)以上的位置向最低點(diǎn)直徑逐漸減小的底壁。
23.權(quán)利要求18的方法，其中微量滴定孔包括開放的頂部，從具有頂端和底端的開放的頂部向下延伸的上部區(qū)域，以及具有頂端和最低點(diǎn)的底部區(qū)域，該底部區(qū)域從上部區(qū)域的底端延伸，并且從底部區(qū)域的頂端向著最低點(diǎn)直徑逐漸減小比上部區(qū)域減小的更快。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述微量滴定孔的底壁是非平面的、曲面的、拋物面的或向下延伸的，或者所述微量滴定孔的側(cè)面是向內(nèi)傾斜的。
25.權(quán)利要求18的方法，其中含有單核細(xì)胞的試劑包含外周血單核細(xì)胞或單核細(xì)胞系細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25的方法，其中單核細(xì)胞系包括選自以下的人類單核細(xì)胞系:MONOMAC-6，THP-1，28SC，具有內(nèi)源性⑶14或Toll樣受體的細(xì)胞系，以及轉(zhuǎn)染有⑶14、Toll樣受體和炎性或致熱性介質(zhì)的報(bào)告基因中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞系。
27.權(quán)利要求18的方法，其中含有單核細(xì)胞的試劑包含足以提供第一個(gè)分析系統(tǒng)的至少125，000個(gè)細(xì)胞/孔的多個(gè)細(xì)胞。
28.用于檢測(cè)熱原的存在或用于確保藥物、營(yíng)養(yǎng)品或醫(yī)療制品的安全性的測(cè)試樣品的方法，包括下列步驟: 將含有單核細(xì)胞的試劑與待測(cè)樣品在第一個(gè)分析系統(tǒng)中組合，所述第一個(gè)分析系統(tǒng)包含(i)至少一個(gè)微量滴定孔，其形狀使得與平底的微量滴定孔相比，含有單核細(xì)胞的試劑被集中以提供更多的細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，其中所述微量滴定孔的表面包含聚丙烯涂層或者整個(gè)微量滴定孔由聚丙烯構(gòu)成，以及(ii)至少一個(gè)用針對(duì)細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)的抗體處理過的表面； 將含有單核細(xì)胞的試劑與樣品孵育；以及 分析分析系統(tǒng)中與表面上的抗體結(jié)合的細(xì)胞因子或內(nèi)源性介質(zhì)的存在，從而測(cè)試樣品O
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述樣品是藥物、營(yíng)養(yǎng)品或醫(yī)療制品。
30.權(quán)利要求28的方法，其中細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)是促炎性細(xì)胞因子或Thl細(xì)胞因子。
31.權(quán)利要求30的方法，其中細(xì)胞因子或炎性反應(yīng)的內(nèi)源性介質(zhì)是TNF-a、IL_2、IFN、或 IL-8ο
32.權(quán)利要求28的方法，其中微量滴定孔包括開放的頂部，從開放的頂部向下延伸的上部區(qū)域，以及從最低點(diǎn)以上的位置向最低點(diǎn)直徑逐漸減小的底壁。
33.權(quán)利要求28的方法，其中微量滴定孔包括開放的頂部，從具有頂端和底端的開放的頂部向下延伸的上部區(qū)域，以及具有頂端和最低點(diǎn)的底部區(qū)域，該底部區(qū)域從上部區(qū)域的底端延伸，并且從底部區(qū)域的頂端向著最低點(diǎn)直徑逐漸減小比上部區(qū)域減小的更快。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述微量滴定孔的底壁是非平面的、曲面的、拋物面的或向下延伸的，或者所述微量滴定孔的側(cè)面是向內(nèi)傾斜的。
35.權(quán)利要求28的方法，其中含有單核細(xì)胞的試劑包含外周血單核細(xì)胞或單核細(xì)胞系細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35的方法，其中單核細(xì)胞系包括選自以下的人類單核細(xì)胞系:MONOMAC-6，THP-1，28SC，具有內(nèi)源性⑶14或Toll樣受體的細(xì)胞系，以及轉(zhuǎn)染有⑶14、Toll樣受體和炎性或致熱性介質(zhì)的報(bào)告基因中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞系。
37.權(quán)利要求28的方法，其中含有單核細(xì)胞的試劑包含足以提供分析系統(tǒng)的至少.125，000個(gè)細(xì)胞/孔 的多個(gè)細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK103901208SQ201310252724
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2005年12月22日
【發(fā)明者】斯蒂芬·普勒, 梅于爾·帕特爾 申請(qǐng)人:巴克斯特國(guó)際公司, 巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司, 衛(wèi)生事務(wù)大臣