本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)快速、高效篩選抗性基因的方法，它主要用于快速找到抗性基因，并能驗證基因功能。
背景技術(shù)：
：枯草芽孢桿菌是經(jīng)美國fda認(rèn)證的一種對環(huán)境無害的(gras)革蘭氏陽性細(xì)菌，全基因組測序已經(jīng)完成，其作為工程菌具有很大的優(yōu)勢，原因在于：芽孢桿菌的胞外蛋白可以直接分泌到培養(yǎng)基中；芽孢桿菌分泌的蛋白無內(nèi)毒素，較為安全；被認(rèn)為非常適合遺傳操作，并已成為被廣泛應(yīng)用于實驗室研究的模式生物，本研究中所用芽孢桿菌wb800，已經(jīng)突變掉了8個主要的胞外蛋白酶，大大降低了抗菌肽降解的可能性。cdna文庫是以特定的組織或細(xì)胞的mrna為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成的cdna，再利用體外的dna重組技術(shù)，轉(zhuǎn)入合適的受體進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)，形成一個重組的克隆群體，cdna文庫是目前研究基因功能最常用的手段之一?？咕?antimicrobialpeptide，amp)是由生物合成的具有廣譜抗性的小分子多肽，到目前為止已有1200多種來自動植物的抗菌肽被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其中70多種抗菌多肽的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被揭示，抗菌肽對多種真菌、細(xì)菌、寄生蟲和病毒都有一定的殺傷作用引起了廣泛的重視。目前抗菌肽的相關(guān)研究大多集中在活性物質(zhì)的提取分離和純化方面以及抗性機(jī)理的研究上，分離抗菌肽的方法主要有三種：1、生物體直接提取純化，但是抗菌肽天然合成量非常少，分離純化過程中損失大，且容易失活；2、人工合成已知的抗菌肽，此方法成本高、耗時長，無法保證抗菌肽的天然構(gòu)象和生物活性，而且難以篩選到新的抗菌肽；3、構(gòu)建工程菌融合表達(dá)抗菌基因，這種方法利用差異顯示技術(shù)，通過pcr的手段將有差異的片段分開，篩選出目的基因，經(jīng)pcr擴(kuò)增后，片段的重復(fù)率顯著增加，且分離的片段可能為無效片段，此外，另一種方法是基于蛋白或多肽的逐級分離檢測，從活性蛋白入手推斷出的基因序列再合成抗菌肽，此方法工作周期長，工作量大，且再合成的抗菌肽往往沒有預(yù)期的活性。本發(fā)明采用芽孢桿菌wb800分泌系統(tǒng)，首先抗菌肽在菌體內(nèi)部表達(dá)，使得篩選系統(tǒng)變得更靈敏，其次，采用文庫篩選的方法可以在是篩選出很多個潛在的抗菌肽的同時，對應(yīng)上相應(yīng)基因片段，最后，芽孢桿菌本身就是一個生防菌，發(fā)現(xiàn)的新的抗菌肽具有很大的應(yīng)用潛力。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)快速、高效篩選抗菌基因的方法，本方法首先誘導(dǎo)植物中抗性基因的表達(dá)，再選擇合適的載體構(gòu)建一個完整的cdna文庫，導(dǎo)入到枯草芽孢桿菌后，利用其分泌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組質(zhì)粒，點樣法篩選抗性表型，實驗步驟簡單、易行，適合工作量大的文庫篩選，能夠在有限的時間內(nèi)快速高效的得到具有抗性表型的克隆，為篩選抗性基因提了新的途徑。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：一種利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)快速、高效篩選抗菌基因的方法，其步驟為：1)含目標(biāo)基因的cdna文庫的制備：a.在健康植株上接種病原菌(該病原菌必須可以在寄主植物上致病，對病原菌種類無要求)誘導(dǎo)抗性基因的表達(dá)后，提取目標(biāo)植物總rna；b.分離純化mrna；c.設(shè)計含xbaⅰ酶切位點的oligodt，其序列為5′-acaggctctagagcttttttttttttttttttttttt-3′，合成cdna第一條鏈，以第一條鏈為模板合成第二條cdna鏈；cdna合成完成后，加上含ndeⅰ酶切位點的的接頭，所述的含ndeⅰ酶切位點的的接頭有3對，以減少移碼突變的概率，由下述方法制得：將ndeⅰ1和ndeⅰ2，ndeⅰ3和ndeⅰ4，ndeⅰ5和ndeⅰ6等量混合，并加入1/10體積的10×pcrbuffer，在pcr儀中95℃加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫，形成接頭ndeⅰ1/ndeⅰ2，ndeⅰ3/ndeⅰ4，ndeⅰ5/ndeⅰ6；將接頭ndeⅰ1/ndeⅰ2，ndeⅰ3/ndeⅰ4和ndeⅰ5/ndeⅰ6等量混合，保存于-20℃，備用。d.cdna連接載體：將步驟c中的加完接頭的cdna用限制性核酸內(nèi)切酶xbaⅰ和ndeⅰ雙酶切后，連接到質(zhì)粒pbe-s上；e.將連接體系轉(zhuǎn)化到大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞中，擴(kuò)增質(zhì)粒；群體提質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌wb800，挑取不少于2000個轉(zhuǎn)化子，保存?zhèn)溆茫?)致死菌株的篩選a.將轉(zhuǎn)化子在標(biāo)記卡那霉素抗性的lb培養(yǎng)基中搖培過夜后，于相同抗性的平板上點樣，篩選出原本長勢正常但后期變成透明或半透明狀的菌株，初步確認(rèn)，該基因具有致死作用；b.將上述初步確認(rèn)的含致死基因菌液搖培后提取質(zhì)粒，經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增后重新轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌wb800和枯草芽孢桿菌野生菌株168，均出現(xiàn)了致死表型，表明致死表型由插入的基因引起，該基因作為下一步的候選基因；3)抗線蟲基因的篩選采用濾紙片法測定含候選基因的轉(zhuǎn)化子對秀麗隱桿線蟲的抗性，以枯草芽孢桿菌wb800作為對照，測定選擇指數(shù)，選擇指數(shù)公式如下：選擇指數(shù)＝(測試菌中線蟲數(shù)量-對照菌中線蟲數(shù)量)/線蟲總數(shù)，選擇指數(shù)小于-30％的轉(zhuǎn)化子具有抗線蟲作用，用于下一步的篩選；4)抗菌基因的篩選硫酸銨沉淀法提取步驟3)中含抗線蟲基因的菌株的胞外粗蛋白，以空載體菌株為對照，濾紙片法測定粗蛋白的抑菌效果，抽提質(zhì)粒和基因測序，由此得到相應(yīng)的抗菌基因。優(yōu)選地，步驟1)中將連接體系轉(zhuǎn)化到大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞中，所述的感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌感受態(tài)hst08，提高轉(zhuǎn)化效率，減少基因的丟失。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：本發(fā)明中致死篩選過程首先讓抗菌肽在菌體內(nèi)部表達(dá)，最后分泌到胞外，體內(nèi)抗菌肽積累并起作用，使得篩選系統(tǒng)變得更加靈敏，且可以篩選出很多個潛在的抗菌肽的同時，對應(yīng)上相應(yīng)基因片段，抗線蟲基因篩選和粗蛋白抑菌篩選，可以在眾多的潛在抗菌肽中，篩選出具有抗線蟲或抗菌作用的基因。最后，芽孢桿菌本身就是一個生防菌，發(fā)現(xiàn)的新的抗菌肽在直接應(yīng)用方面具有很大的潛力。發(fā)現(xiàn)抗菌肽后，可以先通過基因測序確定基因序列，再通過各大數(shù)據(jù)庫的比對來初步確定是否為新的抗菌基因，如果比對無結(jié)果，則可以進(jìn)一步比對抗菌肽序列，最終確定是否為新的抗菌肽。附圖說明圖1為提取的總rna凝膠電泳檢測圖。共有3條泳道，1泳道為dl2000dnamaker，2、3泳道為總rna凝膠檢測結(jié)果。18srrna、28srrna條帶清晰。圖2為純化后的mrna凝膠電泳檢測圖。共有2條泳道，1泳道為dl2000dnamaker，2泳道為mrna凝膠檢測結(jié)果。mrna為彌散狀條帶。圖3為雙鏈cdna凝膠電泳檢測圖。共有2條泳道，1泳道為100bpdnaladder，2泳道為cdna凝膠檢測結(jié)果。cdna為彌散狀條帶。圖4、圖5分別為板藍(lán)根cdna文庫和半夏cdna文庫插入片段隨機(jī)pcr檢測圖。共50條泳道，13泳道為100bpdnaladder，其他泳道為隨機(jī)挑選的文庫中的菌株。圖6為含抗性基因致死模式圖。圖a為點樣12h后菌落形態(tài)圖，圖b為點樣24h后菌落形態(tài)圖。培養(yǎng)皿中左側(cè)菌落為空載體菌落，即對照菌落，右側(cè)菌落為致死菌株菌落，即測試菌菌落。圖7為致死菌掃描電鏡圖片。圖a為野生型枯草芽孢桿菌wb800菌株掃描電鏡圖，圖b為轉(zhuǎn)入pbe-s載體的空載體菌株掃描電鏡圖，圖c為致死菌菌株掃描電鏡圖。圖8為測試菌粗蛋白抑菌效果圖。圖中指示菌為野生型枯草芽孢桿菌wb800，白色圓圈為濾紙片，濾紙片周圍出現(xiàn)抑菌圈的粗蛋白為測試菌粗蛋白，濾紙片周圍沒有出現(xiàn)抑菌圈的粗蛋白為空載體菌株粗蛋白。圖9為濾紙片法篩選抗線蟲基因效果圖。圖a為對照野生型枯草芽孢桿菌wb800濾紙片下線蟲和蟲道分布圖，圖b為測試菌濾紙片下線蟲和蟲道分布圖。具體實施方式實施例1：板藍(lán)根中抗菌基因的篩選1.板藍(lán)根cdna文庫的制備：(1)將板藍(lán)根培育至4周后，接種玉米紋枯病病原菌agi-ia，封口膜密封保濕。誘導(dǎo)板藍(lán)根抗性基因的大量表達(dá)，每隔6h取樣一次，取完后立即于-70℃超低溫保存?zhèn)溆?，直至板藍(lán)根葉片發(fā)病，不再取樣。用細(xì)胞總rna提取試劑trizol，大量提取板藍(lán)根葉片總rna，富集后濃度為2600ng/μl。取5μlrna凝膠電泳，檢測rna質(zhì)量(見圖1)，剩下的于-70℃超低溫保存?zhèn)溆?，直到總體積達(dá)到500μl，進(jìn)行純化。(2)磁珠法分離純化mrna(isolationsystems)，按照實驗手冊進(jìn)行實驗，如果純化濃度低，可用多個磁珠富集，純化出mrna后所測濃度為260ng/μl，取5μlmrna凝膠電泳，檢測mrna質(zhì)量(見圖2)，剩下mrna立即反轉(zhuǎn)錄。(3)設(shè)計含xbaⅰ酶切位點的oligodt合成cdna第一條鏈，以第一條鏈為模板合成cdna第二條鏈。cdna第一條鏈合成體系：mrna(5μg)11μl5×1ststrandsynthesisbuffer4μldntpmixture1μlrnaseinhibitor1μloligodtprimer(含xbaⅰ酶切位點)2μlrtnase1μl總體積20μl含xbaⅰ酶切位點的oligodt的序列為5’-acaggctctagagcttttttttttttttttttttttt-3’，用于mrna純化過程中結(jié)合mrna。mrna65℃加熱5min后，立即取出冰中放置5min(冷卻)。加入上述反應(yīng)液室溫放置10min，轉(zhuǎn)移到42℃恒溫水浴槽內(nèi)(可以在pcr儀中做)反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后放置冰中冷卻2min。cdna第二條鏈合成體系：在第一條鏈合成后的微量離心管中再加入下面反應(yīng)液，全量142μl：5×2ststrandsynthesisbuffer30μldntpmixture3μlrnase-freeh2o89μl加入2μle.colidnapolymerasel和2μle.colirnaseh/e.colidnaligasemixture，輕輕混勻，16℃反應(yīng)2h；70℃加熱10min，取出室溫放置5min；加入4μl的t4dnapolymerase，輕輕混勻，37℃反應(yīng)10min；向第二條鏈cdna合成反應(yīng)液(150μl)中加入rnase-freeh2o至終體積500μl，再加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)溶液，vortex震蕩5-10s；室溫下15000rpm離心5min，小心取出上層水相至另一個新的微量離心管中；加入1/10體積(50μl)的3m醋酸鈉(ph5.2)，2.5倍量的100％乙醇，均勻混合后，立即在15000rpm下離心30min；棄上清，用70％乙醇清洗，可重復(fù)一次；干燥沉淀后，用20μl的rnase-freeh2o溶解沉淀(檢測結(jié)果見圖3)，濃度為1300ng/μl，于-20℃保存，便于后面加接頭用。制備含ndeⅰ酶切位點的接頭的方法：按照合成單上的說明將合成的寡核苷酸溶于相應(yīng)體積的雙蒸水或tebuffer中，使?jié)舛葹?00pm/μl。在pcr管中分別將ndeⅰ1和ndeⅰ2，ndeⅰ3和ndeⅰ4，ndeⅰ5和ndeⅰ6等量混合，并加入1/10體積的10×pcrbuffer。在pcr儀中95℃加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫(20-25℃，以下相同)。形成的接頭如下：再將接頭ndeⅰ1/ndeⅰ2，ndeⅰ3/ndeⅰ4和ndeⅰ5/ndeⅰ6等量混合，保存于-20℃，以備后用。加上含ndeⅰ酶切位點的接頭(primescripttmdoublestrandcdnasynthesiskit)，加ndeⅰ接頭體系：cdna3μl10×t4dnaligasebuffer2μlndeⅰadaptor0.5μlt4dnaligase1μlddh2o13.5μl總體積20μl輕輕混勻后，16℃反應(yīng)10h左右。70℃保溫30min，室溫放置5min后，立即雙酶切處理。雙酶切載體體系：輕輕混勻后，37℃反應(yīng)3-4h。利用pcr切膠回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物中的大片段，用15μl-20μl的ddh2o洗脫，用分光光度計檢測濃度為1000ng/μl，回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌檢測是否酶切完全。雙酶切cdna體系：10×mbuffer4μlndeⅰ2μlxbaⅰ2μlcdna20μlddh2o12μl總體積20μl輕輕混勻后，37℃反應(yīng)3-4h。利用pcr清潔回收試劑盒去除雙酶切產(chǎn)物，用15μl-20μl的ddh2o洗脫，用分光光度計檢測濃度為1000ng/μl，以備后面連接載體。(4)cdna連接載體：將加完接頭的cdna雙酶切后連到含173種信號肽的信號肽庫質(zhì)粒pbe-s(購自寶生物工程有限公司)上，重組蛋白的表達(dá)分泌和信號肽的種類密切相關(guān)，在載體上連接一個信號肽庫，有利于篩選不同的分泌蛋白。連接體系：cdna12μlpbe-s1μl10xt4dnaligasebuffer2μlt4dnaligase1μlddh2o4μl總體積20μlpcr儀中16℃保溫3-5h，此20μl連接溶液可以做后面轉(zhuǎn)化用。(5)將連接體系先轉(zhuǎn)化到大腸桿菌高效感受態(tài)hst08(購自武漢友名生物工程有限公司)中，涂平板大量擴(kuò)增重組質(zhì)粒，群體提質(zhì)粒后再轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌wb800菌株(購自上海北諾生物科技有限公司)，挑取挑取不少于2000個轉(zhuǎn)化子，保存?zhèn)溆茫员氵M(jìn)行后續(xù)重組蛋白的分泌表達(dá)。2.致死菌株的篩選(1)將轉(zhuǎn)化子在標(biāo)記抗性卡那霉素終濃度為10μg/ml的lb培養(yǎng)基中搖培過夜后，于相同抗性的平板上點樣，定期觀察菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)原本長勢很好的菌株，在生長到一定時間后開始慢慢死去，菌落從厚實致密的形態(tài)慢慢消解，變成透明或半透明狀(見圖6)，掃描電鏡觀察致死菌株菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)該菌株菌體扭曲形變或中間變空(見圖7)。初步確認(rèn)，該基因具有致死作用。我們用這個方法共篩選到60個致死菌株，選取編號為915的菌株進(jìn)行后續(xù)驗證。(2)將915的菌株搖培8-12h后提取質(zhì)粒，重新轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌wb800，仍出現(xiàn)致死表型，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌野生菌株168(由本實驗室保存)中，也出現(xiàn)了致死表型，而空載體菌株不出現(xiàn)致死現(xiàn)象。進(jìn)一步表明致死表型由插入的基因引起，即插入的基因起致死作用，該基因作為下一步的候選基因。3.抗線蟲基因的篩選濾紙片法：于ngm平板兩側(cè)放上0.22μm的有機(jī)濾膜，將搖培72h后的915菌株與枯草芽孢桿菌wb800菌株分別置于濾膜上，生長12h后，揭開濾膜點上大腸桿菌op50，培養(yǎng)12h后，在中間點上l4stage秀麗隱桿線蟲70-80只，10h后統(tǒng)計兩側(cè)菌落內(nèi)的線蟲數(shù)量(見圖9)，經(jīng)多次、大量篩選后，得出的數(shù)據(jù)如下：915分泌物處共有線蟲263只，另一側(cè)wb800菌株分泌物處共有682只，以選擇指數(shù)為指標(biāo)(選擇指數(shù)＝(測試菌中線蟲數(shù)量-對照菌中線蟲數(shù)量)/線蟲總數(shù))，915選擇指數(shù)為-44.34％(選擇指數(shù)小于-30％的轉(zhuǎn)化子具有抗線蟲作用)，可以確定915菌株分泌物具有一定的抗線蟲作用，用于下一步的篩選。4.抗菌基因的篩選將915菌株在含卡那霉素終濃度為10μg/ml的抗性lb平板上活化2代之后轉(zhuǎn)入50ml相同抗性lb中搖培12h，再按2％接種量接種至200ml相同抗性lb中于37℃中搖培發(fā)酵72h，取30ml上清用硫酸銨沉淀的方法提取粗蛋白，用pbs溶解蛋白，透析除去鹽離子。以空載體菌株為對照，濾紙片法測定該基因的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)915菌株對枯草芽孢桿菌wb800(見圖8)、空載體菌株、青枯病原菌、白葉枯病原菌等多種細(xì)菌具有一定的抑菌效果。對915菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取，并測序拿到基因序列后，在各大數(shù)據(jù)庫中并未比對到任何結(jié)果，將對應(yīng)的蛋白序列進(jìn)行比對，也沒有比對到結(jié)果，可以確定，該基因為新的抗菌基因。實施例2：半夏中抗菌基因的篩選1.半夏cdna文庫的制備：將健康的半夏從培養(yǎng)缽中取出，塊莖用無菌水沖洗干凈后，用無菌的注射器針頭在每個健康的塊莖上扎7-10個孔，放入搖培好的半夏軟腐病菌菌液中浸泡15-20min后取出，重新栽種到培養(yǎng)缽中，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，誘導(dǎo)半夏抗性基因的大量表達(dá)，每隔6h取樣一次，取完后立即于-70℃超低溫保存?zhèn)溆?，直至半夏根基發(fā)病，不再取樣。用細(xì)胞總rna提取試劑trizol，大量提取半夏葉片總rna，富集后濃度為9675ng/μl。取5μlrna進(jìn)行凝膠電泳，檢測rna質(zhì)量，剩下的于-70℃超低溫保存?zhèn)溆?，直到總體積達(dá)到500μl，進(jìn)行純化。(2)磁珠法分離純化mrna(isolationsystems)，按照實驗手冊進(jìn)行實驗，如果純化濃度低，可用多個磁珠富集，純化出mrna后所測濃度為188ng/μl，取5μlmrna凝膠電泳，檢測mrna質(zhì)量，剩下mrna立即反轉(zhuǎn)錄。(3)設(shè)計含xbaⅰ酶切位點的oligodt合成cdna第一條鏈，以第一條鏈為模板合成cdna第二條鏈。cdna第一條鏈合成體系：含xbaⅰ酶切位點的oligodt的序列為5′-acaggctctagagcttttttttttttttttttttttt-3′，用于mrna純化過程中結(jié)合mrna。mrna65℃加熱5min后，立即取出冰中放置5min(冷卻)。加入上述反應(yīng)液室溫放置10min，轉(zhuǎn)移到42℃恒溫水浴槽內(nèi)(可以在pcr儀中做)反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后放置冰中冷卻2min。cdna第二條鏈合成體系：在第一條鏈合成后的微量離心管中再加入下面反應(yīng)液，全量142μl：加入2μle.colidnapolymerasel和2μle.colirnaseh/e.colidnaligasemixture，輕輕混勻，16℃反應(yīng)2h；70℃加熱10min，取出室溫放置5min；加入4μl的t4dnapolymerase，輕輕混勻，37℃反應(yīng)10min；向第二條鏈cdna合成反應(yīng)液(150μl)中加入rnase-freeh2o至終體積500μl，再加入等量的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)溶液，vortex震蕩5-10s；室溫下15000rpm離心5min，小心取出上層水相至另一個新的微量離心管中；加入1/10體積(50μl)的3m醋酸鈉(ph5.2)，2.5倍量的100％乙醇，均勻混合后，立即在15000rpm下離心30min；棄上清，用70％乙醇清洗，可重復(fù)一次；干燥沉淀后，用20μl的rnase-freeh2o溶解沉淀，濃度為567ng/μl，于-20℃保存，便于后面加接頭用。含ndeⅰ酶切位點的接頭的制備方法參見實施例1。加含ndeⅰ酶切位點的接頭體系：cdna2μl10×t4dnaligasebuffer2μlndeⅰadaptor1μlt4dnaligase1μlddh2o14μl總體積20μl輕輕混勻后，16℃反應(yīng)10h左右。65℃保溫30min，室溫放置5min后，立即雙酶切處理。雙酶切cdna體系：10×mbuffer4μlndeⅰ2μlxbaⅰ2μl加過接頭cdna20μlddh2o12μl總體積20μl輕輕混勻后，37℃反應(yīng)3-4h。利用pcr清潔回收試劑盒去除雙酶切產(chǎn)物，用40μl的ddh2o洗脫，用分光光度計檢測濃度為23.5ng/μl，以備后面連接載體。搖培活化含空載體的大腸桿菌菌株，按照試劑盒方法提取質(zhì)粒，濃度為550ng/μl。雙酶切載體體系：10×greenbuffer6μlndeⅰ3μlxbaⅰ3μlpbe-s7μlddh2o41μl總體積60μl輕輕混勻后，37℃反應(yīng)3-4h。利用pcr切膠回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物中的大片段，用25μl的ddh2o洗脫，用分光光度計檢測濃度為58ng/μl，回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌檢測是否酶切完全。(4)cdna連接載體：將加完接頭的cdna雙酶切后連到含173種信號肽的信號肽庫質(zhì)粒pbe-s(購自大連寶生物科技有限公司)上，重組蛋白的表達(dá)分泌和信號肽的種類密切相關(guān)，在載體上連接一個信號肽庫，有利于篩選不同的分泌蛋白。連接體系：cdna6.5μlpbe-s6μl10×t4dnaligasebuffer2μlt4dnaligase1μlddh2o4.5μl總體積20μlpcr儀中16℃保溫3-5h，此20μl連接溶液可以-20℃保存，以便后面轉(zhuǎn)化使用。(5)將連接體系先轉(zhuǎn)化到大腸桿菌高效感受態(tài)hst08中，涂平板大量擴(kuò)增重組質(zhì)粒，群體提質(zhì)粒，濃度為1958ng/μl。再轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌wb800菌株，挑取2039個轉(zhuǎn)化子，保存?zhèn)溆?，以便進(jìn)行后續(xù)重組蛋白的分泌表達(dá)。2.致死菌株的篩選(1)將轉(zhuǎn)化子在標(biāo)記抗性kanamycin終濃度為10μg/ml的lb培養(yǎng)基中搖培過夜后，于相同抗性的平板上點樣，定期觀察菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)原本長勢很好的菌株，在生長到一定時間后開始慢慢死去，菌落從厚實致密的形態(tài)慢慢消解，變成透明或半透明狀，掃描電鏡觀察致死菌株菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)該菌株，菌體扭曲形變或中間變空。初步確認(rèn)，該基因具有致死作用。我們用這個方法共篩選到95個致死菌株，選取編號為1366的菌株進(jìn)行后續(xù)驗證。(2)將1366菌株搖培8-12h后提取質(zhì)粒，重新轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌wb800，仍出現(xiàn)致死表型，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌野生菌株168中，也出現(xiàn)了致死表型，而空載體菌株不出現(xiàn)致死現(xiàn)象。進(jìn)一步表明致死表型由插入的基因引起，即插入的基因起致死作用，該基因作為下一步的候選基因。3.抗線蟲基因的篩選濾紙片法：于ngm平板兩側(cè)放上0.22μm的有機(jī)濾膜，將搖培72h后的1366菌株與枯草芽孢桿菌wb800菌株分別置于濾膜上，生長12h后，揭開濾膜點上大腸桿菌op50，培養(yǎng)12h后，在中間點上l4stage秀麗隱桿線蟲70-80只，10h后統(tǒng)計兩側(cè)菌落內(nèi)的線蟲數(shù)量，經(jīng)多次、大量篩選后，得出的數(shù)據(jù)如下：1366分泌物處共有線蟲644只，另一側(cè)wb800菌株分泌物處共有1369只，以選擇指數(shù)為指標(biāo)(選擇指數(shù)＝(測試菌中線蟲數(shù)量-對照菌中線蟲數(shù)量)/線蟲總數(shù))，1366選擇指數(shù)為-36.02％(選擇指數(shù)小于-30％的轉(zhuǎn)化子具有抗線蟲作用)，可以確定1366菌株分泌物具有一定的抗線蟲作用，用于下一步篩選。4.抗菌基因的篩選將1366菌株在含卡那霉素終濃度為10μg/ml的抗性lb平板上活化2代之后轉(zhuǎn)入50ml相同抗性lb中搖培12h，在按2％接種量接種至200ml相同抗性lb中于37℃中搖培發(fā)酵72h，取30ml上清用硫酸銨沉淀的方法提取粗蛋白，用pbs溶解蛋白，透析除去鹽離子。以空載體菌株為對照，濾紙片法測定該基因的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)1366菌株對wb800、空載體菌株、青枯病原菌，白葉枯病原菌等多種細(xì)菌具有一定的抑菌效果。對1366菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取，并測序拿到基因序列后，在各大數(shù)據(jù)庫中并未比對到任何結(jié)果，將對應(yīng)的蛋白序列進(jìn)行比對，也沒有比對到結(jié)果，可以確定，該基因為新的抗菌基因。以上列舉的僅是本發(fā)明的2個具體實施例，本發(fā)明的實驗材料可以是其他植物，例如大蒜、玉米等可食用作物，金銀花、魚腥草等藥用植物，還可以是哈茨木霉等生防菌?？咕蚝Y選中選用的指示菌還可以是果斑病原菌、潰瘍病原菌、水稻細(xì)菌性條斑病病原菌等各種死體營養(yǎng)性病原細(xì)菌。當(dāng)前第1頁12