人工抗菌肽ma-d4的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及人工抗菌肽MA-D4的制備方法及其應用。本發(fā)明人工設計出人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列，并采用大腸桿菌偏好性密碼子設計編碼該抗菌肽的核苷酸序列；采用重疊區(qū)擴增基因拼接法合成目的基因，構建原核表達載體，并轉化至大腸桿菌BL21或Rosetta中誘導表達；表達產物經(jīng)腸激酶酶切處理和鎳離子親和層析純化后，即可獲得本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4。該抗菌肽具備較強的廣譜抗菌活性，可抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌，同時不具有溶血活性。因此，其可作為一類新型抗菌藥物，在食品防腐、疾病治療等方面具有良好的應用前景，極具開發(fā)潛力。本發(fā)明制備方法表達效率高，分離純化簡單，生產成本低，穩(wěn)定性好，可應用于規(guī)模化生產。
【專利說明】人工抗菌肽MA-D4的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及人工抗菌肽MA-D4的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]抗生素長期在臨床治療上廣泛地不恰當應用，使得許多病原菌產生了明顯耐藥性，現(xiàn)已成為威脅人類和動物健康的重大問題。更為嚴重的是臨床上出現(xiàn)了多重耐藥菌株，2010年發(fā)現(xiàn)的超級病菌NDM-1更是對絕大多數(shù)抗生素均不敏感。目前，開發(fā)一種新的抗生素一般需要10年左右，而產生一代耐藥菌只需2年。抗感染形勢非常嚴峻，開發(fā)設計新型抗菌藥物已迫在眉睫。
[0003]抗菌肽是一類由宿主產生的能夠抵抗外界病原體感染的小分子多肽，是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，由特定基因編碼產生。其生物功能具有多樣性，除了具備廣譜抗菌活性外，還具備抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲等生物活性。抗菌肽廣泛存在于各種生物體內，在微生物、植物和動物中均有發(fā)現(xiàn)并成功分離獲得。在適當?shù)臐舛认?，抗菌肽能夠與生物膜/壁組成成分或胞內細胞器等多種微生物靶位相互作用，前者破壞細胞質膜的完整性，后者干擾細胞的正常代謝活動，最終導致細菌死亡。更重要的是抗菌肽能作為免疫效應分子，啟動和調節(jié)宿主免疫防御體系，保護宿主免受病原微生物侵害?？咕莫毺氐淖饔脵C理，使得其具有抗菌譜廣泛、不易產生耐藥性等特點，且對目前已產生耐藥性的菌株同樣可發(fā)揮作用。因此，抗菌肽或能替代傳統(tǒng)抗生素藥品，扭轉抗生素應用的惡性循環(huán)，是一類具備廣闊的市場前景和發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬铩?br> [0004]蛙類皮膚裸露、潮濕，是極好的微生物生存環(huán)境，但蛙類基于適應生存環(huán)境的需要，在長期的自然選擇中，逐漸形成了防御機制，即由皮膚分泌多種結構特殊、功能多樣的抗菌肽類物質，用以抵抗病原微生物的侵襲。從非洲爪蛙皮膚上發(fā)現(xiàn)的爪蟾抗菌肽Magainin，具有23個氨基酸殘基，分子量約為2.5kD。其天然分離物在微克分子濃度下即可對多種細菌、真菌、原生生物、腫瘤細胞和病毒表現(xiàn)出殺傷作用。從葉泡蛙皮膚上發(fā)現(xiàn)的抗菌肽Dermaseptin-4,同樣具有23個氨基酸殘基,分子量約為2.5kD。其天然分離物可對多種細菌、真菌和原生生物表現(xiàn)出殺傷作用，尤其是致病性絲狀真菌和酵母菌。
[0005]生物體內抗菌肽含量較低，直接提取的工藝要求高，難度大，無法應用于規(guī)?；a。人工化學合成雖可獲得與天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正確的空間結構，且因存在昂貴的成本，使其目前僅停留在實驗室試驗階段。通過基因工程途徑合成人工抗菌肽是規(guī)模化生產制備的理想選擇。除此之外，天然抗菌肽的生物活性不強、存在細胞毒性和溶血活性使其推廣應用受到一定的限制。研究表明，雜合不同抗菌肽分子可以有效改善其生物活性，消除或降低其細胞毒性和溶血活性。迄今尚無將抗菌肽Magainin和Dermaseptin-4雜合并進行高效表達的報道。

【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有天然抗菌肽生物活性低，且存在溶血活性的問題，提供一種具有高生物活性、無溶血活性的人工抗菌肽MA-D4，以及適用于規(guī)模化生產的基于大腸桿菌表達系統(tǒng)的高效制備方法，同時提供人工抗菌肽MA-D4針對多種細菌的應用。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)。
[0008]根據(jù)GenBank 中的抗菌妝 Magainin (N0.474452717)和 Dermaseptin-4 (N0.P84924.1)成熟肽氨基酸序列，人工設計出本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列SEQ IDN0.1，采用大腸桿菌偏好性密碼子設計編碼該抗菌肽的核苷酸序列，并在兩端分別添加核酸限制性內切酶識別位點，形成目的基因序列SEQ ID N0.2。
[0009]采用重疊區(qū)擴增基因拼接法合成上述目的基因。設計兩兩互補的4條PCR引物，所述引物 P1、P2、P3 和 P4 分別具有 SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，通過多步PCR獲得目的基因。
[0010]將獲得的目的基因與原核表達質粒pET-32a(+)連接，構建原核表達載體，并轉化至大腸桿菌BL21或Rosetta中，篩選基因工程陽性菌。添加IPTG誘導基因工程菌表達，超聲波裂解菌體后進行SDS-PAGE，檢測蛋白表達量。
[0011]使用腸激酶酶切處理表達產物后，通過鎳離子親和層析純化獲得本發(fā)明人工抗菌肽 MA-D4。
[0012]通過微量稀釋法測定人工抗菌肽MA-D4對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、豬鏈球菌2型和炭疽桿菌的最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。
[0013]通過測定抗菌肽MA-D4針對小鼠紅細胞的溶血率，判斷其溶血性。
[0014]本發(fā)明具有積極有益的效果。
[0015]本發(fā)明依據(jù)GenBank中的抗菌肽Magainin和Dermaseptin-4成熟肽氨基酸序列，人工設計出本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4，并采用大腸桿菌偏好性密碼子設計編碼該抗菌肽的核苷酸序列，通過原核表達系統(tǒng)大量獲取人工抗菌肽MA-D4。經(jīng)實驗證明本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4具備較強的廣譜抗菌活性，可抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，同時不具有溶血活性。因此，其可作為一類新型抗菌藥物，在食品防腐、疾病治療等方面具有良好的應用前景，極具開發(fā)潛力。
[0016]本發(fā)明制備方法表達效率高，分離純化過程簡單，生產成本低，穩(wěn)定性好，可應用于規(guī)?；a。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1目的基因的多步PCR擴增。
[0018]M.DNA分子量標準；1.目的基因前半部分PCR擴增產物；2.目的基因后半部分PCR擴增產物；3.完整目的基因PCR擴增產物。
[0019]圖2通過鎳離子親和層析法純化人工抗菌肽MA-D4。
[0020]M.蛋白質分子量標準；1.純化處理的溶液；2.未純化處理的溶液。
[0021 ] 圖3人工抗菌肽MA-D4溶血活性檢測。
【具體實施方式】
[0022]實施例1:構建原核表達載體和基因工程菌。[0023]根據(jù)GenBank 中的抗菌妝 Magainin (N0.474452717)和 Dermaseptin-4 (N0.P84924.1)成熟肽氨基酸序列，將抗菌肽Magainin第21位的甲硫氨酸(Met)替換成色氨酸(Trp)，人工設計出本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列SEQ ID N0.1，其中DDDDK為腸激酶酶切位點。之后采用大腸桿菌偏好性密碼子設計編碼該抗菌肽的核苷酸序列，并在兩端分別添加核酸限制性內切酶通ο和及麗71識別位點，形成目的基因，序列如SEQ ID N0.2所示。
[0024]設計的目的基因序列為5' -cacctcgaggatgatgatgataaacatcatggtattggtaaatttctgcatagcgcaaaaa
aatttggtaaagcatttgttggtgaaatttggaatagccatcatgcactgtggaaagatattctgaaaaatgcaggtaaagcagcactgaatgaaattaatcagattgttcagcatcatgatgatgatgataaaggatccaat-3r ，總序列共有204bp，下劃線分別為核酸限制性內切酶ZAo I和及?" Λ別位點。
[0025]采用重疊區(qū)擴增基因拼接法合成上述目的基因。設計兩兩互補的4條PCR引物，其中Ρ1、Ρ2之間，Ρ2、Ρ3之間和Ρ3、Ρ4之間均含有15個重疊堿基。所述引物Ρ1、Ρ2、Ρ3和Ρ4 分別具有 SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 所示的核苷酸序列，由廣州英駿生物有限公司合成。
[0026]使用上述引物進行多步PCR獲得目的基因。先以Pl和Ρ2為引物擴增目的基因前半部分序列，再以Ρ3和Ρ4為引物擴增目的基因后半部分序列，最后以前兩次PCR產物為模板，Pl和Ρ4為引物擴增獲得完整的目的基因。反應體系(50yL)如下:2XTaq PCRMastermix 25 μ L，上游引物和下游引物各1.0 μ L，ddH20 23 μ L0 PCR程序如下:95°C預變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)30次；72°C終延伸lOmin。反應結束后使用1.0%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析，參見附圖1。產物經(jīng)深圳華大基因科技服務有限公司測序，確認與設計完全一致，置于-20°C保存。
[0027]使用通O)和核酸限制性內切酶對獲得的目的基因和原核表達質粒pET-32a(+)同時進行雙酶切操作。純化酶切產物后，將目的基因片段與pET-32a(+)質粒連接，構建原核表達載體，并轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS或Rosetta中，利用氨節(jié)西林鑒定篩選基因工程陽性菌。在200mL的LB液態(tài)培養(yǎng)基中添加IPTG大規(guī)模誘導基因工程菌表達目的蛋白，于4°C下5000r/min離心IOmin收集菌體，使用PBS清洗三次后超聲波裂解菌體，12000r/min離心15min后收集上清液進行SDS-PAGE，檢測目的蛋白表達量。
[0028]實施例2:獲取和純化人工抗菌肽MA-D4。
[0029]使用腸激酶按下述酶切體系對表達產物進行酶切處理:10XBuffer 10.0 μ L,ddH20 38.Ομ L,目的蛋白 50.0 μ L，腸激酶 2.Ομ L，置于 23。。下 20h。
[0030]利用Thermo Scientific 公司的 HisPur N1-NTA Spin Purification Kit,通過鎳離子親和層析純化獲得本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4。按說明書預處理樹脂柱后，加入與High-capacity nickel-1MAC resin等量的酶切處理過的上清液,置于4°C環(huán)境中結合Ih后，洗脫蛋白，收集洗脫液進行SDS-PAGE檢測，參見附圖2?？梢?.6-10.0kD之間有明顯的蛋白條帶，符合實驗設計大小，即為人工抗菌肽MA-D4。通過Bradford法測定其濃度為486.75 μ g/mL。
[0031 ] 實施例3:人工抗菌肽MA-D4生物活性檢測。[0032]通過微量稀釋法測定人工抗菌肽MA-D4對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、豬鏈球菌2型和炭疽桿菌的最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。具體實驗步驟如下:將實驗菌株制備成106cfu/mL的菌液，分別加入96孔細胞培養(yǎng)板內，每孔90 μ L0使用PBS將人工抗菌肽MA-D4溶液分別稀釋成40.0,20.0、10.0,8.0,6.0,4.0、2.0、1.0、0.5 μ g/mL,并加入96孔細胞培養(yǎng)板內，每孔10 μ L。設置空白對照組僅含LB液態(tài)培養(yǎng)基，條件對照組僅含有實驗菌株的菌液，酶切對照組添加有未經(jīng)腸激酶處理的目的蛋白溶液和實驗菌株的菌液。置于37°C培養(yǎng)箱中過夜，翌日測定每孔的649_?值?？赏耆种萍毦L的最低溶液濃度即為人工抗菌肽MA-D4針對該實驗菌株的MIC。將MIC以上的組按1:100比例接種LB液態(tài)培養(yǎng)基，并取其中100 μ L均勻涂布在LB固態(tài)培養(yǎng)基上，置于37°C培養(yǎng)箱中12h后，進行菌落計數(shù)。固態(tài)培養(yǎng)基上少于5個菌落的最高溶液濃度即為人工抗菌肽MA-D4針對該實驗菌株的MBC。人工抗菌肽MA-D4對以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌、以豬鏈球菌2型為代表的革蘭氏陽性菌和目前耐藥性最嚴重的金黃色葡萄球菌均具有生物活性，說明其具有廣譜抗菌活性。
[0033]各實驗菌株的MIC和MBC單位:μ g/mL
【權利要求】
1.一種人工抗菌肽MA-D4，其特征在于，其是具備序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的多肽，或由SEQ ID N0.1所示氨基酸序列經(jīng)過環(huán)化、N末端和/或C末端修飾、L-型氨基酸和D-型氨基酸互相轉變、序列末端缺失中的至少一種處理而得到的功能等同的多肽。
2.一種多核苷酸，其特征在于，其是具備序列表中SEQ ID N0.2所示核苷酸序列或與之互補的多核苷酸，可編碼SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。
3.—種載體,其特征在于,具備權利要求2所述的多核苷酸。
4.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，具備權利要求3所述的載體。
5.權利要求1所述的人工抗菌肽MA-D4的制備方法，包括如下步驟: (1)根據(jù)GenBank中的抗菌肽Magainin和Dermaseptin_4成熟肽氨基酸序列，人工設計出本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列SEQ ID N0.1，之后采用大腸桿菌偏好性密碼子設計編碼該抗菌肽的核苷酸序列，并在兩端分別添加核酸限制性內切酶識別位點，形成目的基因序列SEQ ID N0.2 ； (2)采用重疊區(qū)擴增基因拼接法合成上述目的基因，設計兩兩互補的4條PCR引物，通過多步PCR獲得的目的基因； (3)將獲得的目的基因與原核表達質粒pET-32a(+)連接，構建原核表達載體，并轉化至大腸桿菌BL21或Rosetta中，篩選基因工程陽性菌； (4)添加IPTG誘導基因工程菌表達，超聲波裂解菌體后進行SDS-PAGE，檢測蛋白表達量; (5)使用腸激酶酶切處理表達.產物后，通過鎳離子親和層析純化獲得本發(fā)明人工抗菌肽 MA-D4。
6.根據(jù)權利要求5所述的人工抗菌肽MA-D4的制備方法，其特征在于，所述目的基因序列如SEQ ID N0.2所示。
7.根據(jù)權利要求5所述的人工抗菌肽MA-D4的制備方法，其特征在于，所述4條PCR引物序列如SEQ ID N0.3~5所示。
8.權利要求1所述的人工抗菌肽MA-D4的應用，其特征在于，應用于制備抗菌劑。
9.權利要求8所述的人工抗菌肽MA-D4應用于制備抗菌劑，其特征在于，針對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、豬鏈球菌2型和炭疽桿菌。
【文檔編號】A61K38/16GK103467580SQ201310427278
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權日:2013年9月18日
【發(fā)明者】劉誠 申請人:劉誠