一種肝腸膽固醇吸收的關(guān)鍵蛋白質(zhì)Numb 及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肝腸膽固醇吸收的關(guān)鍵蛋白質(zhì)Numb及其用途。具體地，公開了Numb蛋白抑制劑在調(diào)節(jié)膽固醇吸收中的用途，以及Numb蛋白與NPC1L1蛋白相互結(jié)合的抑制劑的用途。本發(fā)明還公開了一種NPC1L1突變蛋白，該突變因不能與Numb相互結(jié)合從而減少NPC1L1蛋白介導(dǎo)的膽固醇吸收。
【專利說明】-種肝腸膽固醇吸收的關(guān)鍵蛋白質(zhì)Numb及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物分子領(lǐng)域，具體地，涉及Numb蛋白在膽固醇吸收中的作用。

【背景技術(shù)】
[0002] 膽固醇是一類具有環(huán)戊烷多氫菲基本結(jié)構(gòu)的留醇類小分子，廣泛存在于各種生物 體內(nèi)。它是生物膜結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組成成分，調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性和相變。膽固醇也是生命體必需 的膽汁酸、留醇類激素等合成的唯一前體原料，特別是細(xì)胞膜的生物學(xué)功能包括許多重要 的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞活動(dòng)如吞噬、細(xì)胞膜代謝等都必須要有膽固醇的參與。
[0003] 人體內(nèi)膽固醇的量受到嚴(yán)格的調(diào)控，膽固醇水平異常非常有害。大量研究表明，體 內(nèi)高水平膽固醇如高膽固醇血癥(特別是高水平低密度脂蛋白）可直接導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化， 是中風(fēng)和冠心病的主要病因，老年癡呆癥、肥胖癥、糖尿病等的發(fā)生也與膽固醇代謝紊亂密 切相關(guān)。隨著我國人飲食結(jié)構(gòu)的變化及社會(huì)老齡化，高水平膽固醇引發(fā)的膽固醇代謝性疾 病(如包括冠心病和中風(fēng)在內(nèi)的心腦血管疾病、老年癡呆癥等）越來越多。
[0004] 膽固醇代謝主要包括肝腸組織對飲食與膽汁中膽固醇的吸收、細(xì)胞內(nèi)源膽固醇的 起始性合成以及膽固醇酯化、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解等過程，是高等生物體內(nèi)必不可少的代謝途徑。生 物體主要通過三種途徑保持體內(nèi)的膽固醇代謝穩(wěn)定：起始性合成，肝腸吸收以及外排。雖然 在機(jī)體中能夠以簡單的乙酰輔酶A從頭合成膽固醇，但這一過程要消耗大量的能量。事實(shí) 上，機(jī)體需要從腸道和膽汁中吸收大量的膽固醇，這個(gè)過程發(fā)生在肝臟和小腸，故也稱為肝 腸膽固醇吸收。
[0005] 因此，本領(lǐng)域迫切需要對膽固醇代謝平衡調(diào)控分子機(jī)理的研究，從而揭示人體細(xì) 胞內(nèi)脂質(zhì)代謝調(diào)控的機(jī)制，開發(fā)預(yù)防和治療膽固醇代謝性疾病的藥物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了 Numb蛋白在膽固醇代謝的新用途，及Numb蛋白與NPClLl的相互作 用機(jī)制。
[0007] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種Numb蛋白抑制劑的用途，用于制備抑制膽固醇吸 收的藥物組合物。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述的Numb基因或蛋白來源于哺乳動(dòng)物，較佳地，來源于嚙齒 動(dòng)物或人，更佳地，來源于人。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的Numb基因核酸序列Genbank登錄號(hào)為NM_001005743. 1, 其編碼的蛋白序列Genbank登錄號(hào)為NP_001005743. 1。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑包括Numb蛋白的抗體、Numb核酸的反義RNA、 siRNA、shRNA、Numb蛋白的活性抑制劑。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的Numb基因核酸序列Genbank登錄號(hào)為NM_001005743. 1, 其編碼的蛋白序列Genbank登錄號(hào)為NP_001005743. 1。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物包括安全有效量的所述抑制劑作為活性成 分，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0013] 本發(fā)明第二方面，提供了一種篩選促進(jìn)或抑制膽固醇吸收的候選化合物的方法， 包括以下步驟：
[0014] (a)在測試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入所述的測試化合物，并觀察所述細(xì)胞的 Numb的表達(dá)量和/或活性；在對照組中，向同樣的細(xì)胞培養(yǎng)體系中不加入所述的測試化合 物，并觀察Numb的表達(dá)量和/或活性；和
[0015] (b)將測試組和對照組的Numb的表達(dá)量和/或活性進(jìn)行比較，如果測試組中Numb 的表達(dá)量和/或活性Al顯著高于對照組的Numb的表達(dá)量和/或活性A2,則表明該測試化 合物作為促進(jìn)膽固醇吸收的候選化合物；
[0016] 如果測試組中Numb的表達(dá)量和/或活性Al顯著低于對照組的Numb的表達(dá)量和 /或活性A2,則表明該測試化合物為抑制膽固醇吸收的候選化合物。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的Numb的表達(dá)量是通過RT-PCR檢測而得出的。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的顯著高于是A1/A2彡2 ;所述的顯著低于是A1/A2 < 0. 5。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，還包括步驟：
[0020] (c).對于步驟（b)中所得的候選化合物，進(jìn)一步測試其對NPClLl活性的影響和/ 或?qū)δ懝檀嘉盏挠绊憽?br> [0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的步驟（C)包括：
[0022] 在測試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物施用測試化合物，觀察Numb蛋白與 NPClLl蛋白相互結(jié)合強(qiáng)度；在對照組中，不向細(xì)胞培養(yǎng)體系和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物施用測試化合 物，觀察Numb蛋白與NPClLl蛋白相互結(jié)合強(qiáng)度；
[0023] 其中，Numb蛋白與NPClLl蛋白相互結(jié)合強(qiáng)度可通過常規(guī)方法測試獲得，一種優(yōu)選 的方法是通過免疫共沉淀的方法計(jì)算得出結(jié)合強(qiáng)度。若測試組中，所述相互結(jié)合強(qiáng)度顯著 低于對照組的Numb與NPClLl蛋白相互結(jié)合強(qiáng)度，則表明該測試化合物為抑制膽固醇吸收 的候選化合物。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述Numb蛋白與NPClLl蛋白結(jié)合作用強(qiáng)度指在加入膽固醇后， NPClLl內(nèi)吞膽固醇的情況和/或觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膽固醇吸收的情況，其中，
[0025] 若測試組中NPClLl內(nèi)吞和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物膽固醇吸收量為對照組的120%，則說明 該測試化合物為促進(jìn)膽固醇吸收的候選化合物；較佳地，為對照組的130%，更佳地，為對 照組的150% ;
[0026] 若測試組中NPClLl內(nèi)吞和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物膽固醇吸收量為對照組的80%，則說明該 測試化合物為抑制膽固醇吸收的候選化合物；較佳地，為對照組的60%，更佳地，為50%。
[0027] 本發(fā)明第三方面，提供了一種NPClLl突變蛋白，所述的突變蛋白具有以下特征：
[0028] (a)內(nèi)吞膽固醇的能力下降或喪失；或
[0029] (b)部分或全部缺失了野生型NPClLl蛋白C端的YVNxxF結(jié)構(gòu)域，或所述YVNxxF 結(jié)構(gòu)域的第1 一 3位和第6位發(fā)生突變，其中，X代表任意天然或非天然氨基酸。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白缺失C末端的至少22個(gè)氨基酸；
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白含有Tyr (1306位）缺失或突變。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白缺失C末端的27個(gè)氨基酸。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白的其他部分的序列與野生型NPClLl相同或基 本相同。
[0034] 本發(fā)明第四方面，提供了一種分離的DNA序列，所述的DNA序列編碼本發(fā)明第三方 面的NPClLl突變蛋白。
[0035] 本發(fā)明第五方面，提供了一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有本發(fā)明第四方面所 述的DNA序列。
[0036] 本發(fā)明第六方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞包括本發(fā)明第五方面所 述的表達(dá)載體；和/或所述的宿主細(xì)胞基因中含有本發(fā)明第四方面所述的DNA序列。
[0037] 本發(fā)明第七方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白含有本發(fā)明第三方面所述 的NPClLl突變蛋白以及與所述突變蛋白融合在一起的融合元件。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合元件包括但不限于Myc元件、T7元件,Flag元件,HA 元件。
[0039] 本發(fā)明第八方面，還提供了一種調(diào)節(jié)膽固醇吸收的方法，包括步驟：給需要治療的 對象施用安全有效量的Numb抑制劑，從而抑制膽固醇的吸收。
[0040] 本發(fā)明還提供了一種Numb基因或蛋白或其促進(jìn)劑的用途，用于制備促進(jìn)膽固醇 吸收的藥物或制劑。
[0041] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0042] 圖IA顯示了 NPC1L1C端氨基酸示意圖，NPC1L1C端缺失不同長度的氨基酸。
[0043] 圖IB顯示了在CRL1601細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染NPC1L1C端缺失不同長度的質(zhì)粒，24小時(shí)后， 抽提膽固醇后再給與膽固醇，用抗Myc抗體（9E10)和熒光二抗標(biāo)記后，共聚焦顯微鏡觀察， 可見當(dāng)缺失22和27個(gè)氨基酸時(shí)，給予膽固醇時(shí)NPClLl內(nèi)吞速度減慢，仍然定位在質(zhì)膜上。
[0044] 圖IC顯示了分別將NPClLl蛋白1306-1311位各個(gè)氨基酸突變?yōu)楸彼?，轉(zhuǎn)染 CRL1601細(xì)胞，24小時(shí)后，4%PFA固定細(xì)胞15min，0. 2%triton X-100通透細(xì)胞，熒光抗體染 色，封片后共聚焦顯微鏡在488nm，561nm激發(fā)光下觀察，由圖可見，當(dāng)Y1306，V1307，N1308， F1311點(diǎn)突變?yōu)楸彼釙r(shí)，細(xì)胞膜上的NPClLl明顯增多而H1309, S1310位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?則沒有影響NPClLl的細(xì)胞定位。
[0045] 圖ID顯示了 G結(jié)果的定量。用image pro軟件對20張顯微鏡圖片的紅色突光和 綠色熒光分別定量，以紅色熒光比綠色熒光的值定義為膜上NPClLl與總的NPClLl的量的 比值。各突變體的值與野生型相比為膜上NPClLl的相對量。
[0046] 圖IE顯示了幾種哺乳動(dòng)物NPC1L1C端部分蛋白序列比對。
[0047] 圖2A顯示了 YVNxxF motif突變減緩NPClLl介導(dǎo)的膽固醇吸收。在穩(wěn)定表達(dá)野 生型NPClLl和Y1306突變型NPClLl的細(xì)胞中，抽提膽固醇后，再遞送膽固醇不同的時(shí)間， 觀察NPClLl內(nèi)吞的快慢和膽固醇吸收的速度。
[0048] 圖2B顯示了 2A的定量結(jié)果。
[0049] 圖3A顯示了收取注射了野生型NPClLl腺病毒的小鼠的各個(gè)組織，勻漿后， Western Bloting檢測各個(gè)組織中NPClLl蛋白的表達(dá)情況。
[0050] 圖3B顯示了收取無腺病毒注射的對照組，和注射了 EGFP，NPC1L1-WT， NPC1L1-Y1306A腺病毒的小鼠的肝臟，勻漿后，Western Bloting檢測蛋白的表達(dá)情況。
[0051] 圖3C顯示了注射了野生型和突變型NPClLl的小鼠肝臟，固定后冰凍切片，Mrp抗 體免疫組化，熒光共聚焦顯微鏡觀察。
[0052] 圖3D顯示了分別檢測四組小鼠的膽汁中膽固醇，膽汁中膽汁酸，膽汁中磷脂肝臟 膽固醇，血液膽固醇，血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性等。Error bar表示標(biāo)準(zhǔn)誤。
[0053] 圖4A顯示了大腸桿菌體外表達(dá)純化得到GST Tag的NPClLl C端肽段SDS-PAGE 后，考馬斯亮藍(lán)染色觀察。
[0054] 圖4B顯示了 GST Tag的NPC1L1C端不同點(diǎn)突變的肽段與Numb-PTB的體外結(jié)合實(shí) 驗(yàn)。
[0055] 圖4C顯示了 biacore實(shí)驗(yàn)檢測含有YVNxxF的多肽與Numb-PTB的相互作用，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)只有野生型多肽能夠與Numb-PTB直接相互作用。
[0056] 圖4D顯示了膽固醇能夠增強(qiáng)Numb與NPClLl的相互作用。CRL1601細(xì)胞中，共轉(zhuǎn) 染NPC1L1-T7與Numb，24小時(shí)后，0. 5%NP40裂解細(xì)胞，anti-T7beads免疫沉淀。
[0057] 圖5A顯示了用包被有針對Numb的shRNA的腺病毒感染1D6細(xì)胞后檢測Numb蛋 白水平，可見Numb蛋白量大量減少。
[0058] 圖5B顯示了在⑶X處理60min后遞送膽固醇不同時(shí)間點(diǎn)，4%PFA固定細(xì)胞30min， filipin染色，封片后共聚焦顯微鏡在488nm激發(fā)光下觀察，可見在固定狀態(tài)下，NPClLl的 細(xì)胞定位發(fā)生了很大變化，與對照組不同，RNAiNumb后大量的NPClLl都定位在了細(xì)胞質(zhì)膜 上；在環(huán)化糊精處理后遞送膽固醇，RNAi Numb的細(xì)胞中，NPClLl內(nèi)吞速度明顯減慢，同時(shí)， 對照組隨著給予膽固醇時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)的膽固醇越來越多，而在RNA干擾Numb蛋白后， 細(xì)胞內(nèi)吞膽固醇受到明顯的抑制。
[0059] 圖5C顯示了分別對細(xì)胞內(nèi)和全細(xì)胞NPClLl蛋白和膽固醇進(jìn)行定量，分別計(jì)算出 細(xì)胞內(nèi)的NPClLK膽固醇)和占全細(xì)胞的比值。結(jié)果顯示，與對照組相比，在RNAi Numb后， 細(xì)胞內(nèi)NPClLl蛋白和膽固醇的含量占全細(xì)胞含量百分比有明顯差異。
[0060] 圖6A顯示了多肽-YVNHSF-對NPClLl C端肽段與Numb-PTB蛋白的競爭作用。
[0061] 圖 6B 顯示了 CD8a-NPClLl-C 融合蛋白示意圖，NPClLl-C (1266_1332a. a.)融合 在CD8a的C端。
[0062] 圖6C顯示了阻斷NPClLl與Numb的相互作用可抑制NPClLl的內(nèi)吞和膽固醇吸收。 CRL1601細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染NPC1L1-EGFP與野生型或突變型⑶8 a -NPClLl-C質(zhì)粒，48小時(shí)后， 細(xì)胞在低膽固醇培養(yǎng)基處理1小時(shí)，再換成高膽固醇培養(yǎng)基處理1小時(shí)，filipin染色，顯 微鏡觀察。
[0063] 圖6D顯示了 CD8 a -NPClLl-C可阻斷NPClLl-Numb相互作用。8周雄性ICR小鼠， 尾靜脈注射腺病毒，Ad-EGFP (2X IO8Pfu/ 只)，Ad-NPClLl-EGFP (2X IO8Pfu/ 只)，野生型與 突變型Ad-CD8 a-NPClLl-C (2X IO9Pfu/只)。4天后，禁食過夜，處死小鼠。收集小鼠肝臟 勻漿后，用抗EGFP的beads免疫共沉淀NPC1L1-EGFP與相互作用蛋白Numb。
[0064] 圖6E顯示了在小鼠中阻斷NPClLl與Numb的相互作用可影響NPClLl的膽固醇吸 收功能。收集6D小鼠血液，膽汁，測膽汁中總膽固醇，血液中總膽固醇，膽汁中磷脂水平。
[0065] 圖7A顯示了在注射tamoxifen后，觀察小鼠組織Numb蛋白的表達(dá)情況，由圖可 見，Numb蛋白在小腸中被特異性敲除，而在肝臟、肺中沒有減少。
[0066] 圖7B顯示了 Numb蛋白缺失阻止了 NPClLl蛋白受膽固醇調(diào)控的內(nèi)吞。
[0067] 圖7C顯示了 Numb蛋白缺失后小鼠膽固醇吸收減少。用雙標(biāo)同位素的方法。
[0068] 圖7D，E顯示了灌胃小鼠3H標(biāo)記的膽固醇，2小時(shí)后，檢測小鼠肝臟，血液中同位素 標(biāo)記的膽固醇的量明顯減少。
[0069] 圖8A顯示雄性6周齡野生型和小腸 Numb基因敲除小鼠（I-Numb+) (n=6/組）喂 養(yǎng)基礎(chǔ)飼料和高膽固醇飼料（40kcal%脂質(zhì)，0. 5%膽固醇）16周后，血液和肝臟膽固醇水平。 *ρ〈0· 01，**ρ〈0· 001。
[0070] 圖8Β顯示了 Western blot檢測膽固醇代謝重要蛋白的水平。
[0071] 圖8C顯示了喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料和高膽固醇飼料后的小鼠體重，肝重等指標(biāo)。
[0072] 圖9A顯示了 3XMyc-NPClLl-EGFP蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖。其中，NPClLl蛋白 共13次跨膜，質(zhì)膜外側(cè)有兩個(gè)較大loop結(jié)構(gòu)，3XMyc插入在第二個(gè)loop上，EGFP位于 C-termnal〇
[0073] 圖9B顯示了對篩選得到的穩(wěn)定表達(dá)3XMyc-NPClLl-EGFP的細(xì)胞株進(jìn)行功能驗(yàn) 證，由圖IB可見這一融合蛋白能夠響應(yīng)膽固醇水平的變化，在細(xì)胞內(nèi)定位不斷變化，從而 吸收膽固醇進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。膽固醇吸收抑制劑依折麥布能夠抑制NPClLl蛋白的內(nèi)吞和膽固 醇的吸收。

【具體實(shí)施方式】
[0074] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，首次公開了 Numb基因或蛋白在調(diào)節(jié)膽固醇吸 收中的用途，以及Numb蛋白與NPClLl蛋白的相互作用的用途。即抑制Numb蛋白活性或抑 制Numb蛋白與NPClLl蛋白相互作用可減少膽固醇的吸收。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了一種 NPClLl突變蛋白，且該突變會(huì)造成NPClLl蛋白的膽固醇吸收作用減弱。在此基礎(chǔ)上，完成 了本發(fā)明。
[0075] Numb 蛋白
[0076] Numb是一個(gè)在進(jìn)化上高度保守的蛋白，在細(xì)胞初始分裂中通過抑制Notch信號(hào)而 決定細(xì)胞命運(yùn)。與果蠅中只有一種Numb蛋白不同，在哺乳動(dòng)物中，由于mRNA的選擇性剪切 產(chǎn)生四種異構(gòu)體形式的Numb蛋白，分子量從65到72道爾頓。Numb蛋白N端有PTB結(jié)構(gòu)域 (phosphotyrosine-binding domain)，C 端有 PRR 結(jié)構(gòu)域（proline-rich domain)。這種模 塊似的結(jié)構(gòu)使Numb能夠和很多蛋白相互作用，從而具有多種功能。目如，研究最為廣泛的 是Numb蛋白在癌癥相關(guān)疾病中的用途。
[0077] 本發(fā)明提供了抑制Numb蛋白能夠抑制膽固醇的吸收的用途。
[0078] 可用于本發(fā)明的Numb蛋白包括野生型和突變型Numb蛋白。一種優(yōu)選的Numb蛋 白的全蛋白序列Genbank登錄號(hào)：NP_001005743. 1，編碼Numb蛋白的核酸序列Genbank登 錄號(hào)：ΝΜ_001005743· 1。
[0079] 在本發(fā)明中，"本發(fā)明Numb蛋白"、"本發(fā)明多肽"、"Numb蛋白"可互換使用，指NUMB numb homolog(Drosophila)蛋白（簡稱為Numb蛋白）。應(yīng)理解，所述術(shù)語還包括Numb的 活性片段和衍生物。
[0080] 在本發(fā)明中，"本發(fā)明基因"、"本發(fā)明多核苷酸"指編碼Numb蛋白或其活性片段和 衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。
[0081] 在本發(fā)明中，術(shù)語"Numb蛋白"或"Numb多肽"可互換使用，都指具有人蛋白Numb 氨基酸序列的蛋白或多肽。
[0082] 如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來（如果是天然的物質(zhì)， 原始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化 的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
[0083] 如本文所用，"分離的Numb蛋白或多肽"是指Numb蛋白基本上不含天然與其相關(guān) 的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化 Numb蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。在本發(fā)明中， Numb蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0084] 本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多 肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0085] 本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0086] 編碼Numb的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的 編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列（和任選的附加編碼序列）以及非編 碼序列。術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括 附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0087] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或 非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。
[0088] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本 文所用，"核酸片段"的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè) 核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)（如PCR)以確定 和/或分離編碼Numb蛋白的多核苷酸。
[0089] 本發(fā)明的人Numb核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工 合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序 列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA文 庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后 再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0090] 一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān) 序列。
[0091] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通 過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
[0092] 應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引 物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方 法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
[0093] 本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或Numb蛋白 編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
[0094] 通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列來表達(dá)或生產(chǎn)重組的 Numb蛋白。一般來說有以下步驟：
[0095] (1).用本發(fā)明的編碼人Numb蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0096] (2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
[0097] (3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0098] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人Numb編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄 /翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技 術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá) 載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0099] 此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0100] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0101] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞 如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、C0S、或293等動(dòng)物細(xì)胞。
[0102] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl 2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0103] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0104] 在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié) 合。
[0105] 抑制劑
[0106] 利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與Numb蛋白發(fā)生相互作用的 物質(zhì)，尤其是抑制劑等。
[0107] 本發(fā)明Numb蛋白的抑制劑（包括抗體、反義核酸以及其他抑制劑），當(dāng)在治療上進(jìn) 行施用（給藥）時(shí)，可抑制Numb蛋白的表達(dá)和/或活性，進(jìn)而抑制NPClLl蛋白內(nèi)吞或膽固 醇的吸收。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中， 其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的 病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括（但并不限 于）：肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
[0108] 可用于本發(fā)明的抑制劑包括：Numb的抗體、抑制性mRNA、Numb核酸的反義RNA、 siRNA、shRNA以及Numb的活性抑制劑。其中，典型的Numb抑制劑為抑制性miRNA、siRNA。
[0109] 典型地，將Numb基因作為制備抑制膽固醇吸收的藥物的靶點(diǎn)的技術(shù)方案包括以 下方案：
[0110] 1.化學(xué)合成雙鏈核糖核酸分子，其序列特異性針對Numb基因序列，利用脂質(zhì)體包 裹遞送至細(xì)胞內(nèi)干擾Numb基因的表達(dá)，觀察軟瓊脂克隆形成能力、細(xì)胞遷移能力等細(xì)胞生 物學(xué)特性的改變?？衫帽绢I(lǐng)域常規(guī)的方法來設(shè)計(jì)和合成特異性針對Numb的核酸序列（如 siRNA)。
[0111] 2.利用各種載體，包括DNA載體、慢病毒載體來干擾Numb基因的表達(dá)，達(dá)到體內(nèi)干 擾Numb基因的效果，檢測它們對小鼠體內(nèi)膽固醇吸收的影響，從而實(shí)現(xiàn)抑制膽固醇吸收的 目的。
[0112] 3.獲得能夠特異性抑制Numb基因轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽、單克隆抗體，達(dá)到抑制Numb活 性的目的，從而實(shí)現(xiàn)抑制膽固醇吸收的目的。
[0113] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明Numb抑制劑（如抗 體、反義序列（如siRNA)、或抑制劑）以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括 (但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相 匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔 劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法 進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量 是治療有效量，例如每天約1微克-10毫克/千克體重。
[0114] 抗體
[0115] 本發(fā)明還包括對人Numb蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單 克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于人Numb基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能 與人Numb基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的 抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，將提純的人Numb基因產(chǎn) 物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人Numb蛋白或它的抗原 的細(xì)胞也可以用來對動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。
[0116] 本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片 段，如Fab'或（Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗 體。
[0117] 本發(fā)明的抗體包括可以抑制Numb功能的抗體，也可以是不影響人Numb功能的抗 體。每一類抗體都可以通過對人Numb基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人Numb 基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的Numb 基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞(如E. coli)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得 至IJ。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化Numb蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì) 胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。
[0118] 可用于本發(fā)明的Numb抗體可以是抗人Numb蛋白抗體。本發(fā)明的抗人Numb蛋白 抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人Numb蛋白。
[0119] 藥物組合物和給藥方式
[0120] 本發(fā)明提供了含有活性成分（a)Numb抑制劑/促進(jìn)劑；(b)藥學(xué)上可接受的載體； 以及任選的（c)調(diào)節(jié)膽固醇吸收的藥物組合物。
[0121] 在本發(fā)明的藥物組合物中，Numb抑制劑/促進(jìn)劑的含量沒有特別限制，通常為 0· 01-95wt%，較佳地為 0· l-90wt%。
[0122] 本發(fā)明的藥物組合物可以是單方制劑，也可以是復(fù)方制劑。
[0123] 在復(fù)方制劑中，除了含有Numb抑制劑/促進(jìn)劑之外，還可包含其他化合物，例如調(diào) 節(jié)血脂或其他調(diào)節(jié)膽固醇吸收的藥物。代表性的藥物包括（但并不限于）：依澤麥布，他汀 類藥物(如洛伐他汀，美伐他汀等）
[0124] 本發(fā)明的藥物組合物的劑型和制備方法沒有特別限制，可用本領(lǐng)域常規(guī)通用的制 法制成片劑、膠囊、顆粒劑、緩釋劑、注射劑等各種劑型。優(yōu)選的劑型是口服制劑（如片劑） 和注射劑。
[0125] 在本發(fā)明中，Numb抑制劑/促進(jìn)劑或含Numb抑制劑/促進(jìn)劑的藥物制劑可用于 調(diào)節(jié)膽固醇的吸收。
[0126] 在本發(fā)明中，給藥方式?jīng)]有特別限制，可以通過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)或皮下 等途徑給藥。
[0127] 本發(fā)明制劑可以每天服用或給藥一次或兩次、或多次，或者以緩釋方式給藥。優(yōu)選 的方式是每天服藥一次，因?yàn)檫@樣便于病人堅(jiān)持，從而顯著提高病人服藥的順應(yīng)性。
[0128] 服用時(shí)，極大多數(shù)病例一般每天應(yīng)用的總劑量為每人Img?200g，較佳地為 IOmg ?100g〇
[0129] 篩選方法
[0130] 本發(fā)明提供的一種基于Numb進(jìn)行藥物篩選的方法。首先篩選抑制Numb表達(dá)或活 性的化合物，然后對篩選出的化合物進(jìn)一步測試其對膽固醇的吸收抑制作用。另一種是基 于化合物對Numb與NPClLl相互作用的影響的篩選方法。
[0131] 本發(fā)明提供的一種篩選抑制膽固醇吸收的候選化合物的方法，基于該化合物對 Numb的表達(dá)量和/或活性的影響，一種典型的篩選方法包括步驟：
[0132] (a)測試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測試化合物，并觀察所述測試組的細(xì)胞中 Numb的表達(dá)量和/或活性；在對照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測試化合物，并觀 察對照組的所述細(xì)胞中Numb的表達(dá)量和/或活性。
[0133] 其中Numb蛋白的表達(dá)量可以通過常規(guī)手段檢測而得，如RT-PCR等
[0134] (b)將測試組和對照組的Numb的表達(dá)量和/或活性進(jìn)行比較，
[0135] 如果測試組中Numb的表達(dá)量和/或活性Al顯著低于對照組的Numb的表達(dá)量和 /或活性A2,則表明該測試化合物為抑制膽固醇吸收的候選化合物。其中，所述的顯著低于 是 A1/A2 彡 0· 5。
[0136] 對于步驟（b)中所得的候選化合物，還可以進(jìn)一步測試其對NPClLl活性的影響和 /或?qū)δ懝檀嘉盏挠绊?，包括：在測試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物施用測試化 合物，觀察細(xì)胞中NPClLl內(nèi)吞的情況和/或觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膽固醇吸收的情況；在對照組中， 不向細(xì)胞培養(yǎng)體系和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物施用測試化合物，觀察細(xì)胞中NPClLl內(nèi)吞的情況和/或 觀察細(xì)胞中膽固醇吸收的情況；
[0137] 其中，若測試組中NPClLl內(nèi)吞和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物膽固醇吸收量為對照組的80%，則 說明該測試化合物為抑制膽固醇吸收的候選化合物；較佳地，為對照組的60 %，更佳地，為 50%。
[0138] 本發(fā)明還提供了另一種篩選抑制膽固醇吸收的候選化合物的方法，基于該化合物 對Numb與NPClLl相互作用的影響，一種典型的篩選方法包括步驟，其特征在于，包括以下 步驟：
[0139] (a)在測試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入所述的測試化合物，并觀察所述細(xì)胞的 Numb蛋白與NPClLl蛋白相互結(jié)合強(qiáng)度；在對照組中，向同樣的細(xì)胞培養(yǎng)體系中不加入所述 的測試化合物，并觀察Numb蛋白與NPClLl蛋白相互結(jié)合強(qiáng)度；
[0140] 其中，Numb蛋白與NPClLl蛋白相互結(jié)合強(qiáng)度可通過免疫共沉淀方法計(jì)算。
[0141] (b)如果測試組中Numb蛋白與NPClLl蛋白相互結(jié)合強(qiáng)度Al顯著低于對照組的 Numb蛋白與NPClLl蛋白相互結(jié)合強(qiáng)度A2,則表明該測試化合物為抑制膽固醇吸收的候選 化合物。其中，所述的顯著低于是A1/A2S0.5。
[0142] 對于步驟（b)中所得的候選化合物，還可以進(jìn)一步測試其對膽固醇吸收的影響， 包括：在測試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物施用測試化合物，觀察細(xì)胞中NPClLl內(nèi) 吞的情況和/或觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膽固醇吸收的情況；在對照組中，不向細(xì)胞培養(yǎng)體系和/或?qū)?驗(yàn)動(dòng)物施用測試化合物，觀察細(xì)胞中NPClLl內(nèi)吞的情況和/或觀察細(xì)胞中膽固醇吸收的情 況。
[0143] 若測試組中NPClLl內(nèi)吞和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物膽固醇吸收量為對照組的80%，則說明該 測試化合物為抑制膽固醇吸收的候選化合物；較佳地，為對照組的60%，更佳地，為50%。
[0144] NPClLl蛋白及其突變蛋白
[0145] Niemann-Pick Cl-Iikel (NPClLl)是2004年發(fā)現(xiàn)的一種在小腸膽固醇吸收中起 重要作用的蛋白。NPClLl可介導(dǎo)小腸內(nèi)膽固醇的吸收以及肝細(xì)胞對膽汁中膽固醇的重吸 收。
[0146] NPClLl是膽固醇吸收過程中起重要作用的多次跨膜蛋白，它通過感受細(xì)胞內(nèi)膽固 醇水平的變化，在細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)吞循環(huán)體（ERC)間往復(fù)運(yùn)動(dòng)（Recycling)，不斷運(yùn)送膽固醇 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
[0147] 可用于本發(fā)明的NPClLl蛋白來源于哺乳動(dòng)物，更佳地，來源于人、小鼠、大鼠。一 種優(yōu)選的可用于本發(fā)明的NPClLl野生型蛋白的全蛋白序列Genbank登錄號(hào)：NP_037521. 2， 編碼NPClLl蛋白的核酸序列Genbank登錄號(hào)：NM_013389. 2。
[0148] 所述的突變型NPClLl蛋白必須滿足以下條件：含有C端的YVNxxF結(jié)構(gòu)域，或C端 的YVNxxF結(jié)構(gòu)域的第1 一 3位和第6位未發(fā)生突變。
[0149] 在本發(fā)明中，NPClLl突變蛋白指相對于其野生型序列而言，滿足以下條件：
[0150] (a)內(nèi)吞膽固醇的能力下降或喪失；和
[0151] (b)部分或全部缺失了 C端的YVNxxF結(jié)構(gòu)域，或所述YVNxxF結(jié)構(gòu)域的第1 一 3位 和第6位發(fā)生突變。
[0152] 較佳地，所述的突變蛋白缺失C末端的至少22個(gè)氨基酸；
[0153] 更佳地，所述的突變蛋白含有Tyr (1306位）缺失或突變。
[0154] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白缺失C末端的27個(gè)氨基酸。
[0155] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白的其他部分的序列與野生型NPClLl相同或基 本相同。
[0156] 編碼本發(fā)明突變蛋白的核酸序列可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法獲得， 如利用定點(diǎn)誘變、盒式誘變以及PCR誘變等方法進(jìn)行誘變。
[0157] 融合蛋白
[0158] 本發(fā)明提供的一種NPClLl蛋白及其突變蛋白的融合蛋白。其中，所述融合蛋白含 有NPClLl蛋白及其突變蛋白以及與其融合在一起的融合原件。其中所述的融合原件包括 Myc原件、T7元件、Flag元件、HA元件。
[0159] 通常，本發(fā)明所述的融合蛋白可以通過定點(diǎn)突變的方法獲得。
[0160] 宿主細(xì)胞
[0161] 本文所用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義，即，能夠 產(chǎn)生本發(fā)明NPClLl突變蛋白的宿主細(xì)胞。換言之，本發(fā)明可以利用任何宿主細(xì)胞，只要本 發(fā)明的NPClLl突變蛋白能在該宿主細(xì)胞中表達(dá)。例如，本發(fā)明的宿主細(xì)胞中包含的NPClLl 突變蛋白的編碼基因不僅可以是重組載體或質(zhì)粒，還有可能是基因組上整合有所述蛋白的 編碼基因，g卩，在基因組整合上的蛋白的編碼基因可能是通過轉(zhuǎn)入質(zhì)粒進(jìn)行同源重組得到， 也有可能在基因組上定點(diǎn)突變相應(yīng)的位點(diǎn)而得到。
[0162] 本發(fā)明的有益效果：
[0163] 本發(fā)明基于Numb蛋白在膽固醇吸收中的調(diào)節(jié)作用，尤其是Numb蛋白和NPClLl蛋 白的互相作用，提供了 Numb蛋白的抑制劑在減少膽固醇吸收中的用途。此外，本發(fā)明還提 供了一種NPClLl突變蛋白具有減少膽固醇吸收的作用。
[0164] 通用方法
[0165] 1.材料和試劑
[0166] 細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM)、胎牛血清（FBS)購自Life Technologies公司；瓊脂糖 購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；Taq酶和dNTPs購自 TaKaRa公司；辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的驢抗鼠和抗兔IgG購自Jackson免疫研究實(shí) 驗(yàn)室；Filipin,洛伐他汀（Lovastatin)與蛋白酶抑制劑購自Sigma;甲基-β-環(huán)化糊精 (β-Methyl-Cyclodextrin, CDX)購自 Cyclodextrin Technologies Development Inc.;膽 固醇購自Steraloids, Inc.;去脂血清（LPDS，d>l. 215g/ml)從新生小牛血清通過超離心獲 得；寡聚核苷酸由上海生工公司合成；RNA duplex由上海Genepharma公司合成。
[0167] 2.抗體
[0168] 鼠單抗CHC抗體購自BD Transduction Laboritories TM ;鼠單抗Flag抗體購自 Si gma ;兔多抗Numb購自ce 11 s i gnal ing ;EGFP抗體獲自用原核表達(dá)EGFP蛋白免疫實(shí)驗(yàn)兔 獲得的抗血清；兔多抗NPClLl抗體獲自人NPClLl蛋白1267-1332位多肽免疫實(shí)驗(yàn)兔獲得 的抗血清和抗原親和純化后的抗體。
[0169] 3.菌株與質(zhì)粒
[0170] 大腸桿菌DH12S由本實(shí)驗(yàn)室提供，本論文涉及到的真核表達(dá)質(zhì)粒 pCMV-NPCILl-EGFP，pCMV-Numb-Myc，pCMV-NPClLl-T7 等均按標(biāo)準(zhǔn)分子克隆方法由人 cDNA 中克隆得到。各種編碼NPClLl和Numb的突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒都是采用KOD DNA聚合酶 采用Quickchange的方法獲得。
[0171] 4.細(xì)胞培養(yǎng)
[0172] CRL-1601 (McArdle RH7777大鼠肝癌細(xì)胞），Huh7(人肝癌細(xì)胞系）均購自ATCC。 單細(xì)胞層在37°C和5%C02中，細(xì)胞生長在培養(yǎng)基A(Dulbecco's改良的Eagle's培養(yǎng)基，含 有 100U/ml 青霉素和 100 μ g/ml 鏈霉素）再加上 10%FBS。CRL1601/NPC1L1-EGFP，CRL1601/ NPClLl-3XMyc-EGFP的培養(yǎng)，除了以上條件外，補(bǔ)加200yg/ml G418。細(xì)胞膽固醇減少 (D印Ietion)培養(yǎng)基，是培養(yǎng)基A加上5%去脂血清（LPDS)，1 μ M洛伐他?。↙ovastatin)， 5〇以1\1甲輕戊酸（]^￥&1〇11&七6)和1.5%0-甲基環(huán)化糊精（0-]^1:1171-〇5^1〇(16叉1：1'；[11，00父）。 膽固醇再遞送（R印Ienishment)培養(yǎng)基含有培養(yǎng)基A加上5%LPDS，1 μ M洛伐他汀，50 μ M甲 羥戊酸和不同濃度的CDX包被的膽固醇。
[0173] 5.真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
[0174] 使用FuGENE HD(Roche)轉(zhuǎn)染試劑，按照說明書的步驟操作：以合適密度接種細(xì) 胞，培養(yǎng)16-24h ;將要轉(zhuǎn)染的質(zhì)?；靹?，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加到含有無血清培養(yǎng)基EP管中； 按照I :3(DNA( μ g) =FuGENE HD (μ 1))的量加入FuGENE HD，混勻后室溫靜置15-20分鐘； 將質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混合物逐滴加入細(xì)胞中，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。
[0175] 6.蛋白的收集和檢測
[0176] 細(xì)胞收集后用 RIPA 緩沖液（50mM Tris-HCl (pH8.0)，150mM NaCl，2mM MgC12， 0· 1%SDS，I. 5%ΝΡ-40,0· 5%去氧膽酸鈉）勻漿裂解（含蛋白酶抑制劑：5 μ g/ml P印statin A, 10 μ g/ml Leup印tin, 5 μ M MG-132, I mM PMSF)高速 16, OOOg 離心后取上清，蛋 白樣品制備是用細(xì)胞裂解上清和等體積的HMGCR Soluablization Buffer(62.5mM Tris-HCl (pH6. 8)，15%SDS，8M尿素，10%甘油，IOOmM DTT混合），然后加入相應(yīng)體積的 4XLoading Buffer(l%SDS，6%β -巰基乙醇，30%甘油，以及適量的溴酚藍(lán)），混勻后37°C 溫浴30分鐘。Western blot檢測蛋白的方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（科學(xué)出版社，第 二版）。
[0177] 7.免疫熒光
[0178] 將處理好的細(xì)胞用4%多聚甲醒（Paraformaldehyde, PFA)在室溫固定20分鐘， PBS洗兩遍；0. 2%Triton X-100室溫處理5分鐘；PBS洗三遍，用PBS稀釋的1%BSA室溫封 閉60分鐘；用封閉液稀釋一抗，室溫孵育60分鐘；PBS洗三遍；用封閉液稀釋二抗，室溫避 光孵育40分鐘；PBS洗三遍；去離子水洗兩遍；封片，晾干過夜后保存于-20°C。
[0179] 8. Filipin 染色
[0180] 將處理好的細(xì)胞用4%PFA在室溫固定30分鐘；PBS洗兩遍；用1%FBS處理5分鐘 以中和PFA ;稱取適量Filipin，用乙醇溶解到5mg/ml ;用含有10%FBS的PBS稀釋Filipin 母液到終濃度50 μ g/ml,室溫染色30分鐘；PBS洗三遍,去離子水洗兩遍；封片，晾干過夜 后保存于-2〇°C。整個(gè)染色過程在暗室中進(jìn)行。
[0181] 9. RNA 干擾（RNAi)
[0182] 雙鏈siRNA由Genepharma合成。革巴向大鼠 Numb的siRNA序列是： 5，-GCTGTCCCTACGCATCAAT-3，（SEQ ID NO. :1)。shRNA 序列是 Numb :Rat-A: 5'-GCTGTCCCTACGCATCAATGA-3' （SEQ ID NO. :2)，Rat-B:5'-GCAGACATTCCCTCAATATGA-3' (SEQ ID NO. :3)。對照 shRNA 或 siRNA 為 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3'（SEQ ID NO.: 4)。
[0183] 10.免疫共沉淀
[0184] 將細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)處理后，勻漿充分裂解于IP緩沖液中（PBS，5mM EGTA，5mM EDTA，0. 5%Digitonin，蛋白酶抑制劑和0. 25mM DTT)。16, OOOg離心取上清和含有GFP抗體 的瓊脂糖珠混合，4°C結(jié)合2小時(shí)，1，OOOg離心去上清；用IP緩沖液洗瓊脂糖珠5遍（每次 4°C混合5分鐘，以充分去除非特異結(jié)合的蛋白）；用pH2. 8的醋酸/甘氨酸洗脫液洗脫兩 次，IM Tris-HCl (ρΗ9· 0)中和；加入5倍體積的丙酮，-70°C沉淀過夜，3, OOOg離心后棄上 清；將沉淀晾干，溶于上樣緩沖液；SDS-PAGE分析。
[0185] 11.熒光定量
[0186] 在每次實(shí)驗(yàn)里的每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，任意選擇100個(gè)細(xì)胞作為定量對象。用Image Pro Plus5. 01軟件熒光定量。細(xì)胞總的熒光強(qiáng)度定量的方法是用AOI選擇該細(xì)胞，計(jì)算熒光強(qiáng) 度后剪去背景。細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度定量的方法是用AOI緊貼著細(xì)胞膜下畫一個(gè)圈，定量圈 內(nèi)的熒光強(qiáng)度。Figure中定量顯示的是細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度比細(xì)胞總的熒光強(qiáng)度的百分比。
[0187] 實(shí)施例1NPC1L1 YVNxxF缺失或突變影響其內(nèi)吞
[0188] I. 1轉(zhuǎn)染NPC1L1C端缺失不同氨基酸的質(zhì)粒，觀察NPClLl在細(xì)胞定位的變化。結(jié) 果如圖IA-B所示，NPClLl蛋白缺少17個(gè)氨基酸時(shí)，給予膽固醇后，NPClLl定位與野生型相 同，主要在內(nèi)吞循環(huán)復(fù)合體中。但當(dāng)缺失22和27個(gè)氨基酸時(shí)，給予膽固醇時(shí)NPClLl內(nèi)吞 速度減慢，仍然定位在質(zhì)膜上。由此可見，1306-1311位氨基酸對NPClLl的細(xì)胞定位有重要 作用。
[0189] 1. 2分別將NPClLl蛋白1306-1311位各個(gè)氨基酸突變?yōu)楸彼?，轉(zhuǎn)染CRL1601細(xì) 胞，24小時(shí)后，4%PFA固定細(xì)胞15min，0. 2%triton X100通透細(xì)胞，熒光抗體染色，封片后共 聚焦顯微鏡在488nm，561nm激發(fā)光下觀察。結(jié)果如圖IC-D所示，當(dāng)Y1306, V1307, N1308， F1311點(diǎn)突變?yōu)楸彼釙r(shí)，細(xì)胞膜上的NPClLl明顯增多，而H1309, S1310位點(diǎn)突變?yōu)楸?酸則沒有影響NPClLl的細(xì)胞定位，這與氨基酸的保守性是一致的。由此可見，YVNXXF這幾 個(gè)氨基酸是對NPClLl的內(nèi)吞過程中起重要作用。
[0190] 1. 3對不同哺乳動(dòng)物物種的NPClLl 1304-1315位氨基酸進(jìn)行比對，結(jié)果如圖IE所 示：YVNxxF這幾個(gè)氨基酸高度保守。
[0191] 實(shí)施例2NPC1L1蛋白Y1306位的突變對NPClLl內(nèi)吞和膽固醇吸收的影響
[0192] 利用穩(wěn)定表達(dá)野生型NPClLl和Y1306突變型NPClLl的細(xì)胞，首先抽提細(xì)胞內(nèi)膽 固醇，然后遞送膽固醇不同的時(shí)間段，觀察兩種細(xì)胞NPClLl內(nèi)吞的快慢和膽固醇吸收的情 況?？梢钥吹?，野生型NPClLl在給予膽固醇后快速的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其中在60分鐘時(shí)就 大部分進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)在這一過程中，膽固醇也隨著NPClLl -起進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而Y1306 突變后的NPClLl的內(nèi)吞受到明顯抑制，在給予膽固醇60分鐘時(shí)仍有大部分NPClLl滯留在 細(xì)胞膜上，同樣，膽固醇的內(nèi)吞也受到抑制（圖2A，B)。這一結(jié)果表明，NPClLl Y1306這一位 點(diǎn)突變將導(dǎo)致NPClLl和膽固醇吸收的減少，即這一位點(diǎn)對NPClLl發(fā)揮功能至關(guān)重要。
[0193] 實(shí)施例3NPC1L1蛋白Y1306的突變對肝臟中NPClLl對膽汁膽固醇吸收的影響
[0194] 方法：向小鼠尾靜脈注射腺病毒，利用腺病毒介導(dǎo)的NPClLl過表達(dá)來觀察NPClLl 吸收膽汁中膽固醇的能力。在注射腺病毒后的第四天，處死小鼠，觀察NPClLl在小鼠各組 織中的表達(dá)情況并分析小鼠膽固醇吸收情況。
[0195] 結(jié)果如圖3A-C所示，NPClLl蛋白主要在肝臟中表達(dá)。在其它主要組織中幾乎沒 有表達(dá)，NPC1L1WT與Y1306A點(diǎn)突變的表達(dá)量也相當(dāng)。在肝臟中，野生型NPClLl主要表達(dá) 在膽小管面，與膽小管面的Marker Mrp2有很好的共定位。而NPC111Y1306A點(diǎn)突變的后有 大量的NPClLl與Mrp2的沒有共定位，預(yù)測其功能可能會(huì)發(fā)生異常。
[0196] 小鼠肝臟在表達(dá)NPC1L1-EGFP后，與只表達(dá)EGFP的對照組相比，膽汁中膽固醇水 平降低，血液中膽固醇水平上升（圖3DXNPC1L1Y1306A點(diǎn)突變后，與野生型的NPClLl相比， 降低膽汁中膽固醇的能力明顯減弱，表明NPClLl Y1306位氨基酸對膽固醇吸收是必須的。
[0197] 實(shí)施例4Numb蛋白與NPClLl蛋白相互作用
[0198] 4. 1采用常規(guī)親和純化的方法，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，分別表達(dá)了 GST tag的 LRP C端蛋白（100a. a.，含兩個(gè)NPxF序列，作為陽性對照）和NPClLl蛋白C端67個(gè)氨基 酸，與His Tag的Numb-PTB蛋白進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)（圖4，A)。結(jié)果如圖4B所示，Numb能夠 與野生型的NPClLl蛋白C端結(jié)合，但是當(dāng)Y1306, V1307, N1308, F1311位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?時(shí)，就不能夠與Numb結(jié)合，而H1309, S1310點(diǎn)突變則不影響與Numb蛋白的結(jié)合。因此，如 圖4B所示，NPC1L1C端肽段能夠通過YVNxxF這幾個(gè)氨基酸與Numb蛋白結(jié)合。
[0199] 4. 2合成野生型和YVNXXF序列突變的多肽，利用biacore實(shí)驗(yàn)檢測與Numb-PTB的 相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有野生型多肽能夠與Numb-PTB直接相互作用（圖4C)，這也進(jìn)一步說 明NPClLl通過YVNXXF與Numb相互作用。
[0200] 4. 3采用免疫共沉淀的方法，在細(xì)胞水平上研究NPClLl與Numb蛋白的相互作用。 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)NPC1L1-T7與Numb，發(fā)現(xiàn)當(dāng)膽固醇水平低時(shí)，Numb與NPClLl有很弱的相互 作用，而給予細(xì)胞膽固醇后，隨著時(shí)間的延長，能夠加強(qiáng)NPClLl與Numb的相互作用。而 NPClLl (Y1306A)則完全喪失了與NPClLl相互作用。NPClLl與腳手架蛋白重鏈（clathrin heavy chain，CHC)的相互作用也隨著膽固醇水平增加而加強(qiáng)。NPClLl (Y1306A)也同樣不 能夠與CHC相互作用。
[0201] 實(shí)施例5Numb敲除對NPClLl內(nèi)吞以及膽固醇吸收的影響
[0202] 方法：
[0203] 5. 1對實(shí)施例1中獲得的1D6細(xì)胞進(jìn)行針對Numb基因的shRNA (A，SEQ ID NO.: 2 ;B, SEQ ID NO. :3)包被，RIPA buffer 收全細(xì)胞裂解液，Western bloting 檢測 Numb 蛋白 水平。
[0204] 5. 2在CDX處理60min后遞送膽固醇不同時(shí)間點(diǎn)，4%PFA固定細(xì)胞30min，filipin 染色，封片后共聚焦顯微鏡在488nm激發(fā)光下觀察。
[0205] 5. 3分別對細(xì)胞內(nèi)和全細(xì)胞NPClLl蛋白和膽固醇進(jìn)行定量，分別計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)的 NPClLl (膽固醇）和占全細(xì)胞的比值。
[0206] 結(jié)果如圖5所示：
[0207] 圖5A顯示了細(xì)胞在RNAi Numb后，Numb蛋白量大量減少。
[0208] 圖5B顯示了在固定狀態(tài)下，NPClLl的細(xì)胞定位發(fā)生了很大變化，與對照組不同， RNAi Numb后大量的NPClLl都定位在了細(xì)胞質(zhì)膜上；在環(huán)化糊精處理后遞送膽固醇，RNAi Numb的細(xì)胞中，NPClLl內(nèi)吞速度明顯減慢，同時(shí)，對照組隨著給予膽固醇時(shí)間的延長，細(xì)胞 內(nèi)的膽固醇越來越多，而在RNA干擾Numb蛋白后，細(xì)胞內(nèi)吞膽固醇受到明顯的抑制。由此 可見，Numb蛋白不但參與了 NPClLl的內(nèi)吞，而且Numb蛋白對細(xì)胞吸收膽固醇是必須的。
[0209] 圖5C顯示了與對照組相比，在RNAi Numb后，細(xì)胞內(nèi)NPClLl蛋白和膽固醇的含量 占全細(xì)胞含量百分比有明顯差異，因此，Numb蛋白的減少對NPClLl的內(nèi)吞和膽固醇的吸收 的影響是巨大的。
[0210] 實(shí)施例6阻斷NPClLl與Numb相互作用可減少膽固醇吸收
[0211] 6. 1合成含有YVNHSF和突變AAAHSA區(qū)段的多肽，觀察是否對NPClLl蛋白C端67 個(gè)氨基酸與Numb蛋白結(jié)合有影響。發(fā)現(xiàn)含有YVNHSF核心區(qū)段的多肽能夠?qū)PClLl蛋白 C端67個(gè)氨基酸與Numb蛋白結(jié)合有競爭性效果，這種效果是濃度依賴性的。而YVNxxF突 變后，多肽將不會(huì)對二者相互作用產(chǎn)生影響（圖6A)。這說明NPClLl蛋白C端67個(gè)氨基酸 與Numb蛋白結(jié)合是特異性的。
[0212] 6. 2NPC1L1是多13次跨膜蛋白，NPClLl-C從膜中伸出到胞質(zhì)中。為模擬這一定位， 需要將NPClLl-C錨定在細(xì)胞膜上。如圖6B所示，采用單次跨膜蛋白⑶8 α融合NPClLl-C (1266-1332a. a.)。這一融合蛋白與NPC1L1-EGFP共表達(dá)在CRL1601細(xì)胞中，可以發(fā)現(xiàn)，野生 型CD8 a -NPClLl-C能夠阻斷NPClLl的內(nèi)吞和膽固醇的吸收，而CD8 a -NPClLl-C(Y1306A) 則沒有這種效果（圖6C)。這一實(shí)驗(yàn)說明在細(xì)胞水平上阻斷NPClLl與Numb的相互作用能夠 抑制NPClLl內(nèi)吞和膽固醇吸收。
[0213] 6. 3采用腺病毒系統(tǒng)，在小鼠肝臟中阻斷NPClLl-Numb對膽固醇吸收的影響。小 鼠肝臟在表達(dá)NPC1L1-EGFP后，與只表達(dá)EGFP的對照組相比，膽汁中膽固醇水平降低， 血液中膽固醇水平上升（圖6D)。在共表達(dá)空的對照⑶8 α后，NPClLl的這一功能沒有 影響。而NPClLl與⑶8 a-NPClLl-C共表達(dá)后，NPClLl與Numb的相互作用受到有效抑 制，同時(shí)，NPClLl蛋白在重吸收膽汁中膽固醇的能力受到部分抑制（圖6D)。而共表達(dá) ⑶8a-NPClLl-C(Y1306A)則沒有這種效果。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在動(dòng)物水平上阻斷NPClLl 與Numb的相互作用可抑制NPClLl吸收膽固醇的能力，這提供了一個(gè)藥物發(fā)展方向，尋找能 夠阻斷NPClLl-Numb的小分子化合物可用來減少膽固醇的吸收。
[0214] 實(shí)施例7Numb蛋白缺失對小鼠小腸膽固醇吸收的影響
[0215] 7. 1構(gòu)建小腸中特異性敲除Numb蛋白的小鼠。從Jackson laboratory購買獲得 NUmbtmlZiliNumbltmlZili/M、鼠，與在小腸中表達(dá)可誘導(dǎo)的ere蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交后，注射 他莫昔芬；結(jié)果如圖7A所示，Numb蛋白在小腸中被特異性敲除，而在其它組織如肝、肺中沒 有減少。
[0216] 7. 2觀察NPClLl蛋白受膽固醇調(diào)控的內(nèi)吞情況。灌胃小鼠膽固醇后，采用免疫組 化的方法，觀察NPClLl蛋白的定位情況。結(jié)果如圖7B所示，野生型小鼠中，NPClLl蛋白主 要定位在絨毛杯狀細(xì)胞頂面，而Numb蛋白在NPClLl蛋白的下方也有部分定位，與NPClLl 蛋白有共定位。小鼠在灌胃膽固醇后，NPClLl蛋白部分內(nèi)吞進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中。而在Numb蛋白 特異敲除后，灌胃膽固醇后，NPClLl蛋白的內(nèi)吞明顯受到抑制。
[0217] 7. 3觀察在Numb蛋白敲除后，小鼠膽固醇的吸收情況。采用雙標(biāo)同位素的方法同 時(shí)灌胃3H標(biāo)記的膽固醇和 14C標(biāo)記的谷固醇，小腸中吸收很少的谷固醇，因此將谷固醇作為 內(nèi)參。在灌胃小鼠3天后，收集小鼠糞便，計(jì)算膽固醇的吸收情況。結(jié)果如圖7C所示，Numb 蛋白基因敲除的小鼠比野生型小鼠膽固醇吸收明顯減少，同時(shí)，在灌胃2小時(shí)后，直接測肝 臟，血液中的膽固醇水平，也發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠膽固醇水平明顯下降（圖7D、E)。
[0218] 實(shí)施例8Numb基因敲除的小鼠能夠抵抗食物誘導(dǎo)的高膽固醇血癥
[0219] 研究長期高膽固醇飲食或基礎(chǔ)飼料飲食情況下，I-Numb+小鼠的機(jī)體膽固醇水 平，喂養(yǎng)野生型小鼠和I-Numb+小鼠基礎(chǔ)飼料或0. 5%膽固醇飼料(基礎(chǔ)飼料加入0. 5%膽 固醇，40%脂肪)16周，觀察膽固醇水平的變化?；A(chǔ)飼料喂養(yǎng)條件下，這兩種小鼠的膽固醇 水平和膽固醇代謝相關(guān)蛋白水平?jīng)]有明顯差別（圖8)。在高膽固醇飼料與基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)相 t匕，野生型小鼠血液膽固醇水平明顯升高(從106. 1到177. 9mg/dL)，I-Numb+小鼠血液膽 固醇水平升高幅度明顯小（從97. 7到132. 6mg/dL)，說明I-Numb+小鼠能夠抵抗食物誘導(dǎo) 的高膽固醇血。在高膽固醇飼料喂養(yǎng)下，I-Numb+小鼠的HMGCR，HMGCS，LDLR等基因蛋白 水平和mRNA水平都比野生型小鼠高（圖8B、C)，這正是這幾種小鼠較低膽固醇水平所產(chǎn)生 的負(fù)反饋現(xiàn)象。
[0220] 實(shí)施例9穩(wěn)定表達(dá)3 XMyc-NPClLl-EGFP融合蛋白的細(xì)胞株1D6的構(gòu)建及功能驗(yàn) 證
[0221] 構(gòu)建：采用常規(guī)分子生物學(xué)克隆的方法，將3XMyc的標(biāo)簽插入到NPC1L1-EGFP的 986-987位置。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CRL1601細(xì)胞中，G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)3 X Myc-NPClLl-EGFP 融合蛋白的細(xì)胞株，命名為1D6.
[0222] 功能驗(yàn)證：對上述獲得的細(xì)胞株進(jìn)行1. 5%環(huán)化糊精處理一小時(shí)以抽提細(xì)胞膽固 醇，然后換成含有1. 5 μ g/ml膽固醇(或者膽固醇和Ezetimibe)的培養(yǎng)基處理一小時(shí)，4%多 聚甲醛固定細(xì)胞，filipin染色后封片，用熒光共聚焦顯微鏡觀察。
[0223] 結(jié)果如圖9所示：
[0224] 圖9A顯示了 3XMyc-NPClLl_EGFP蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖。其中，NPClLl蛋白共13 次跨膜，質(zhì)膜外側(cè)有兩個(gè)較大loop結(jié)構(gòu)，3XMyc插入在第二個(gè)loop上，EGFP位于C末端。
[0225] 圖9B顯示了對篩選得到的穩(wěn)定表達(dá)3XMyc-NPClLl-EGFP的細(xì)胞株進(jìn)行功能驗(yàn) 證，結(jié)果顯示，NPClLl融合蛋白能夠隨著膽固醇水平的變化，在內(nèi)吞循環(huán)復(fù)合體和質(zhì)膜間往 復(fù)運(yùn)動(dòng)。并且能夠運(yùn)送膽固醇進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這說明這一融合蛋白有和野生型NPClLl-致 的生物學(xué)功能。
[0226] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種Numb基因或蛋白（Numb Protein)抑制劑的用途，其特征在于，用于制備抑制膽 固醇吸收的藥物組合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Numb基因或蛋白來源于哺乳動(dòng)物，較 佳地，來源于嚙齒動(dòng)物或人，更佳地，來源于人。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑包括Numb蛋白的抗體、Numb 核酸的反義RNA、siRNA、shRNA、Numb蛋白的活性抑制劑。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物包括安全有效量的所述 抑制劑作為活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。
5. -種篩選促進(jìn)或抑制膽固醇吸收的候選化合物的方法，其特征在于，包括以下步 驟： (a) 在測試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入所述的測試化合物，并觀察所述細(xì)胞的Numb 的表達(dá)量和/或活性；在對照組中，向同樣的細(xì)胞培養(yǎng)體系中不加入所述的測試化合物，并 觀察Numb的表達(dá)量和/或活性；和 (b) 將測試組和對照組的Numb的表達(dá)量和/或活性進(jìn)行比較，如果測試組中Numb的表 達(dá)量和/或活性A1顯著高于對照組的Numb的表達(dá)量和/或活性A2,則表明該測試化合物 作為促進(jìn)膽固醇吸收的候選化合物； 如果測試組中Numb的表達(dá)量和/或活性A1顯著低于對照組的Numb的表達(dá)量和/或 活性A2,則表明該測試化合物為抑制膽固醇吸收的候選化合物。
6. 對權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包括步驟： (c) .對于步驟（b)中所得的候選化合物，進(jìn)一步測試其對NPC1L1蛋白（Niemann-Pick Cl-likel，NPC1L1)活性的影響和/或?qū)δ懝檀嘉盏挠绊憽?br> 7. -種NPC1L1突變蛋白，其特征在于，所述的突變蛋白具有以下特征： (a) 內(nèi)吞膽固醇的能力下降或喪失；或 (b) 部分或全部缺失了野生型NPC1L1蛋白C端的YVNxxF結(jié)構(gòu)域，或所述YVNxxF結(jié)構(gòu) 域的第1 一 3位和第6位發(fā)生突變，其中，x代表任意天然或非天然氨基酸。
8. -種分離的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列編碼權(quán)利要求7中的NPC1L1突 變蛋白。
9. 一種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有如權(quán)利要求8所述的DNA序列。
10. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞包括權(quán)利要求9中所述的表達(dá)載體； 和/或所述的宿主細(xì)胞基因中含有如權(quán)利要求8所述的DNA序列。
11. 一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有權(quán)利要求7所述的NPC1L1突變蛋白 以及與所述突變蛋白融合在一起的融合元件。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK104436189SQ201310428993
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】宋保亮, 李培山, 繆紅華, 張瑩鈺 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院