新積雪草酸衍生物的制備及在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，涉及化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為式(1)所示的兩種新化合物1和2的制備；本發(fā)明還涉及該新化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。其制備方法是利用發(fā)明人篩選的對(duì)積雪草酸具有結(jié)構(gòu)修飾能力的藍(lán)色犁頭霉(Absidia?coerulea)菌種，在優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)積雪草酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化7～10天，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用有機(jī)溶劑萃取，分離純化得到兩個(gè)新的積雪草酸衍生物。
【專利說(shuō)明】新積雪草酸衍生物的制備及在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，涉及新的積雪草酸衍生物及其制備方法，以及新化合物在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]積雪草酸(asiatic acid)，又名亞細(xì)亞酸，是藥用傘形科植物積雪草中提取的三萜酸，屬于烏蘇烷型五環(huán)三萜類化合物。由于積雪草酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在活潑的雙鍵、羥基、羧基官能團(tuán)，因而具有廣泛的生物學(xué)活性，如保肝、抗腫瘤、改善神經(jīng)認(rèn)知障礙、抗抑郁、抗2型糖尿病、抗氧化、抗炎、抑菌等作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供了一類新的積雪草酸衍生物。
[0004]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了新積雪草酸衍生物的制備和抗腫瘤用途。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案完成的，具體內(nèi)容包括:積雪草酸的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)、產(chǎn)物提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定、體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)。
[0006](I)積雪草酸的植物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)
[0007]將積雪草酸溶于乙醇溶液中，配成濃度為10~20g / L的底物溶液，加入到在25~28°C，150~200rpm / min條件下培養(yǎng)了 I~3天的微生物中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件為:25~280C，150 ~200rpm / min, 7 ~10 天。
[0008](2)產(chǎn)物的提取分離純化
[0009]轉(zhuǎn)化結(jié)束后，用乙酸乙酯等有機(jī)溶劑萃取，減壓濃縮，經(jīng)硅膠柱色譜、凝膠柱色譜分離純化得到化合物1、化合物2。
[0010](3)新化合物體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)
[0011]將新化合物作用于人肺癌細(xì)胞A-549、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人肝癌細(xì)胞H印G2，評(píng)價(jià)其抗腫瘤效果。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但其并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]實(shí)施例1
[0014]新化合物1、2的制備及提取分離
[0015]在15瓶IOOOml (每瓶400mL培養(yǎng)基)的三角瓶中以2%的接種量接入藍(lán)色犁頭霉Absidia coerulea CGMCC3.2462 菌種，置于恒溫振蕩器中，180rpm / min，27°C培養(yǎng) 72h 后加入300mg底物積雪草酸(溶于20ml乙醇中，每瓶加入2ml)，繼續(xù)培養(yǎng)10天。發(fā)酵完成后，過(guò)濾菌絲體，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，菌絲體干燥后粉碎，用500mL乙酸乙酯超聲提取三次，每次30min，合并乙酸乙酯萃取液與提取液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至小體積，干燥，得轉(zhuǎn)化反應(yīng)提取物(3.12g)。[0016]將提取物用少量乙醇溶解，3g硅膠(200-300目)拌樣，40g硅膠(300-400目)分離，氯仿/甲醇梯度洗脫(從100:0到90:10，共3000ml)，收集到五個(gè)流分:A(2547.lmg)，B (260.3mg)，C (121.3mg)為未反應(yīng)的積雪草酸，D (24.0mg)，E (48.6mg)，流分D用凝膠柱分離，無(wú)水乙醇洗脫(IOml —個(gè)流分，共430ml)，得到化合物I (13.8mg)，流分E用凝膠柱分離，無(wú)水乙醇洗脫(IOml —個(gè)流分，共480ml)，得到化合物2 (27.8mg)。
[0017]實(shí)施例2
[0018]新化合物I結(jié)構(gòu)鑒定
[0019]化合物I為白色無(wú)定型粉末，HR-ES1-MS給出503.3391 ([M-H] O，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR推斷確定分子式為C3tlH48O6。1H-Nmr^oomHz, pyridine-d5)中，顯示該化合物有六組甲基氫信號(hào) δ 0.82 (3Η, d,6.0) ,0.95 (3H, d, 6.6), 1.06 (3H, s), 1.07 (3H, s), 1.09 (3H,s)，1.23 (3H，s);低場(chǎng)處有兩個(gè)活潑氫信號(hào):δ 5.64 (dd，3.0,10.2), δ 6.14 (d，10.2)，推測(cè)是雙鍵上的氫。13C-NMR中顯示兩個(gè)不飽和碳原子δ 129.8和δ 134.0，一個(gè)羧基碳原子δ 179.8。綜合以上信息可以推斷該化合物為烏蘇烷型五環(huán)三萜酸類化合物。
[0020]依據(jù)HSQC、HMBC譜可以對(duì)化合物I的碳?xì)渥鬟M(jìn)一步的歸屬。
[0021]與積雪草酸比較，13C-NMR譜中，化合物I在δ 89.7處出現(xiàn)一個(gè)連氧碳信號(hào)，同時(shí)C-12和C-18分別向低場(chǎng)位移8.4ppm和7.4ppm,以上數(shù)據(jù)說(shuō)明C-13位連有羥基，C / D環(huán)為反式構(gòu)型，確定13位羥基為β型。綜上，確定化合物I的結(jié)構(gòu)為:2 α，3β，13β，23_四羥基烏蘇烷-11-烯-28-酸，為一新化合物，其1H-NMR譜、13C-NMR譜信號(hào)歸屬見(jiàn)表1。
[0022]表1.化合物I的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)
【權(quán)利要求】
1.新的積雪草酸衍生物，其特征在于該化合物具有化學(xué)通式(I)所示的化學(xué)結(jié)構(gòu):
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新的積雪草酸衍生物的制備方法是通過(guò)微生物酶對(duì)積雪草酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的新的積雪草酸衍生物的制備方法為:以積雪草酸為底物，利用微生物酶對(duì)底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，利用乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行萃取，利用硅膠柱層析、凝膠柱色譜進(jìn)行轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對(duì)積雪草酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的微生物為藍(lán)色犁頭霉Absidiacoerulea CGMCC3.2462。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新的積雪草酸衍生物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K31/56GK103467560SQ201310431858
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】陳松, 儲(chǔ)智勇, 馮旭, 鄒贏鋅, 欒潔, 張術(shù), 黃寶康, 高超, 周意 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所