一種長效重組促卵泡激素及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長效重組人促卵泡激素融合蛋白(Human?follicle-stimulating?hormone-Fc?fusion?protein，簡稱hFSH-Fc)及其制備方法，該hFSH-Fc蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包括hFSHβ亞基、CTP、hFSHα亞基、柔性肽接頭和人IgG2Fc變體，其體內(nèi)半衰期比現(xiàn)有促卵泡激素更長，藥效更好。本發(fā)明還涉及重組hFSH-Fc融合蛋白組合物在制備動(dòng)物繁殖領(lǐng)域藥物中的用途。
【專利說明】一種長效重組促卵泡激素及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和獸藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種長效重組人促卵泡激素融合蛋白、其制備方法及應(yīng)用。該融合蛋白體內(nèi)半衰期顯著延長，其在動(dòng)物繁殖領(lǐng)域中的療效優(yōu)于現(xiàn)有促卵泡激素產(chǎn)品。
【背景技術(shù)】 [0002]促卵泡素(Follicle-stimulating hormone,簡稱FSH)是動(dòng)物繁殖領(lǐng)域常用的藥物主要成分，現(xiàn)有上市FSH主要為豬垂體中提取的生化品種，可用于青年母豬提前發(fā)情和同期發(fā)情、及超期不發(fā)情母豬促發(fā)情，在牛和羊繁殖領(lǐng)域也有更廣泛的應(yīng)用。生化提取的FSH存在病毒污染、原料來源有限、采集困難、含量低及純化過程復(fù)雜等缺陷。另外，因檢測方法及病毒滅活技術(shù)的局限性以及一些不可預(yù)知的新致病病毒感染時(shí)有發(fā)生，并不能完全杜絕生化提取產(chǎn)品發(fā)生病毒污染的可能性。
[0003]相比而言，重組FSH在其純度、抗原性、安全性、無病毒感染等方面具有生化FSH產(chǎn)品無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。迄今為止，還未有重組FSH產(chǎn)品用于獸藥領(lǐng)域。FSH是一種糖基化蛋白，SDS-PAGE檢測其分子量為43KD。另外，hFSH是具有兩條單鏈(α鏈和β鏈)的糖基化蛋白，鏈間以非共價(jià)鍵連接，兩條鏈的正確折疊才能保證hFSH的生物活性。如何在蛋白表達(dá)和純化過程中保持兩條鏈的正常結(jié)合是一個(gè)挑戰(zhàn)。作為一種治療藥物，保證其生物活性，必要的條件是具有正確的三維結(jié)構(gòu)和糖基化修飾。具有完善翻譯后修飾功能是哺乳動(dòng)物細(xì)胞被選作大多數(shù)生物藥蛋白表達(dá)宿主的主因。其中，中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese HamsterOvary Cell, CHO)是用于真核生物外源基因表達(dá)最為成功的宿主細(xì)胞，已有越來越多的藥用蛋白在其中獲得了高效表達(dá)，很多人用重組蛋白藥物已上市。與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)，如擁有完備的翻譯后加工過程，包括糖基化、羥基化，使表達(dá)的外源真核基因產(chǎn)物能夠保持其天然結(jié)構(gòu)及活性，且使表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分離純化。
[0004]不同哺乳動(dòng)物種屬之間的FSH蛋白的氨基酸序列同源性很高，例如，人FSH α鏈和β鏈與豬FSHa鏈和β鏈的氨基酸序列同源性分別為83%和96%，人FSH與牛FSH的氨基酸序列同源性高達(dá)88 %，提示hFSH在其他哺乳動(dòng)物繁殖領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。目前已有利用 CHO 細(xì)胞生產(chǎn)的人用藥物重組 hFSH (Human follicle-stimulating hormone,簡稱 hFSH)上市，但仍然存在如下問題:首先，現(xiàn)有方法生產(chǎn)的重組hFSH表達(dá)量太低，制備過程復(fù)雜，生產(chǎn)成本太高；其次，其半衰期短，需要頻繁注射給藥。因此，利用分子生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)方法，開發(fā)具有生物活性和更長半衰期的hFSH藥物是本領(lǐng)域的一個(gè)挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種長效重組人促卵泡激素融合蛋白(Humanfollicle-stimulating hormone-Fc fusion protein,簡稱 hFSH-Fc)、其制備方法及應(yīng)用，該重組hFSH-Fc融合蛋白應(yīng)用于動(dòng)物繁殖領(lǐng)域，與現(xiàn)有生化提取產(chǎn)品相比，體內(nèi)半衰期更長、藥效更好。
[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組hFSH-Fc融合蛋白，該融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含hFSHβ亞基、CTP、hFSHa亞基、肽接頭(Linker，簡稱 L)和人 IgG2Fc 變體(vIgG2Fc)，如 SEQ ID NO:2 所示(hFSH β -CTP-hFSH a -L_vIgG2Fc氨基酸序列)，上述融合蛋白簡述為hFSH-Fc。
[0007]所述的hFSHP亞基的氨基酸序列去除了常規(guī)hFSHP亞基中的1_18位氨基酸殘基，如SEQ ID NO:5所示。
[0008]所述的CTP(carboxy_terminal peptide,羧基端肽)的氨基酸序列來自HCG β鏈羧基末端的28-34個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選CTP為來自HCG β鏈羧基末端的33個(gè)氨基酸殘基序列，如SEQ ID NO:4所示。
[0009]所述的hFSHa亞基的氨基酸殘基序列去除了常規(guī)hFSH α亞基中的1_24位氨基酸殘基，如SEQ ID N0:3所示。
[0010]所述的肽接頭含有2-20個(gè)氨基酸殘基，且肽接頭含有兩個(gè)或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸殘基，優(yōu)選的肽接頭氨基酸序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerο
[0011]所述的人IgG Fe變體為含有ProSSlSei*突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。
[0012]以下具體介紹本發(fā)明的人IgG Fe變體、肽接頭和CTP功能:
[0013]IgG Fe 變體
[0014]IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)，它們的半衰期可高達(dá)21天，而Fe片段是IgG保持體內(nèi)較長半衰期的主要原因，同時(shí)具有穩(wěn)定蛋白的作用。
[0015]Fe來自免疫球蛋白的Fe區(qū)域，F(xiàn)e在消滅病原體的免疫防御中具有重要作用。IgG的效應(yīng)子功能由Fe介導(dǎo)，通過兩種主要機(jī)制:(I)與細(xì)胞表面Fe受體(FcyRs)的結(jié)合，通過抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)途徑消化病原體，或(2)與第一補(bǔ)體成分Cl的Clq部分的結(jié)合，引發(fā)依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。在四種人IgG同種型(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)中，人IgG2與Fe Y Rs幾乎不結(jié)合，而和Clq的結(jié)合作用很弱。對(duì)于人的醫(yī)療用途而言，重組融合蛋白的Fe區(qū)域必須不能介導(dǎo)不良效應(yīng)子功能，從而才不會(huì)裂解或除去這些細(xì)胞。因此，hFSH-Fc的Fe區(qū)域必須是非裂解性的，即在結(jié)合Fe Y Rs和Clq而觸發(fā)效應(yīng)子功能方面，F(xiàn)e最好是無活性的。顯然，沒有一種天然的IgG同種型適合產(chǎn)生hFSH-L-Fc重組二聚化蛋白。為了得到非裂解性的Fe，必須使天然Fe區(qū)域中的一些氨基酸突變，以減少其效應(yīng)子功能。
[0016]通過分析IgG同種型的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)CH2區(qū)域氨基末端附近的Fe部分顯示在IgG Fe與Fe Y Rs的結(jié)合中起作用，而與Clq結(jié)合至關(guān)重要的部分位于人IgG的CH2區(qū)域羧基端附近。人IgG2不結(jié)合Fe Y Rs，但與Clq存在較弱結(jié)合，為了最大化減少Fe與Clq的結(jié)合而引發(fā)的效應(yīng)子功能，本發(fā)明使用人IgG2Fc變體(vIgG2Fc):含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如圖1)，該Fe變體比天然IgG2Fc表現(xiàn)出最小化的效應(yīng)子功能，更適于制備重組hFSH-Fc融合蛋白。
[0017]肽接頭
[0018]連接肽的長度對(duì)重組二聚化蛋白的活性非常重要。本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，首次設(shè)計(jì)了一種獨(dú)特的絞鏈區(qū)肽接頭來降低空間位阻效應(yīng)，可以制得hFSHa鏈的C端與Fe變體偶聯(lián)的重組二聚化蛋白，中間有柔軟的肽接頭。此重組二聚化蛋白不僅不會(huì)導(dǎo)致hFSH的功能喪失，反而能夠維持、甚至提高h(yuǎn)FSH-Fc重組二聚化蛋白的生物活性。優(yōu)選肽接頭的氨基酸殘基序列為 GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
[0019]CTP
[0020]糖基化對(duì)于蛋白的活性和半衰期有重要作用，蛋白上的糖基化位點(diǎn)有兩類，包括O-糖肽鏈和N-糖肽鏈。CTP是一段來自HCG β鍵羧基末端的28-34個(gè)氨基酸殘基，有文獻(xiàn)報(bào)道HCG較hFSH相對(duì)長的半衰期，主要來源于此CTP肽段。它含有O-連接的糖基化位點(diǎn)，可以增加蛋白的糖基化水平，提高蛋白的活性和延長蛋白在體內(nèi)的半衰期。
[0021]本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白具有以下特征:該重組融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含hFSH β亞基、CTP、hFSHa亞基、肽接頭和人IgG2Fc變體。人IgG2Fc變體具有延長體內(nèi)半衰期和穩(wěn)定蛋白的作用，F(xiàn)e變體是非裂解性的，可最大化減少與Fe Y Rs和Clq結(jié)合而觸發(fā)的效應(yīng)子功能。CTP可提高蛋白活性及延長體內(nèi)半衰期，其無免疫原性，通過CTP連接hFSH的α鏈和β鏈，可以使兩條鏈之間有一定的位阻，有利于其正確折疊而不影響功能。通過柔軟的肽接頭進(jìn)行hFSH α鏈的C端與Fe變體的偶聯(lián)，能夠維持、甚至提高重組hFSH-Fc融合蛋白的生物活性。.[0022]本發(fā)明首次將CTP、肽接頭和人IgG2Fc變體有序地連接到FSH中而形成新型的重組hFSH-Fc融合蛋白，并首次應(yīng)用于動(dòng)物繁殖領(lǐng)域。該融合蛋白中人IgG2Fc變體、CTP和肽接頭的位置排列能維持FSH正確的空間構(gòu)型，而不影響其生物活性，并可顯著延長半衰期，與現(xiàn)有動(dòng)物繁殖用藥方案比較，可大大減少注射次數(shù)，且療效更好。
[0023]本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，該制備方法包括:
[0024](I)構(gòu)建編碼重組hFSH-Fc融合蛋白的基因表達(dá)載體；
[0025](2)重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)；
[0026](3)高密度細(xì)胞培養(yǎng)重組hFSH-Fc融合蛋白；
[0027](4)重組hFSH-Fc融合蛋白的純化制備。
[0028]具體來說，構(gòu)建編碼重組hFSH-Fc蛋白的基因表達(dá)載體步驟為:采用人工合成方法獲得編碼重組hFSH-Fc融合蛋白基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(如SEQ ID N0:1所示)，插入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體(如P⑶NA3)或改進(jìn)的表達(dá)載體(如pCMV-DHFR)，獲得含有hFSH-Fc目的基因表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3-hFSH-Fc (圖4)?；虻暮塑账嵝蛄袃?yōu)化是基于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞偏愛的密碼子來選擇設(shè)計(jì)。
[0029]所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體可采用市售的但不限于，如:p⑶NA3、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的載體，優(yōu)選，pCDNA3。
[0030]重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)步驟為:將含有hFSH-Fc蛋白的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定高表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。
[0031]所述的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括CH0、HEK293、C0S、BHK、NS0和Sp2/0細(xì)胞。優(yōu)選，CHO細(xì)胞；更優(yōu)選，已馴化適應(yīng)無血清培養(yǎng)基中懸浮生長的DHFR(Dihydrofolate Reductase,二氫葉酸還原酶)缺陷型CHO細(xì)胞(簡稱CHO DHFR-)。
[0032]所述的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣法，電穿孔轉(zhuǎn)染方法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，優(yōu)選的轉(zhuǎn)染方法是電穿孔轉(zhuǎn)染方法。
[0033]所述的篩選方法是先利用篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選，然后用擴(kuò)增選擇性標(biāo)記可提高表達(dá)量并獲得穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株。篩選標(biāo)記是本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何一個(gè)合適的選擇性抗性標(biāo)記，如ZEO (Zeocin,博來霉素)、G418 (氨基糖苷類抗生素)、PUR(puromycin,嘌呤霉素)、HYP (Hygromycin,潮霉素)，優(yōu)選的抗性基因?yàn)閆EO ;篩選標(biāo)記也可為本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何一個(gè)突光標(biāo)記基因，包括GFP (Green Fluorescent Protein,綠色突光蛋白)、RFP (RedFluorescent Protein,紅色突光蛋白)，優(yōu)選的突光標(biāo)記基因?yàn)镚FP。擴(kuò)增選擇性標(biāo)記是本領(lǐng)域內(nèi)已知的DHFR序列或GS(Glutaminesynthetase,谷氨酰胺合成酶)序列，優(yōu)選的擴(kuò)增選擇性基因是DHFR。由于CHO-DHFR-細(xì)胞自身缺失二氫葉酸還原酶(DHFR)，無法自身合成四氫葉酸,所以必須在添加了次黃嘌呤(hypoxanthine)、胸腺喃唳(Thymidine)和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。而通過目的基因與DHFR基因共轉(zhuǎn)染，不僅得到在不含上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長的細(xì)胞克隆，更為重要的是由于DHFR可被葉酸類似物MTX (Methotrexate，氨甲喋呤)所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，DHFR基因必須擴(kuò)增到很多的拷貝數(shù)才能生存，從而得到抗MTX細(xì)胞系；又由于與DHFR基因共轉(zhuǎn)染的目的基因傾向于同它一起整合到細(xì)胞染色體上的同一區(qū)域，所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著DHFR基因的擴(kuò)增而擴(kuò)增，可得到大量表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞克隆。
[0034]高密度細(xì)胞培養(yǎng)重組hFSH-Fc融合蛋白的步驟為:將上述篩選到的穩(wěn)定細(xì)胞株轉(zhuǎn)入搖瓶或生物反應(yīng)罐進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，特別是，本發(fā)明通過對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得高表達(dá)重組hFSH-Fc融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法可實(shí)現(xiàn)高密度細(xì)胞培養(yǎng)、重組蛋白質(zhì)量和產(chǎn)量提升、重組蛋白的糖基化程度增加以及唾液酸含量提高。
[0035]所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化包括降溫培養(yǎng)法，具體來說，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到I X IO7個(gè)/mL時(shí)，將溫度由37°C降至33°C，在該溫度下培養(yǎng)直至表達(dá)產(chǎn)量不再增加。該方法可以提高表達(dá)蛋白的活力水平及重組蛋白的累積產(chǎn)量。
[0036]所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法還包括在培養(yǎng)基中加入特殊的添加劑，優(yōu)選，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入100 μ M Cu2+，feeding培養(yǎng)基加入2mM Man NAc (N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。該方法可使重組hFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高約20 %。
[0037]重組hFSH-Fc融合蛋白的純化制備步驟為:
[0038]DProtein A親和層析:離心，收集上清，根據(jù)本發(fā)明蛋白偶聯(lián)Fe片段的特性，利用親和Protein A柱層析。
[0039]2)疏水層析柱純化:采用疏水層析柱，根據(jù)重組hFSH-Fc融合蛋白的疏水性不同，進(jìn)一步去除上述Protein A純化后目標(biāo)蛋白中的雜質(zhì)。
[0040]所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。優(yōu)選，Phenyl Sepharose6Fast Flow。
[0041]本發(fā)明所公開的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，該制備方法可獲得表達(dá)產(chǎn)量高重組hFSH-Fc融合蛋白。因與IgG2Fc變體的偶聯(lián),所形成的重組蛋白可以通過ProteinA親和層析得到高效便捷的純化。經(jīng)疏水層析進(jìn)一步純化后得到的融合蛋白純度達(dá)到98%以上。此外，本發(fā)明所公布的重組hFSH-Fc融合蛋白中α鏈和β鏈可正確折疊在一起，避免了 α-α 二聚體、β-β 二聚體的出現(xiàn)，大大簡化了純化步驟，降低了生產(chǎn)成本。[0042]本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供了一種含有重組長效hFSH-Fc融合蛋白的藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發(fā)明所述的重組長效hFSH-Fc融合蛋白。
[0043]具體來說，所述的藥物組合物含有有效量(如0.000001-90wt % ;較佳的
0.l-50wt% ;更佳的，5-40wt% )的本發(fā)明的重組長效hFSH-Fc融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將有效量的本發(fā)明融合蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。
[0044]所述的藥學(xué)上可接受的載體包括(但并不限于):蔗糖、甘露醇、吐溫20 (Tween20)、蛋氨酸、鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、及其組合物。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。
[0045]本發(fā)明所述的融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于:所述的融合蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；動(dòng)物所要治療疾病的嚴(yán)重程度、動(dòng)物的體重、動(dòng)物的免疫狀況、給藥途徑等。
[0046]本發(fā)明的再一個(gè)目的是重組hFSH-Fc融合蛋白在動(dòng)物繁殖領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0047]本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白體內(nèi)半衰期顯著延長，從而改善了藥物動(dòng)力學(xué)和藥效，與現(xiàn)有FSH比較，可減少注射次數(shù)，減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0048]本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白及其制備方法的優(yōu)點(diǎn)概括如下:
[0049]1.本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白是由IgG2Fc變體和CTP與hFSH有序偶聯(lián)形成的新型融合蛋白，維持了 FSH的正確空間構(gòu)型，可顯著延長蛋白的體內(nèi)半衰期，大大提高h(yuǎn)FSH在CHO細(xì)胞中的表達(dá)量。
[0050]2.二聚化單鏈hFSH-Fc融合蛋白的α鏈與β鏈以共價(jià)鍵正確折疊，避免形成α-α 二聚體和β-β 二聚體，大大簡化了純化工藝，降低生產(chǎn)成本。
[0051]3.本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白體內(nèi)半衰期顯著延長，其半衰期是現(xiàn)有豬垂體FSH的10倍，可減少注射次數(shù)，且其療效更優(yōu)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1.顯示了人IgG2及其變體的絞鏈區(qū)和CH2區(qū)域的氨基酸序列的比對(duì)。比較這三部分氨基酸序列:氨基酸區(qū)域228、234-237和330-331。其變體的氨基酸突變以粗斜體顯示。氨基酸殘基編號(hào)是根據(jù)EU編號(hào)體系標(biāo)定。
[0053]圖2.顯示了 hFSH-Fc單鏈及二聚化結(jié)構(gòu)示意圖。a)單鏈hFSH-Fc ；b) 二聚化的hFSH-Fcο
[0054]圖3.顯示了在P⑶NA3表達(dá)載體內(nèi)HindII1-EcoRI片段的hFSH-Fc的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。hFSH-Fc的核苷酸序列包括編碼含前導(dǎo)肽(1-18)、hFSHii鏈、CTP、成熟hFSHa鏈、肽接頭、IgG2Fc變體(vIgG2Fc)。成熟的重組hFSH-Fc融合蛋白含有成熟hFSHP 鏈(19-129)、CTP(130-162)、成熟 α 鏈(163-254)、肽接頭(255-270)和 IgG2Fc 變體(vIgG2Fc) (271-493)。
[0055]圖4.顯示了所構(gòu)建編碼hFSH-Fc融合蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒圖譜。該表達(dá)質(zhì)粒全長9063bp，含有10個(gè)主要基因片斷，包括1.CMV啟動(dòng)子；2.目標(biāo)基因hFSH-Fc ；3.1RES ；4.Zeocin抗性篩選基因；5.BGH終止子；6.SV40啟動(dòng)子-,1.DHFR擴(kuò)增基因；8.SV40終止子；
9.氨節(jié)青霉素抗性基因(Ampicillin) ；10.ColEl復(fù)制起點(diǎn)(Ori)。
[0056]圖5.顯示了在7L生物反應(yīng)器中重組hFSH-Fc細(xì)胞株表達(dá)分泌hFSH-Fc蛋白的累積趨勢曲線圖。
[0057]圖6.Western bloting結(jié)果顯示了重組hFSH-Fc融合蛋白在CHO細(xì)胞中的成功表達(dá)。非還原膠，Lanel:豬垂體FSH(約43kDa) ;Lane2:本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白(約140kDa)。
[0058]圖7.顯示了單鏈和二聚化hFSH-Fc在還原條件和非還原條件下的10% SDS-PAGE電泳圖譜。a)還原型膠，單鏈hFSH-Fc (約70kDa) ;b)非還原膠，二聚化hFSH-Fc (約140kDa)。
[0059]圖8.顯示了純化的重組hFSH-Fc融合蛋白與豬垂體FSH在大鼠體內(nèi)的代謝曲線?！揪唧w實(shí)施方式】
[0060]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0061]實(shí)施例1.構(gòu)建編碼重組hFSH-Fc融合蛋白的基因表達(dá)載體
[0062]基因序列設(shè)計(jì)是基于CHO細(xì)胞偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化，采用人工合成的方法合成經(jīng)過優(yōu)化的含有編碼hFSH蛋白β鏈的信號(hào)肽及其成熟肽段、CTP和hFSHa鏈成熟肽段的融合基因，將所合成的756bp DNA片段插入轉(zhuǎn)移載體如PUC57中的EcoRV限制性酶切位點(diǎn)間，獲得了 hFSH質(zhì)粒(phFSH)，使用DNA測序方法驗(yàn)證插入序列的正確性。
[0063]分別人工合成含有BamHI (5 ’端)和EcoRI (3 ’端)酶切位點(diǎn)的編碼柔性肽接頭(Linker，檢測“L”)和Fe變體(vIgG2Fc)片段的融合基因L-vIgG2Fc。將獲得的融合基因片段分別插入到轉(zhuǎn)移載體如TOC19的BamHI和EcoRI位點(diǎn)間，得到含F(xiàn)e變體的質(zhì)粒pL_vIgG2Fc。通過DNA測序驗(yàn)證L-vIgG2Fc、的基因序列。為制備hFSH-L-Fc融合基因，用限制性內(nèi)切酶SpeI和BamHI雙酶切phFSH質(zhì)粒，凝膠電泳后膠回收編碼hFSH蛋白β鏈的信號(hào)肽及其成熟肽段、CTP和hFSHa鏈成熟肽段的融合基因片段，經(jīng)純化的上述基因片段插入到pL-vIgG2Fc質(zhì)粒中肽接頭的5'-端，T4連接酶連接構(gòu)成phFSH-L_vIgG2Fc質(zhì)粒。所構(gòu)建的融合基因由hFSH β、CTP、hFSH α、肽接頭和Fe變體基因組成，其單鏈結(jié)構(gòu)如圖2a所示，二聚化結(jié)構(gòu)如圖2b所示。
[0064]限制性內(nèi)切酶Spel/EcoRI雙酶切phFSH-L_vIgG2Fc質(zhì)粒，DNA凝膠純化得到hFSH-L-vIgG2Fc片段。將純化好的hFSH-L-Fc片段插入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒如P⑶NA3 (Invitrogen)的相應(yīng)酶切位點(diǎn)間，最終獲得含融合基因表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3-hFSH-L-vIgG2Fc，簡稱為pCDNA3-hFSH_Fc質(zhì)粒，如圖4所示。該質(zhì)粒含哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源基因蛋白所需的啟動(dòng)子CMV;該質(zhì)粒還含有兩種選擇性標(biāo)記基因，從而在細(xì)菌中可以具有氨芐青霉素抗性，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以具有博來霉素(zeocin)抗性。此外，當(dāng)宿主細(xì)胞是DHFR基因表達(dá)缺陷型時(shí)，P⑶NA3表達(dá)載體所含有的小鼠的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，使其在氨甲蝶呤(MTX)存在時(shí)，能共擴(kuò)增pFSH-Fc融合基因和DHFR基因。
[0065]用CTP肽段連接hFSH的α鏈和β鏈，可便于兩條鏈正確折疊。通過肽接頭(較佳地為柔性接頭)進(jìn)行hFSH和Fe片段的偶聯(lián)可提高蛋白的生物活性，對(duì)本發(fā)明而言，優(yōu)選的是長度為約20個(gè)或更少(但不能少于2個(gè))氨基酸的肽接頭，當(dāng)然由I個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽接頭也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，宜使用含有或由2個(gè)或更多選自以下氨基酸構(gòu)成的肽接頭:甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。本發(fā)明實(shí)施例的肽接頭含有Gly-Ser肽構(gòu)件，其氨基酸序列為 GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
[0066]實(shí)施例2.重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)
[0067]將實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒P⑶NA3-hFSH-L_Fc轉(zhuǎn)染入DHFR酶缺陷型CHO宿主細(xì)胞(CH0-DHFR_)，圖2b顯示了重組二聚化hFSH-Fc融合蛋白的示意圖。采用電穿孔方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用 960 μ F d 電容的 Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA)，將其電場設(shè)置為250V，在比色杯內(nèi)的2~5X107個(gè)細(xì)胞中加入10 μ g用PvuI線性化的質(zhì)粒DNA。在轉(zhuǎn)染兩天后，將培養(yǎng)基改成含100 μ g/mL Zeocin抗性標(biāo)記基因的生長培養(yǎng)基，獲得經(jīng)抗性初篩的轉(zhuǎn)染子。采用western blotting的方法,用抗hFSH抗體檢測hFSH-Fc的表達(dá)，如圖6。利用DHFR擴(kuò)增選擇性標(biāo)記基因提高重組二聚化蛋白的表達(dá)水平，為此在含有遞增濃度MTX的生長培養(yǎng)基中，用DHFR基因共擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的重組二聚化蛋白基因。用極限稀釋法亞克隆能在高達(dá)10 μ Μ/mL MTX培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)染子。對(duì)亞克隆細(xì)胞系的分泌率作進(jìn)一步分析。篩選分泌水平超過約10(較佳地約20) μ g/106(即百萬)個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)的細(xì)胞株，獲得穩(wěn)定高表達(dá)重組hFSH-Fc融合蛋白的細(xì)胞株。
[0068]實(shí)施例3.重組hFSH-Fc融合蛋白的生產(chǎn)和純化
[0069]將實(shí)施例2得到的高產(chǎn)量細(xì)胞株，首先在培養(yǎng)皿中進(jìn)行無血清馴化培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到搖瓶中進(jìn)行懸浮馴化培養(yǎng)，馴化過程中同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基的篩選，加入不同的成分觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)、生長趨勢，以及表達(dá)產(chǎn)物的活性和唾液酸等生化指標(biāo)，優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)條件為:基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入100 μ M Cu2+，feeding培養(yǎng)基加入2mM Man NAc (N-乙酰基-D-氨基甘露糖)，該方法可使重組hFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高約20%。馴化成功后，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，擴(kuò)增到足夠量，進(jìn)行7L生物反應(yīng)器監(jiān)測培養(yǎng)，在細(xì)胞密度超過I X IO7個(gè)/mL時(shí)開始降溫至33°C培養(yǎng)，批次生長周期為20天。用lml Protein A柱層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行初步純化，測定重組hFSH-Fc融合蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示，重組hFSH-L-vIgG2Fc細(xì)胞株表達(dá)的累積產(chǎn)量為1.87g/L(圖5)。
[0070]重組hFSH融合蛋白的純化包括以下步驟:
[0071]DProtein A親和層析:離心，收集上清，根據(jù)本發(fā)明蛋白偶聯(lián)Fe片段的特性，利用親和層析方法，將上清液加樣到磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)平衡的Protein A柱；待重組融合蛋白結(jié)合于Protein A后，用PBS洗滌該柱，直至0D280值低于0.01，再用20mM pH為
4.0的醋酸鈉緩沖液洗脫結(jié)合的重組FSH-Fc融合蛋白，最后用ρΗΙΟ.0的IM Tris-HCl緩沖液中和活性收集液。純化的hFSH-Fc蛋白純度可達(dá)到95%以上。
[0072]2)疏水柱層析:用超濾方法將上述protein A活性收集液更換為20mMTris-HCl-L5M NaCl(pH8.0)緩沖液，將該樣品加樣到用 2OmM Tris-HC1-1.5MNaCl (pH8.0)平衡過的phenyl_6Fast Flow柱，先用相同的平衡液淋洗，再用20mMTris-HCl-L 35M NaCl (pH8.0)淋洗，最后用 20mM Tris-HCl-0.5M NaCl (pH8.0)緩沖液洗脫。
[0073]Western bloting結(jié)果顯示了重組hFSH-Fc融合蛋白在CHO細(xì)胞中的成功表達(dá),如圖6所示，在非還原條件下SDS-PAGE膠電泳圖譜，豬垂體FSH (商業(yè)產(chǎn)品)和本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白分別在43kDa和140kDa顯示相對(duì)應(yīng)的目標(biāo)蛋白雜交條帶,驗(yàn)證了本發(fā)明得到的重組hFSH融合蛋白中含有FSH蛋白。圖7是純化的hFSH-Fc融合蛋白在還原和非還原條件下的SDS-PAGE膠電泳圖譜。結(jié)果顯示，純化的hFSH-Fc蛋白純度可達(dá)到98%以上，hFSH-Fc在還原條件下的分子量為非還原條件下分子量的50%。
[0074]實(shí)施例4.重組hFSH-Fc融合蛋白的體內(nèi)外活性測定
[0075]本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白的體外活性(免疫原活性)采用B10CHECK (美國)公司生產(chǎn)的FSH酶免疫定量檢測試劑盒檢測，方法參考試劑盒說明書。體內(nèi)活性采用2010版《英國藥典》中的卵巢增重法進(jìn)行檢測。蛋白質(zhì)含量測定使用LOWRY定量法。取HCG制劑，加0.1%白蛋白磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.2 + 0.2)溶液，制成含有70IU/ml HCG的供試品稀釋液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示量、豬垂體FSH和重組hFSH-Fc融合蛋白估計(jì)效價(jià)，用供試品稀釋液(pH7.2±0.2)將標(biāo)準(zhǔn)品、豬垂體FSH和重組hFSH-Fc融合蛋白配制成含F(xiàn)SH3.33IU/ml、1.67IU/ml、0.83IU/ml高中低三個(gè)劑量的工作液。選用19~28日齡，年齡相差不得超過3日，體重相差不得超過10克的Wistar雌鼠。標(biāo)準(zhǔn)品、豬垂體FSH組和hFSH-Fc組均分為高中低三個(gè)劑量，每組6只動(dòng)物。大鼠頸后皮下注射，每天注射兩次，每次注射體積為0.2ml,連續(xù)注射三天，每天在相同時(shí)間給藥。 最后一次注射給藥24小時(shí)后，按照給藥順序采用脫臼法處死動(dòng)物，取卵巢，剝離吸干表面水分后稱重，記錄器官重量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品卵巢增重采用量反應(yīng)平行線法計(jì)算豬垂體FSH和hFSH-Fc的活性。測得重組hFSH-Fc融合蛋白和豬垂體FSH的體外活性分別為10105和8321IU/ml，其體內(nèi)活性分別為10230和7523IU/ml，結(jié)果表明，本發(fā)明的重組hFSH-Fc融合蛋白具有體內(nèi)外生物學(xué)活性。
[0076]實(shí)施例5.重組hFSH-Fc融合蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)測定
[0077]分為本發(fā)明重組hFSH-vIgG2Fc融合蛋白給藥組和豬垂體FSH給藥組，每組選用體重200-250g的雄性wistar大鼠5只，分別按15IU/kg給予肌肉注射。豬垂體FSH組在給藥后 l、2、3、4、6、8、12、36、60h取血，重組hFSH-Fc 融合蛋白分別在給藥后 1、2、4、8、12、24、56、120、176、200、264、34011取血，3000印111離心51^11后，吸取血清，-201:保存。采用ELISA試劑盒(B10CHECK，美國)測定各時(shí)間點(diǎn)血漿中FSH免疫活性。使用kinetica4.4軟件，通過統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算各組主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。各組藥代動(dòng)力學(xué)曲線如圖8所示，半衰期結(jié)果如表
I。結(jié)果顯示，豬垂體FSH在大鼠體內(nèi)的消除半衰期約為3.05h，而等劑量重組hFSH-vIgG2Fc融合蛋白的消除半衰期約為為47.24h，是豬垂體FSH的10倍以上。
[0078]表1重組hFSH-Fc融合蛋白和豬垂體FSH的半衰期
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種重組hFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白為二聚化融合蛋白，其氨基酸序列從N端到C端依次包含hFSH β亞基、CTP、hFSHa亞基、肽接頭和人IgG2Fc變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的hFSHβ亞基的氨基酸序列是去除了常規(guī)hFSHii亞基中的1-18位氨基酸殘基之后的hFSHβ SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；其中所述的CTP的氨基酸序列是來自HCG β鏈羧基末端的28-34個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選CTP為來自HCG β鏈羧基末端的33個(gè)氨基酸殘基序列，如SEQ ID NO:4所示；其中所述的hFSHa亞基的氨基酸殘基序列是去除了常規(guī)hFSHa亞基中的1_24位氨基酸殘基之后的hFSHa SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；其中所述的肽接頭含有2_20個(gè)氨基酸，所述肽接頭存在于hFSHa亞基和人IgG Fe變體之間，且肽接頭含有兩個(gè)或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的氨基酸，優(yōu)選序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
3.根據(jù)權(quán)利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的人IgG2Fc變體為含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組hFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.編碼根據(jù)權(quán)利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白的核苷酸序列，特征在于其序列如SEQID NO:1 所示。
6.—種權(quán)利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，其步驟包括: 1)構(gòu)建編碼重組hFSH-Fc融合蛋白的基因表達(dá)載體: 采用人工合成方法獲得編碼人hFSH-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，獲得含有hFSH-Fc融合蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒； 2)重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá): 將含有hFSH-Fc融合蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)hFSH-Fc融合的細(xì)胞株； 3)高密度細(xì)胞培養(yǎng)重組hFSH-Fc融合蛋白: 將上述篩選到的穩(wěn)定細(xì)胞株轉(zhuǎn)入搖瓶或細(xì)胞反應(yīng)罐進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到I X IO7個(gè)/mL時(shí)，將溫度由37°C降至33°C，在該溫度下培養(yǎng)直至表達(dá)產(chǎn)量不再增加； 4)重組hFSH-Fc融合蛋白的純化制備: a)ProteinA親和層析:離心，收集上清，根據(jù)本發(fā)明蛋白偶聯(lián)Fe片段的特性，利用親和Protein A柱層析； b)疏水層析柱純化:經(jīng)疏水層析純化進(jìn)一步去除上述ProteinA純化后目標(biāo)蛋白中的雜質(zhì)； 所述的疏水柱包括 Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B, Phenyl Sepharose CL-4B。優(yōu)選，Phenyl Sepharose6Fast Flow。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，其中步驟I)中所述的基因表達(dá)載體為 pCDNA3、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT 或 pCMV-DHFR，優(yōu)選，pCDNA3 ;其中步驟2)中所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔轉(zhuǎn)染方法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)融合，優(yōu)選，電穿孔轉(zhuǎn)染方法；所述的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括CH0，HEK293、BHK、NS0和Sp2/0細(xì)胞，優(yōu)選，CHO細(xì)胞，更優(yōu)選，DHFR酶缺陷型CHO懸浮細(xì)胞(CHO DHFR-)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組hFSH-Fc融合蛋白的制備方法，其中步驟3)中還包括在培養(yǎng)基中加入添加劑，優(yōu)選，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入100 μ M Cu2+，feeding培養(yǎng)基加入2mM ManNAc (N-乙?；?D-氨基甘露糖)。
9.一種藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的重組hFSH-Fc融合蛋白。
10.權(quán)利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白在制備動(dòng)物繁殖領(lǐng)域藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P15/00GK103539862SQ201310529898
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月1日
【發(fā)明者】侯永敏, 吳茂柏, 李屹晨, 雷瑤, 徐楨琦 申請人:廣州優(yōu)聯(lián)康醫(yī)藥科技有限公司