專利名稱：純化重組促卵泡激素的方法
純化重組促卵泡激素的方法本發(fā)明涉及純化重組促卵泡激素(FSH)或者重組FSH變體的方法。該方法包括將含有重組FSH或者重組FSH變體的液體進(jìn)行陰離子交換層析、疏水作用層析和染料親和層析，其中這些層析可以以任意順序進(jìn)行，并且其中該方法既不包括弱的陰離子交換層析又不包括反相層析。此純化的方法得到高產(chǎn)量的重組促卵泡激素，其具有期望程度的純度。得到的促卵泡激素在預(yù)防和治療病癥和醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥中尤其有用，在所述病癥和醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥中認(rèn)為促卵泡激素制劑是有用的藥物。促卵泡激素(FSH)由垂體前葉的促性腺激素細(xì)胞產(chǎn)生并被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中。促卵泡激素與黃體生成素(LH)在控制雌性中卵母細(xì)胞的成熟和雄性中的精子發(fā)生中一起作用。促卵泡激素與黃體生成素都屬于異源二聚體的糖蛋白家族，其由分離的基因編碼的兩條非共價(jià)鍵連接的α鏈和β鏈組成。α鏈和β鏈都被糖基化。α亞基由92個(gè)氨基酸殘基組成，而β亞基由111個(gè)氨基酸殘基組成，每條亞基都含有兩個(gè)潛在的天冬酰胺連接的糖基化位點(diǎn)。人促卵泡激素用于治療不能排卵的婦女，用于刺激多卵泡的發(fā)育(超排卵)和如 IVF, ICSLGIFT或者CIFT等的協(xié)助受孕的準(zhǔn)備。此外，人促卵泡激素用于在具有低的或者沒有促卵泡激素產(chǎn)生的婦女中刺激卵泡的成熟，并且在少精液癥男性中刺激精子發(fā)生。在誘導(dǎo)排卵的典型的治療方案中，患者在大約6至大約12天中每天注射ras或者其變體(每天大約75-450IU FSH)。在受控的卵巢過度刺激的典型治療方案中，患者在大約 6至大約12天中每天注射FSH或者其變體(大約每天150-600IU FSH)。為了刺激精子發(fā)生，一種方案將每周三次150IU FSH和每周兩次2. 500IU hCG聯(lián)合使用，此方案已經(jīng)在患有低促性腺激素性性腺功能減退的男性中成功的實(shí)現(xiàn)了精子數(shù)量的增加。直到20世紀(jì)80年代，人促卵泡激素主要的來源是從育齡婦女的尿液中分離出來的尿源促卵泡激素。在20世紀(jì)90年代引進(jìn)了高純度的尿源促卵泡激素的進(jìn)一步純化類型，并且從1998年以來最終開發(fā)了重組的促卵泡激素并被廣泛使用。隨著重組DNA技術(shù)的到來，在轉(zhuǎn)染了編碼α鏈和β鏈的核酸序列的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生人促卵泡激素變得可能。 例如在WO 88/10270，WO 86/04589和EP 0 735 139中公布了編碼α鏈和β鏈的DNA序列和生產(chǎn)重組促卵泡激素的方法。目前，在德國市場(chǎng)上有兩種商業(yè)的重組人促卵泡激素產(chǎn)品，GONAL-f^* !!!·^^!
，這兩種產(chǎn)品都是通過在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)編碼人野生型的α鏈和β鏈的 DNA序列生產(chǎn)的。由于促卵泡激素在治療生育病癥中的重要性，提供高純度和高比活性的重組促卵泡激素是所希望的。促卵泡激素治療需要重復(fù)注射。高度純化的促卵泡激素制劑可以通過皮下施用，其允許患者自己施用，因此增加了患者的便利和依從性。Ares Trading S. A的國際專利申請(qǐng)WO 2006/051070 Al描述了一種純化重組促卵泡激素的方法，其包括以下步驟1)染料親和層析，2)疏水作用層析；和3)反相層析。WO 2006/051070 Al進(jìn)一步公開了一種純化促卵泡激素的方法，其包括將促卵泡激素進(jìn)行1)陰離子交換層析，2)染料親和層析，3)疏水作用層析，4)反相層析和5)陰離子交換層析的步驟。Ares Trading S. A的國際專利申請(qǐng)WO 2005/063811 Al涉及一種純化重組促卵泡激素的方法，其包括(1)離子交換層析；(2)固定化的金屬離子層析；和(3)疏水作用層析 (HIC)的步驟。Ares Trading S. A的WO 2007/065918 A2描述了一種純化促卵泡激素的方法，其包括層析步驟染料親和層析，弱的陰離子交換層析，疏水作用層析以及強(qiáng)的陰離子交換層析，這些層析可以以任意順序進(jìn)行。持續(xù)需要純化重組促卵泡激素以及其變體的新方法。特別地，需要避免使用反相層析步驟的純化方法。進(jìn)一步的，不依賴于免疫親和層析但是可以在沒有這種成本密集型的步驟的情況下進(jìn)行的純化方法是所希望的。按照本發(fā)明，通過主權(quán)利要求的特征解決了這些和進(jìn)一步的問題。在從屬權(quán)利要求中限定了有利的實(shí)施方案。本發(fā)明的目的是提供一種純化重組促卵泡激素或者重組促卵泡激素變體的有利的新方法。一方面，本發(fā)明提供一種從含有粗制的促卵泡激素的溶液中純化重組人促卵泡激素或者其變體的方法，其包括以下步驟-陰離子交換層析，-疏水作用層析，和-染料親和層析，這些層析可以以任意順序進(jìn)行，其中所述方法避免任何弱的陰離子交換層析以及任何反相層析。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不同的層析步驟按照以下順序進(jìn)行(1)陰離子交換層析， (2)疏水作用層析，和(3)染料親和層析。陰離子交換層析(AEC)依賴于樣品中蛋白質(zhì)和固定在樹脂上電荷之間的電荷-電荷相互作用。在陰離子交換層析中，蛋白質(zhì)的結(jié)合離子是帶負(fù)電，而固定的官能團(tuán)是帶正電。通常使用的陰離子交換樹脂是Q-樹脂，季銨和DEAE樹脂(二乙基氨基乙烷)。然而，一般陰離子交換層析步驟可以使用所有的通常商業(yè)上可得到的陰離子交換樹脂或者膜進(jìn)行。陰離子交換樹脂可以以預(yù)裝柱的形式使用。備選地，可以自己準(zhǔn)備層析柱。與其他普通的層析注相比，這種層析柱沒有容積和形狀的具體限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道使用的陰離子交換樹脂的量取決于捕獲步驟中應(yīng)用于層析柱的細(xì)胞培養(yǎng)液或者其它液體，例如，前面層析步驟的洗脫液中的總體蛋白質(zhì)含量?？捎糜诒景l(fā)明的目的的典型的強(qiáng)陰離子交換柱樹脂包括官能團(tuán)如季銨基乙基 (QAE)部分，樹脂包括例如 iToyopearl QAE (從 iTosoh Bioscience，德國購買)，Selectacel QAE(纖維素的一種季銨基乙基衍生物，從Polysciences Inc.，美國賓夕法尼亞州購買) 和其他的；季銨(Q)部分，樹脂包括例如，Q Sepharose XL, Q Sepharose FF, Q Sepharose HP(從GE Healthcare,德國購買)，Resource Q(從GE Healthcare,德國購買)，Macro Prep High Q (從 Bio-Rad，美國加利福尼亞州購買)，Toyopearl SuperQ (從 Tosoh Bioscience, 德國獲得)，UNOsphere Q(從Bio-Rad，美國加利福尼亞州購買)，和三甲基銨乙基(TMAE) 基團(tuán)，樹脂包括例如，F(xiàn)ractogelEMD TMAE (從Merck，德國購買)。
陰離子交換層析優(yōu)選地是強(qiáng)陰離子交換層析，其使用具有N+(CH3)3官能團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換樹脂或者具有類似特征的樹脂進(jìn)行?？捎糜诒景l(fā)明目的的強(qiáng)陰離子交換樹脂優(yōu)選的實(shí)例是季銨強(qiáng)陰離子交換樹脂，其在本領(lǐng)域已知為UNOsphere Q，Q Sepharose HP和其他的具有季銨(Q)部分的樹脂。強(qiáng)陰離子交換樹脂UNOsphere Q的特征如下
官能團(tuán)-N+(CH3)3
總離子容量12(^eq/ml
動(dòng)態(tài)結(jié)合能力
150 cm/hr180 mg/ml
600 cm/hr125 mg/ml
運(yùn)輸抗衡離子cr
中值粒徑120μηι
推薦的線性流速范圍50-1200 cm/hr
化學(xué)穩(wěn)定性
1.0M NaOH(20°C)長達(dá) 2000 hr 1.0 M HCl (20"C)長達(dá) 200 hr
體積變化
pH 4-10<5%
0.01-1.0 M NaCl<5%
pH穩(wěn)定性1-14強(qiáng)陰離子交換樹脂Q Sepharose HP的特征如下離子容量動(dòng)態(tài)能力建議流速
操作中填充床的最大壓力 HiLoad ^MM 壓力限制平均粒徑
排阻限(Mr ) 基盾
pH穩(wěn)定性
化學(xué)穩(wěn)定性
0.14-0.20 mmol Cl /ml 70 mg BSA/ml 介盾 30-150 cm/h 3 巴(42 psi, 0.3 MPa)
5 巴(73 psi, 0.5 MPa) 34μιη
約4*106球蛋白交聯(lián)瓊脂糖，6% 2-12 (工作和長期)， 1-14 (短期)
在所有常用的緩沖液中穩(wěn)定優(yōu)選的避免使用弱的陰離子交換樹脂，如基于二乙基氨基乙基(DEAE)或者二甲基氨基乙基(DMAE)作為官能團(tuán)的那些樹脂。陰離子交換層析步驟優(yōu)選的使用具有弱堿性ρΗ，例如約pH 7. O至約9. 0，或者約 7. 5至約8. 5的緩沖液進(jìn)行。合適的緩沖液包括，例如，硼酸鹽緩沖液，三乙醇胺/亞氨基二乙酸Tris,乙酸銨，tricine，N- 二 (羥乙基)甘氨酸，TES, HEPES, TAPS。優(yōu)選地使用Tris 緩沖液。通常通過加入鹽，優(yōu)選氯化鈉增加流動(dòng)相的電導(dǎo)率完成從陰離子交換樹脂上的洗脫。本發(fā)明方法的疏水作用層析(HIC)可以使用HIC樹脂進(jìn)行，其具有相對(duì)溫和的疏水表面(與反相樹脂更強(qiáng)的疏水表面相比)。具有疏水表面性質(zhì)的蛋白質(zhì)被吸引到這些通常具有醚，苯基，丁基，或己基的樹脂上。HIC可以使用所有常見的通過商業(yè)途徑可獲得的HIC樹脂進(jìn)行。為本發(fā)明的目的使用的HIC樹脂包含基質(zhì)如丁基、苯基、丙基或者辛基瓊脂糖，SOURCE 15(都可以從GE Healthcare，德國購買)，Macro-Pr印 Methyl 或者叔丁基 HIC 支持體(Bio-I ad，Germany)， 或者具有丙基或苯基配體的Fractogel EMD (Merck AG, Germany), Toyopearl HIC樹脂，如 Toyopearl Butyl 650M 和類似的 HIC 樹脂 CTosoh Bioscience)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，疏水作用層析使用由用苯基、丁基或者辛基衍生的交聯(lián)瓊脂糖珠組成的樹脂或者具有類似特征的樹脂進(jìn)行。Wienyl Sepharose 6FF(從GE Healthcare購買)的特征如下
7配體密度
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(低 sub) Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (高 sub)
結(jié)合能力
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (低 sub)
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (高 sub)
25μιηο1/ιη1 基質(zhì) 40μιηοΙ/ιη1 基質(zhì)
壓力/流量規(guī)格
ρH穩(wěn)定性
10 mg IgG/ml 基質(zhì) 24 mg HSA/ml 基質(zhì) 30 mg IgG/ml 基盾 36 mg HSA/ml 基質(zhì) L巴XK 50/60層析柱, 柱床高25 cm 14 (短期)，3-13 (長期)
200-400 cm/h,
化學(xué)穩(wěn)定性在常用的溶液，離液劑，去垢劑，
極性有機(jī)溶劑中穩(wěn)定
平均粒徑90μηι
20%乙醇
M溫度4。C -30。C在HIC樹脂上的結(jié)合在高導(dǎo)電性的溶液中完成，其通過加入鹽(例如NaCl， (NH4)2SO4或者Na2SO4)得到。通常HIC步驟中的洗脫通過減少流動(dòng)相的導(dǎo)電性進(jìn)行(例如降低鹽濃度)，使用PH值約5至約9，更優(yōu)選的約6至約8，最優(yōu)選的約7至約8的緩沖液。平衡、洗滌、洗脫緩沖液可以包含通常用于HIC的所有緩沖液類型。因此，緩沖試劑包含磷酸鈉，乙酸鈉，Tris/HCl，HEPES或者其他緩沖試劑。此外，依據(jù)緩沖液是用于平衡、 洗滌或者洗脫，緩沖液可含有0. 5mM至3mM的NaCl，KCl或者其他合適的鹽。平衡和洗滌緩沖溶液比洗脫緩沖液含有更高濃度的前述鹽。在HIC步驟中特別優(yōu)選的緩沖液是包含有NaCl的Tris/HCl緩沖液。本發(fā)明方法的染料親和層析可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的具有固定的配體染料化合物的樹脂，即Cikicron Blue F3G-A進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全理解術(shù)語“固定的”，并且其指配體化學(xué)連接到樹脂的意義上，配體是經(jīng)衍生的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，染料親和層析以Cibacron Blue F3G-A作為配體進(jìn)行的， 該配體共價(jià)偶聯(lián)到任何基質(zhì)上，如瓊脂糖基質(zhì)。優(yōu)選地，染料親和層析使用已知稱作Blue Sepharose FF(可以從GE Healthcare，德國購買)的樹脂進(jìn)行。Blue Sepharose FF的技
術(shù)特征如下給出配體Cibacron Blue F3G-A
配體偶聯(lián)方法三療偶聯(lián)
結(jié)合能力> 18 mg人血清白蛋白/ml介質(zhì)
配體密度~ 7μιηο1 Cibacron Blue /ml 介質(zhì)
基質(zhì)高度交聯(lián)的瓊脂糖，6%
平均粒徑90μιη
ρΗ穩(wěn)定性4-12 (長期)，3-13 (短期)
保存20%乙醇，0.1Μ磷酸鉀緩沖液，ρΗ8·0
保存溫度4°C-30°C
化學(xué)穩(wěn)定性在70%乙醇，6M鹽酸胍，8M尿素中
40 °C下穩(wěn)定7天可理解本發(fā)明方法中染料親和層析可以用具有類似特征的備選樹脂進(jìn)行。備選樹脂實(shí)例包括 Joyopearl AF-blue-HC-650M (Tosoh Biosciences), Blue Cellthru BigBead(Sterogene) , SwelIGel Blue (Pierce), Cibachrome blue 3GA_agraose 100(Sigma), Affi-Gel Blue (Bio-Rad),Econo-Pac blue cartridges (Bio-Rad), Cibacron Blue 3GA(Sigma)。固定的染料親和層析步驟中的洗脫優(yōu)選地使用Tris/HCl緩沖液或者磷酸鹽緩沖液進(jìn)行。最優(yōu)選的是含有氯化鈉的Tris/HCl緩沖液。洗脫劑的ρΗ值優(yōu)選的是約7至約9， 最優(yōu)選的PH值是7至8。在另一方面，按照本發(fā)明純化重組的促卵泡激素或者促卵泡激素變體的方法包括將含有所述促卵泡激素或者其變體的液體進(jìn)行-陰離子交換層析，-疏水作用層析，-染料親和層析，和進(jìn)一步的陽離子交換層析的步驟，這些層析可以以任意順序進(jìn)行，其中所述方法避免任何弱的陰離子交換層析以及任何反相層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，按照以下順序進(jìn)行步驟(1)陰離子交換層析，(2)疏水作用層析，(3)染料親和層析，和陽離子交換層析。陽離子交換層析(CEC)依賴于樣品中的蛋白質(zhì)和固定在樹脂上的電荷之間的電荷-電荷相互作用。在陽離子交換層析中，蛋白質(zhì)的結(jié)合離子是帶正電的，固定的官能團(tuán)是帶負(fù)電的。通常使用的陽離子交換樹脂是S-樹脂、硫酸衍生物和CM(羧甲基)樹脂、羧化衍生的離子。然而，通常陽離子交換層析步驟可以用所有常用的通過商業(yè)途徑可得到的陽離子交換樹脂或者膜進(jìn)行。陽離子交換樹脂可以以預(yù)裝柱或者膜的形式使用，其上固定有官能團(tuán)例如磺酸。備選地，可以自己制備層析柱。至于層析柱的容積和形狀，與其他普通的層析
9柱相比沒有特別的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解使用的陽離子交換樹脂的量取決于細(xì)胞培養(yǎng)液或者其它液體(例如，在前的層析步驟的洗脫液)中的總體蛋白質(zhì)含量。可用于本發(fā)明目的的典型的陽離子交換樹脂可以從GE Healthcare和其他的離子層析配件和層析柱的制造商中購買。通常，使用PH值4至7的緩沖液進(jìn)行陽離子交換層析。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法的陽離子交換步驟以膜陽離子交換進(jìn)行。優(yōu)選地，陽離子交換步驟用固定在膜上的強(qiáng)酸性陽離子交換劑磺酸或者具有類似特征的交換劑進(jìn)行。本發(fā)明的陽離子交換步驟中使用的合適的膜吸附劑是眾所周知的并且可以從一些供應(yīng)商購買。例如，本發(fā)明方法的陽離子交換層析方法可以使用從再生纖維素制成的膜進(jìn)行，并且其具有在纖維素骨架上形成的磺酸的層析基質(zhì)。一種有用的膜吸附劑的實(shí)例是 Sartorius出售的Sartobind S膜吸附劑。Sartobind S膜吸附劑的技術(shù)數(shù)據(jù)給出如下Sartobind SingerSep (強(qiáng)酸陽離子交換劑S) 磺酸(R-CH2 SO3 )
>0.8 mg/cm2(29 mg/ml)，用牛血清白蛋白和雞蛋溶菌酶測(cè)定 4-6peq/cm2
穩(wěn)定的增強(qiáng)纖維素 275μιη > 3μιη
圓柱，標(biāo)稱層數(shù)15 4 mm
聚丙烯(FD A) 0.4MPa(4 巴，58 psi) 3-14 (短期) 一次性使用
在層析所有常用的使用緩沖液中都穩(wěn)定， 1 M NaOH(20 °C 時(shí) 30-60min), 8M 尿素， 8M鹽酸胍，乙醇，丙酮和100%乙腈。 避免氧化劑。陽離子交換層析步驟可以按照制造商的方案進(jìn)行。例如，可以使用PH7.0的 Tris-HCl緩沖液。發(fā)現(xiàn)陽離子交換層析，優(yōu)選的陽離子膜吸收劑步驟清除所有分子大小的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)而保持短的處理時(shí)間。產(chǎn)量約95%是非常有利的，因?yàn)樵趐H 7. O時(shí)促卵泡激素不與吸附劑結(jié)合。一般來說，發(fā)現(xiàn)層析膜形式的陽離子交換層析在純化重組促卵泡激素或者促卵泡激素變體中非常有用。因此，另一方面，本發(fā)明涉及陽離子膜吸附劑在純化FSH或者FSH變體方法中的用途。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，陽離子膜吸附劑是陽離子交換吸附劑，優(yōu)選的強(qiáng)陽離子交換吸附劑，其由再生纖維素制成，并且具有在纖維素骨架上形成的磺酸的層析基質(zhì)。在另一方面，按照本發(fā)明純化重組促卵泡激素或者促卵泡激素變體的方法包括將
名稱配體
靜態(tài)結(jié)合能力
離子容量膜
基本材料膜厚度標(biāo)稱孔徑膠嚢設(shè)計(jì)
柱床高度材料膠嚢最大壓力 ρH穩(wěn)定性
化學(xué)穩(wěn)定性
1含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素變體的液體進(jìn)行-陰離子交換層析，-疏水作用層析，-染料親和層析，-任選的陽離子交換層析，和進(jìn)一步額外的陰離子交換層析步驟，這些層析可以以任意順序進(jìn)行，其中所述方法避免弱的陰離子交換層析以及反相層析。在一種實(shí)施方案中，步驟按照以下順序進(jìn)行第一次陰離子交換層析、疏水作用層析、染料親和層析、任選的陽離子交換層析、和第二次陰離子交換層析。第二次陰離子交換層析可以使用上面提到的與第一次陰離子交換層析相聯(lián)系的典型的陰離子交換樹脂進(jìn)行。第二次陰離子交換層析優(yōu)選地是強(qiáng)陰離子交換層析，其使用具有-N+(CH3)3官能團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換樹脂或者具有類似特征的樹脂進(jìn)行?？捎糜诒景l(fā)明目的的強(qiáng)陰離子交換樹脂的優(yōu)選的實(shí)例是季銨強(qiáng)陰離子交換樹脂，其在本領(lǐng)域已知為UNOsphere Q，Q Sepharose HP和其他的具有季銨(Q)部分的樹脂。強(qiáng)陰離子交換劑 UNOsphere Q和Q Sepharose HP的特征在上面在第一次陰離子交換層析方面給出。在第二次陰離子交換層析步驟中，也優(yōu)選的避免使用弱的陰離子交換樹脂，如基于以二乙基氨基乙基(DEAE)或者二甲基氨基乙基(DMAE)作為官能團(tuán)的那些樹脂。陰離子交換層析步驟優(yōu)選的使用弱堿性pH，例如約pH 7. O至約9. 0，或者約7. 5 至約8. 5的緩沖液進(jìn)行。合適的溶液包括，例如，硼酸鹽緩沖液，三乙醇胺/亞氨基二乙酸， Tris,乙酸銨，tricine，N- 二 (羥乙基)甘氨酸，TES, HEPES, TAPS。優(yōu)選地使用Tris緩沖液。通常通過加鹽，優(yōu)選的氯化鈉增加流動(dòng)相的電導(dǎo)率實(shí)現(xiàn)從陰離子交換樹脂上的洗脫。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二次陰離子交換層析使用pH 7. 0至9. 0的Tris-HCl/NaCl 緩沖液作為洗脫劑進(jìn)行。在另一方面，按照本發(fā)明純化重組促卵泡激素或者促卵泡激素變體的方法包括將含有所述FSH或FSH變體的液體進(jìn)行步驟-陰離子交換層析，-疏水作用層析，和染料親和層析，所述步驟可以以任意順序進(jìn)行，其中該方法避免了弱的陰離子交換層析以及反相層析，并且其中該方法進(jìn)一步包括大小排阻層析。在另一方面，按照本發(fā)明純化重組促卵泡激素或者促卵泡激素變體的方法包括將含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素變體的液體進(jìn)行步驟-陰離子交換層析，-疏水作用層析，-染料親和層析，任選的陽離子交換層析，任選的進(jìn)一步的陰離子交換層析，和大小排阻層析，
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這些層析可以以任意順序進(jìn)行，其中所述方法避免弱的陰離子交換層析以及反相層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟按照以下順序進(jìn)行陰離子交換層析，疏水作用層析，染料親和層析，任選的陽離子交換層析，任選的進(jìn)一步的陰離子交換層析和大小排阻層析。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括以下順序的以下步驟第一次陰離子交換層析，疏水作用層析，染料親和層析，任選的陽離子交換層析，任選的第二次陰離子交換層析和大小排阻層析。大小排阻層析(SEC)，也已知為凝膠過濾層析，是一種層析方法，其中顆粒例如蛋白質(zhì)和其他的生物分子基于它們的大小分開。SEC典型的凝聚介質(zhì)是聚丙烯酰胺，葡聚糖， 瓊脂糖或者其混合物。SEC基質(zhì)可以從許多層析配件和層析柱制造商中購買，例如從Tosoh Bioscience LLC 或者 GE Healthcare 購買。大小排阻層析優(yōu)選的使用交聯(lián)瓊脂糖和葡聚糖的球形復(fù)合材料的基質(zhì)進(jìn)行。大小排阻層析基質(zhì)的有用的實(shí)例是現(xiàn)有技術(shù)中已知為Superdex 75pg，例如可以從GE Healthcare購買的基質(zhì)。Superdex 75pg柱允許根據(jù)大小高分辨率分離蛋白質(zhì)，多肽和其他的生物分子。一般，大小排阻柱在純化程序中是理想的精制步驟。Superdex 75pg基質(zhì)的技術(shù)細(xì)節(jié)如下
權(quán)利要求
1.純化重組促卵泡激素或者重組促卵泡激素變體的方法，其包括將含有所述重組促卵泡激素或者重組促卵泡激素變體的液體進(jìn)行-陰離子交換層析， -疏水作用層析，和 -染料親和層析， 這些步驟以任意順序進(jìn)行，其中所述方法既不包括弱的陰離子交換層析又不包括反相層析。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟按照以下順序進(jìn)行a)陰離子交換層析，b)疏水作用層析，和c)染料親和層析。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述陰離子交換層析使用具有-N+(CH3)3官能團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換樹脂或者具有類似特征的樹脂進(jìn)行。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水作用層析使用以苯基或者丁基衍生的交聯(lián)瓊脂糖珠組成的樹脂或者具有類似特征的樹脂進(jìn)行。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述染料親和層析使用CibacronBlue3G作為配體共價(jià)的偶聯(lián)到任何基質(zhì)進(jìn)行。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述層析使用pH在7.0至9.0范圍內(nèi)的 Tris-HCl/氯化鈉緩沖液作為洗脫劑進(jìn)行。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括陽離子交換層析。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述膜陽離子交換層析用固定在膜上的強(qiáng)酸性陽離子交換劑磺酸或者有類似特征的交換劑進(jìn)行。
9.權(quán)利要求7或者8的方法，其中所述步驟按照以下順序進(jìn)行a)陰離子交換層析，b)疏水作用層析，c)染料親和層析，和d)陽離子交換層析。
10.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括另一陰離子交換層析。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述陰離子交換層析使用具有-N+(CH3)3官能團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換樹脂或者具有類似特征的樹脂進(jìn)行。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述陰離子交換層析使用pH在7.0至9. 0范圍內(nèi)的Tris-HCl/氯化鈉緩沖液作為洗脫劑進(jìn)行。
13.權(quán)利要求10至12任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟按照以下順序進(jìn)行a)第一次陰離子交換層析，b)疏水作用層析，c)染料親和層析，d)任選的陽離子交換層析，和e)第二次陰離子交換層析。
14.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括大小排阻層析。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述大小排阻層析使用交聯(lián)瓊脂糖和葡聚糖的球形復(fù)合材料的基質(zhì)進(jìn)行。
16.權(quán)利要求14或者15的方法，其中所述步驟按照以下順序進(jìn)行a)第一次陰離子交換層析，b)疏水作用層析，c)染料親和層析，d)任選的陽離子交換層析，e)任選的第二次陰離子交換層析，和f)大小排阻層析。
17.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其包括以下順序的以下步驟a)第一次陰離子交換層析，b)疏水作用層析，c)染料親和層析，d)膜陽離子交換，e)第二次陰離子交換層析，和f)大小排阻層析。
18.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)超濾和/或納米過濾步驟。
19.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中不進(jìn)行金屬離子親和層析。
20.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中不進(jìn)行免疫親和層析。
21.純化重組促卵泡激素或者重組促卵泡激素變體的方法，其包括將含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素變體的液體進(jìn)行膜陽離子交換劑的步驟。
22.權(quán)利要求21的方法，其進(jìn)一步包括疏水作用層析。
23.權(quán)利要求21或者22的方法，其中所述膜陽離子交換劑是強(qiáng)酸性陽離子交換劑磺酸，或者具有類似特征的交換劑。
24.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述促卵泡激素具有根據(jù)SEQID No. 1的α亞基和根據(jù)SEQ ID No. 2的β亞基。
25.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法得到的促卵泡激素或者促卵泡激素變體。
26.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求25的促卵泡激素或者促卵泡激素變體以及可藥用賦形劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的促卵泡激素或者促卵泡激素變體或者根據(jù)權(quán)利要求沈的藥物組合物用于治療生育病癥的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及純化重組促卵泡激素(FSH)或者重組FSH變體的方法。該方法包括將含有重組FSH或者重組FSH變體的液體進(jìn)行陰離子交換層析、疏水作用層析和染料親和層析，其中這些層析可以以任意順序進(jìn)行，并且其中該方法既不包括弱的陰離子交換層析又不包括反相層析。此純化的方法得到高產(chǎn)量的重組促卵泡激素，其具有期望程度的純度。得到的促卵泡激素在預(yù)防和治療病癥和醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥中尤其有用，在所述病癥和醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥中認(rèn)為促卵泡激素制劑是有用的藥物。
文檔編號(hào)C07K14/59GK102448979SQ201080022681
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月1日
發(fā)明者C·謝克曼, D·艾興格, S·阿諾德 申請(qǐng)人:拜奧吉耐里克斯股份公司