一種表達(dá)ibdv vp2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重組火雞皰疹病毒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種表達(dá)IBDV?VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重組火雞皰疹病毒，屬于基因工程和生物制品研究領(lǐng)域。將10拷貝法氏囊素三肽（BS10）嵌合IBDV?VP2基因表達(dá)盒與火雞皰疹病毒（HVT）結(jié)合在一起，獲得了一種全新的重組火雞皰疹病毒（rHVT-BS10-VP2），該病毒同時(shí)也是一種馬立克氏病和雞傳染性法氏囊病的二聯(lián)重組疫苗。本發(fā)明的二聯(lián)重組疫苗，不僅可以對(duì)雞MD起到良好的免疫保護(hù)作用，而且在具有高IBDV母源抗體水平的商品化雞群中可以誘導(dǎo)抗IBDV的持久保護(hù)性免疫，與現(xiàn)有的雞傳染性法氏囊病病毒火雞皰疹病毒載體活疫苗(vHVT-013-69株)相比，rHVT-BS10-VP2免疫組的保護(hù)率（100％)高于rHVT-VP2免疫組的保護(hù)率(93.3％)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種表達(dá)IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重組火雞皰疹病毒
[0001]一、【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于基因工程和生物制品研究領(lǐng)域。具體涉及一種表達(dá)IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒。[0002]二、【背景技術(shù)】
雞馬立克氏病(Marek，s disease, MD)和雞傳染性法氏囊病(Infectious bursaldisease, IBD)是兩種影響家禽生產(chǎn)最常見(jiàn)的免疫抑制性疾病。其中IBD是由雞傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起，主要危害3周齡~12周齡青年雞的急性、高度接觸性傳染病。變異株和超強(qiáng)毒株(vvIBDV)的出現(xiàn)使該病的防控難度加大，IBD免疫預(yù)防失敗已成為禽病防控中的重要問(wèn)題。
[0003]目前商品化的傳染性法氏囊病活毒疫苗分為弱毒、中毒和強(qiáng)毒三類(lèi)。弱毒活疫苗對(duì)SPF雞安全，但對(duì)有母源抗體雞群的免疫保護(hù)力很差。中等毒力和強(qiáng)毒疫苗的免疫
保護(hù)
力雖然要高很多，但由于具有一定的致病力而損傷法氏囊。同時(shí)，由于母源抗體的干擾以及IBDV的特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中傳統(tǒng)疫苗可形成不可避免的免疫空白期。因此，在當(dāng)前IBD防控實(shí)際工作中，急需免疫效力強(qiáng)、生物安全性高新型IBD疫苗。
[0004]MD是由馬立克氏病病毒(Marek，s disease virus,MDV)引起的雞淋巴組織增生性疾病，以外周神經(jīng)、虹膜、皮膚、肌肉和內(nèi)臟器官的淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)，增生和腫瘤形成為特征。MDV疫苗株可作為活病毒載體來(lái)表達(dá)外源基因，對(duì)其分子生物學(xué)的研究表明，MDV基因組較大，并已經(jīng)確定了多處病毒復(fù)制非必需區(qū)，其本身是優(yōu)良的病毒表達(dá)載體。相較于其它病毒載體，MDV作為載體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，MDV為嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合型，可以突破母源抗體的干擾，適合早期免疫，通過(guò)雞胚免疫，操作更方便。并且，一次免疫可誘發(fā)終生的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，節(jié)約成本?；谝陨咸攸c(diǎn)，以MDV為載體進(jìn)行的活疫苗研究倍受青睞，而火雞皰疹病毒(HVT)為其中的一種α皰疹病毒，因其與MDV抗原相關(guān)性，同時(shí)又由于HVT與MDV有明顯區(qū)別對(duì)雞無(wú)致病性，被廣泛用作預(yù)防馬立克氏病(MD)的活疫苗。
[0005]法氏囊(BF)是禽類(lèi)特有的免疫器官，為B細(xì)胞發(fā)育、成熟提供微環(huán)境，是免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)變場(chǎng)所；其免疫活性物質(zhì)為三肽囊素(Bursin，BS)，它能誘導(dǎo)家禽和哺乳動(dòng)物B細(xì)胞前體分化；其靶器官是BF，能夠拮抗IBD疫苗對(duì)BF的損傷，提高ND弱毒疫苗及油苗產(chǎn)生抗體水平。因此如何能夠以火雞皰疹病毒(HVT)為載體進(jìn)行雞傳染性法氏囊病(IBD)的高效活疫苗研究成為一項(xiàng)亟待攻克的難題。
[0006]三、
【發(fā)明內(nèi)容】
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的發(fā)明人提供了一種重組火雞皰疹病毒(rHVT-BS10-VP2)，不僅可以對(duì)雞MD起到良好的免疫保護(hù)作用，而且在具有高IBDV母源抗體水平商品化雞群中可以誘導(dǎo)抗IBDV的持久保護(hù)性免疫。
[0007]技術(shù)方案一種表達(dá)IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒rHVT- BS10-VP2，其特征在于:其攜帶在啟動(dòng)子序列控制下的10拷貝法氏囊素三肽(BSlO)嵌合IBDV VP2基因表達(dá)盒的基因序列如SEQ ID N0.1所不。
[0008]所述的表達(dá)IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，其制備方法如下:
1)10拷貝法氏囊素三肽BSlO寡核苷酸的合成:選用編碼賴(lài)氨酸Lys、組氨酸His和甘氨酸Gly的常用密碼子按順序排列成BS基因:5’-AAGCATGGC-3’，連續(xù)合成10個(gè)BS，BS串連基因單鏈及其反向互補(bǔ)鏈，通過(guò)退火使其復(fù)性成雙鏈；
2)含IBDVVP2和BSlO嵌合基因表達(dá)盒的火雞皰疹病毒HVT轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建:根據(jù)已注冊(cè)的GenBank N0.X00221.1的gpt基因序列設(shè)計(jì)引物，以E.colim, a DNA為模板采用PCR方法擴(kuò)增gpt基因，用其作為外源篩選基因，與質(zhì)粒pEGFP中的CMV啟動(dòng)子及poly (A)連接構(gòu)建gpt表達(dá)盒CMV-gpt-poly A,經(jīng)酶切測(cè)序驗(yàn)證后，插入到含有火雞皰疹病毒HVT非必需區(qū)US10、S0RF3兩側(cè)基因的同源臂克隆質(zhì)粒pUAB中，構(gòu)建帶有篩選基因表達(dá)盒的克隆質(zhì)粒pUAB-gpt ;將BS10-VP2嵌合基因插入到pUAB-gpt中，獲得重組火雞皰疹病毒轉(zhuǎn)移載體 pUAB-gpt-BS10-VP2，大小為 IOlOObp ；
3)表達(dá)嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒的制備:采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pUAB-gp t-BS 10-VP2與HVT-FC126株基因共轉(zhuǎn)染原代雞胚成纖維細(xì)胞CEF，待出現(xiàn)病毒噬斑后，利用霉酚酸MPA阻斷核酸代謝途徑，經(jīng)過(guò)篩選獲得純化的重組病毒rHVT-BS10-VP2。
[0009]所述的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10_VP2，其在禽類(lèi)宿主中誘導(dǎo)抗禽類(lèi)皰疹病毒和雞傳染性法氏囊病毒的保護(hù)性免疫的應(yīng)用，其也可作為疫苗株應(yīng)用。
[0010]有益效果
1)將10拷貝法氏囊素三肽(BSlO)嵌合IBDV VP2基因表達(dá)盒插入HVT基因組中的位置位于HVT FC126基因組(ACCESSION N0.NC_002641)的非必需區(qū)USlO基因和S0RF3基因之間，更具體的位置為HVT FC126基因組(ACCESSION N0.NC_002641)的138687bp-138826bp位置之間，獲得了一種免疫增強(qiáng)型重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，該病毒同時(shí)也是一種馬立克氏病和雞傳染性法氏囊病的二聯(lián)疫苗，rHVT-BS10-VP2不僅可以對(duì)雞MD起到良好的免疫保護(hù)作用，而且在具有高IBDV母源抗體水平商品化雞群中可以誘導(dǎo)抗IBDV的持久保護(hù)性免疫，與現(xiàn)有的雞傳染性法氏囊病病毒火雞皰疹病毒載體活疫苗(vHVT-013- 69株)相比，rHVT-BS10-VP2免疫組的保護(hù)率((100% )高于rHVT_VP2免疫組的保護(hù)率(93.3% )。
[0011]2)以gpt為篩選基因構(gòu)建的rHVT-BS10-VP2重組病毒能夠表達(dá)gpt，該酶利用外源黃嘌呤完成了鳥(niǎo)嘌呤的外源補(bǔ)救合成，從而使得重組病毒DNA的復(fù)制能夠正常進(jìn)行，可經(jīng)過(guò)幾輪篩選野生病毒全部死亡，而重組病毒逐漸可得到富集和純化。
[0012]
四、【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1為rHVT-BS10-VP2重組病毒的DNA序列模式圖；
圖2 HVT基因組插入BS10-VP2示意圖；
圖3篩選標(biāo)記基因gpt的表達(dá)盒Egpt (CMV-gpt-poly A)擴(kuò)增結(jié)果電泳示意圖；圖4為BS10-VP2 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳示意圖；
圖5為重組質(zhì)粒pUAB-gpt-BS10-VP2構(gòu)建過(guò)程示意圖。
[0013]五、【具體實(shí)施方式】
IBDV變異株AHl株(見(jiàn)參考文獻(xiàn):王永山等.近期引起免疫失敗的傳染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2008，38(12): 1013_1019)VP2基因系用RT-PCR方法從2007年12月在安徽引起免疫失敗的IBDV變異株(AHl)中克隆，該變異株具有IBDV強(qiáng)毒株全部的標(biāo)志性氨基酸殘基，VP2基因七肽基序?yàn)镾WSASGS，在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸殘基分別是A、Q、1、D、A、I和S，與現(xiàn)行商品疫苗毒株B87的VP2基因序列有較大差異。因此，對(duì)當(dāng)前IBDV的防控更具有針對(duì)性和實(shí)際意義。
[0014]實(shí)驗(yàn)材料
1.1載體、菌種及主要試劑 pMD18-T simple vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒PEGFP-Nl (劉蒙蒙，楊德成，周?chē)?guó)輝等，共表達(dá)O型FM DV衣殼蛋白和綠色熒光蛋白重組腺病毒的構(gòu)建，2012 (24) 83-86) ； E.coli DH5 α和Ε.coli DHlOB (購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)。AxyPr印質(zhì)粒小量純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen，X_gal、IPTG、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase, ATP、dNTP及Taq DNA聚合酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；胰酶購(gòu)自Thermo公司。
1.2SPF雞胚和病毒9~10日齡SPF雞胚、火雞抱疫病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)Fcl26株均購(gòu)自南京天邦生物科技有限公司;傳染性法氏囊病毒BC6/85的標(biāo)準(zhǔn)毒株購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1引物設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)GenBank上發(fā)表的HVT Fcl26株全長(zhǎng)基因組序列(AF291866)、gpt序列(X00221.1)以及pEGFP-Cl質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)了以下PCR引物(表1)，引物由Invitrogen公司合成。
[0015]表1重組病毒轉(zhuǎn)移載體的引物構(gòu)建
【權(quán)利要求】
1.一種表達(dá)IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，其特征在于:其攜帶在啟動(dòng)子序列控制下的10拷貝法氏囊素三肽BSlO嵌合IBDVVP2基因表達(dá)盒的基因序列如SEQ ID N0.1所不。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)IBDVVP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒rHVT- BS10-VP2，其制備方法如下: 1)10拷貝法氏囊素三肽BSlO寡核苷酸的合成:選用編碼賴(lài)氨酸Lys、組氨酸His和甘氨酸Gly的常用密碼子按順序排列成BS基因:5’-AAGCATGGC-3’，連續(xù)合成10個(gè)BS，BS串連基因單鏈及其反向互補(bǔ)鏈，通過(guò)退火使其復(fù)性成雙鏈； 2)含IBDVVP2和BSlO嵌合基因表達(dá)盒的火雞皰疹病毒HVT轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建:根據(jù)已注冊(cè)的GenBank N0.X00221.1的gpt基因序列設(shè)計(jì)引物，以E.colim, a DNA為模板采用PCR方法擴(kuò)增gpt基因，用其作為外源篩選基因，與質(zhì)粒pEGFP中的CMV啟動(dòng)子及poly (A)連接構(gòu)建gpt表達(dá)盒CMV-gpt-poly A,經(jīng)酶切測(cè)序驗(yàn)證后，插入到含有火雞皰疹病毒HVT非必需區(qū)US10、S0RF3兩側(cè)基因的同源臂克隆質(zhì)粒pUAB中，構(gòu)建帶有篩選基因表達(dá)盒的克隆質(zhì)粒pUAB-gpt ;將BS10-VP2嵌合基因插入到pUAB-gpt中，獲得重組火雞皰疹病毒轉(zhuǎn)移載體 pUAB-gpt-BS10-VP2，大小為 IOlOObp ； 3)表達(dá)嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒的制備:采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pUAB-gpt-BS 10-VP2與HVT-FC126株基因共轉(zhuǎn)染原代雞胚成纖維細(xì)胞CEF，待出現(xiàn)病毒噬斑后，利用霉酚酸MPA阻斷核酸代謝途徑，經(jīng)過(guò)篩選獲得純化的重組病毒rHVT-BS10-VP2。
3.如權(quán)利要求1或2所述的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，其在禽類(lèi)宿主中誘導(dǎo)抗禽類(lèi)皰 疹病毒和雞傳染性法氏囊病毒的保護(hù)性免疫的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1或2所述的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，其作為疫苗株的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求3所述的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，其作為疫苗株的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/22GK103589693SQ201310566984
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】潘群興, 王永山, 歐陽(yáng)偉, 王曉麗, 畢振威, 夏興霞, 諸玉梅, 董晨紅, 何孔旺, 肖琦 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院