重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑、其制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑，其含有重組腺相關病毒AAV-shCdc6；所述重組腺相關病毒AAV-shCdc6是將特異性人Cdc6RNAi靶向序列的小分子干擾RNA(siRNA)插入AAV的特異位點后得到的。本發(fā)明的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑可以高效感染乳腺癌細胞，并持續(xù)表達特異靶向Cdc6的siRNA，最終能夠特異性殺傷乳腺癌細胞，相反對正常乳腺上皮細胞沒有殺傷作用。因此，重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑可以作為治療乳腺癌的新型生物制劑。
【專利說明】重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑、其制備和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，尤其涉及一種重組腺相關病毒制劑、其制備方法和應用。
【背景技術】 [0002]全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀70年代末開始一直呈上升趨勢。美國8名婦女一生中就會有I人忠乳腺癌。近年我國乳腺癌發(fā)病率的增長速度高出高發(fā)國家I~2個百分點。據(jù)國家癌癥中心和衛(wèi)生部疾病預防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發(fā)病數(shù)據(jù)顯示:全國腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第I位，女性乳腺癌發(fā)病率(粗率)全國合計為42.55/10萬，城市為51.91/10萬，農(nóng)村為23.12/10萬。近年來，乳腺腫瘤治療雖然取得一定進展，但整體效果欠佳，病死率仍居高不下，原因在于現(xiàn)階段人們根據(jù)對乳腺癌發(fā)生發(fā)展機制的認識和指定的癌癥治療方案仍欠缺特異性和高效性。大多數(shù)癌癥治療方案導致非特異性治療副作用的產(chǎn)生，對患者造成不同程度的傷害，甚至引起生命危險。因此，在我國經(jīng)濟飛速發(fā)展、人民健康水平空前提高的情況下，對乳腺癌特異性治療的研究有了更大的社會需求，也是我國持續(xù)發(fā)展和建設和諧社會的重要任務之一。
[0003]目前，分子靶向藥物是抗腫瘤新藥研發(fā)的主要方向。但是，腫瘤的靶向治療面臨巨大挑戰(zhàn)，主要是缺乏特異性殺傷腫瘤細胞的有效藥物靶點。為解決這個難題，必須系統(tǒng)地理解腫瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控的相關機制，找出可以作為藥物靶點的重要調(diào)控分子，實行特異性殺傷腫瘤治療方案。所以，推動特異性靶點抗腫瘤新藥研發(fā)，不僅是癌癥患者的殷切希望，也是我國獨立知識產(chǎn)權抗癌新藥研發(fā)、民族制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展和國家經(jīng)濟進一步騰飛的迫切需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種可以進行乳腺腫瘤治療和抑制的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑。
[0005]真核細胞內(nèi)DNA合成蛋白因子Cdc6對細胞S期起始DNA復制至關重要。抑制細胞內(nèi)Cdc6的表達，導致特異性S期腫瘤細胞死亡，而正常細胞僅發(fā)生周期阻滯。間歇性抑制細胞內(nèi)Wc6基因表達,最終導致所有腫瘤細胞死亡,相反不影響正常細胞的生長。因此，DNA合成蛋白因子Cdc6可以作為特異性抗腫瘤治療的靶標。
[0006]腺相關病毒(AAV)具有自然缺陷、無包被和無致病原性，它能整合其基因組到19號染色體的一個特別位點并保持整合狀態(tài)。AAV的位點特異性的整合能力、其自然缺陷以及其無致病原性使其成為基因治療載體成為可能。在基因復制條件下AAV能復制產(chǎn)生子代病毒顆粒。因此我們將特異靶向Cdc6基因的小分子干擾RNA(SiRNA)插入AAV的特異位點，利用其復制特性，使AAV感染的細胞持續(xù)產(chǎn)生Cdc6siRNA。
[0007]在此基礎上，本發(fā)明提供一種重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑，其含有重組腺相關病毒AAV-shCdc6 ;所述重組腺相關病毒AAV-shCdc6是將特異性人Cdc6RNAi靶向序列的小分子干擾RNA(siRNA)插入AAV的特異位點后得到的。所述特異性人Cdc6RNAi靶向序列如SEQ ID N0.1所示。所述制劑中重組腺相關病毒AAV-shCdc6可以經(jīng)濃縮后得到任意滴度的病毒液。優(yōu)選病毒滴度為每毫升5X 1013。
[0008]本發(fā)明的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑的制備方法，包括以下步驟:
[0009](I)確定人Cdc6siRNA靶向序列第1091至1110堿基；
[0010](2)化學合成引物；
[0011](3)上述引物退火后，連接入腺病毒載體pAAV-GFP，得到pAAV-GFP_shCdc6 ；
[0012](4)應用 pAAV-GFP-shCdc6 和輔助載體質粒 pAAV_RC2 和 pHelper 共轉染 293T 細胞；
[0013](5)細胞培養(yǎng)2天后，收集細胞培養(yǎng)上清，以1:100比例稀釋再次感染293T細胞；
[0014](6)細胞培養(yǎng)2天后，收集細胞培養(yǎng)上清，離心收集病毒濃縮液。
[0015]所述步驟(1)中的人Cdc6siRNA靶向序列第1091至1110堿基如SEQ ID N0.1所示。
[0016]所述步驟⑵中的引物優(yōu)選為:
[0017]引物1:5，-GATTC gagatcaggttctggacaaA-3，，如 SEQ ID N0.2 所不；
[0018]引物2:5，-AGCTTttgtccagaacctgatctcG-3，，如 SEQ ID N0.3 所不。
[0019]本發(fā)明的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑可以高效感染乳腺癌細胞，并持續(xù)表達特異靶向Cdc6的siRNA，最終能夠特異性殺傷乳腺癌細胞，相反對正常乳腺上皮細胞沒有殺傷作用。因此，重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑可以作為治療乳腺癌的新型生物制劑。
[0020]利用重組腺相關病毒(AAV)作為載體感染乳腺癌細胞，以DNA合成蛋白因子Cdc6作為特異性抗腫瘤治療的靶標，制備重組腺相關病毒AAV-ShCdce制劑進行乳腺腫瘤治療，具有高效、高特異、低副作用等巨大優(yōu)勢。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為HBL-100和MCF7細胞感染病毒三天后，收集并裂解細胞，進行WesternBlot檢測，用兔抗cdc6抗體檢測cdc6表達水平，tubulin作為內(nèi)參；
[0022]圖2為HBL-100和MCF7細胞感染病毒三天后，收集并進行PI染色，利用流式細胞儀進行細胞周期分析，表中數(shù)據(jù)為不同時期細胞所占的百分數(shù)；
[0023]圖3為裸鼠體內(nèi)腫瘤抑制實驗注射AAV-shcdce病毒液后腫瘤體積生長和處死后腫瘤數(shù)量比較。
【具體實施方式】
[0024]為進一步說明本發(fā)明，結合以下實施例具體說明，實施例中的百分比均為重量百分比含量。
[0025]以下實施例中的腺相關病毒載體pAAV-ZsGreenl_hU6 (pAAV-GFP)購于Yrbio公司。腺相關病毒載體PAAV-RC2和pHelper以及293T細胞購于Stratagene公司。乳腺癌細胞MCF7購于ATCC。乳腺上皮細胞HBL-100購于上海研謹生物科技有限公司。
[0026]實施例1:重組腺相關病毒AAV_shCdc6的制備[0027]I)設計特異性人Cdc6RNAi祀向序列通過計算機軟件預測,確定人Cdc6siRNA革巴向序列第 1091 至 1110 堿基(gagatcaggttctggacaa,如 SEQ ID N0.1 所示)；
[0028]2)化學合成以下引物:
[0029]引物1:5’ -GATTC gagatcaggttctggacaaA-3，，如 SEQ ID N0.2 所不；
[0030]引物2:5，-AGCTTttgtccagaacctgatctcG-3，，如 SEQ ID N0.3 所不；
[0031]3)上述引物在55°C退火后，連接入腺病毒載體pAAV-GFP，得到pAAV-GFP-shCdc6 ；
[0032]4)應用 pAAV-GFP_shCdc6 和輔助載體質粒(pAAV_RC2 和 pHelper)共轉染 293T 細胞；
[0033]5)細胞培養(yǎng)2天后，收集細胞培養(yǎng)上清，以1:100比例稀釋再次感染293T細胞；
[0034]6)細胞培養(yǎng)2天后，收集細胞培養(yǎng)上清，離心收集病毒濃縮液。采用逐孔稀釋滴度測定法檢測病毒滴度。
[0035]實施例2:重組腺相關病毒AAV-Shcdc6對乳腺癌細胞的感染
[0036]I)體外培養(yǎng)乳腺癌細胞MCF7和正常二倍體乳腺上皮細胞HBL-100 ；
[0037]2)以1:100比例稀釋病毒液(病毒滴度每毫升5X IO11)加入上述細胞，培養(yǎng)3天；
[0038]3)收集細胞，裂解后進行蛋白電泳，轉膜后應用特異性兔抗Cdc6抗體進行WesternBlot,明確Cdc6蛋白表達抑制,結果見圖1。
[0039]實施例3:重組腺相關病毒AAV-shCdc6對乳腺癌細胞的特異性殺傷作用
[0040]I)以1:100比例稀釋AAV_shcdc6病毒液(病毒滴度每毫升5 X IO11)分別感染乳腺癌細胞MCF7和正常二倍體乳腺上皮細胞HBL-100 ;對照組注射AAV病毒液；
[0041]2)3天后，收集細胞，進行70%乙醇固定，PI染色后應用流式細胞儀檢測分析細胞生長周期和凋亡情況，結果見圖2。從圖中可以看出，AAV-Shcdc6病毒液對乳腺癌細胞MCF7有明顯的殺傷作用，而對乳腺上皮細胞HBL-100基本沒有作用。
[0042]實施例4:重組腺相關病毒AAV_shCdc6抑制乳腺腫瘤在裸鼠內(nèi)生長
[0043]I)收集I X IO6乳腺癌細胞，植入裸鼠乳腺脂肪墊；
[0044]2)2周后，在乳腺癌細胞成瘤部位注射AAV-shcdce病毒液(病毒滴度每毫升5 X IO13)，對照組注射AAV病毒液；
[0045]3)繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠6周，每周記錄裸鼠內(nèi)腫瘤體積大小；
[0046]4)處死小鼠，取出腫瘤組織，進行重量檢測，結果見圖3。從圖3可以看出，注射了AAV-shcdce病毒液的腫瘤體積和重量遠遠小于對照組，說明對于乳腺腫瘤有明顯的抑制作用。
[0047]以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發(fā)明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發(fā)明的權利要求書確定的保護范圍內(nèi)。
【權利要求】
1.重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑，其特征在于:含有重組腺相關病毒AAV-shCdc6；所述重組腺相關病毒AAV-shCdc6是將特異性人Cdc6RNAi靶向序列的小分子干擾RNA(siRNA)插入AAV的特異位點后得到的。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑，其特征在于:所述特異性人Cdc6RNAi靶向序列如SEQ ID NO-1所示。
3.根據(jù)權利要求1所述的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑，其特征在于:所述制劑中病毒滴度為每毫升5 X IO130
4.權利要求1-3任一項所述的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)石角定人Cdc6siRNA革巴向序列第1091至1110堿基； (2)化學合成引物； (3)上述引物退火后，連接入腺病毒載體pAAV-GFP，得到pAAV-GFP-shCdc6； (4)應用pAAV-GFP-shCdc6和輔助載體質粒pAAV_RC2和pHelper共轉染293T細胞； (5)細胞培養(yǎng)2天后，收集細胞培養(yǎng)上清，以1:100比例稀釋再次感染293T細胞； (6)細胞培養(yǎng)2天后，收集細胞培養(yǎng)上清，離心收集病毒濃縮液。
5.根據(jù)權利要求4所述的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中的人Cdc6siRNA靶向序列第1091至1110堿基如SEQ ID N0.1所示。`
6.根據(jù)權利要求4所述的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的引物包括:
引物 1:5，-GATTC gagatcaggttctggacaaA-3，，如 SEQ ID N0.2 所不；
引物 2:5’ -AGCTTttgtccagaacctgatctcG-3，，如 SEQ ID N0.3 所不。
7.權利要求1-3任一項所述的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑在制備治療乳腺癌的藥物中的應用。
8.權利要求1-3任一項所述的重組腺相關病毒AAV-shCdc6制劑在制備抑制乳腺腫瘤的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K35/76GK103690569SQ201310666859
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權日:2013年12月11日
【發(fā)明者】姜偉, 朱長軍, 董智雄 申請人:天津億海生物科技有限公司