多肽和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含具有降冰片烯基團的氨基酸的多肽。合適的，所述降冰片烯基團作為氨基酸殘基降冰片烯賴氨酸而存在。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生包含降冰片烯基團的多肽的方法，所述方法包括以遺傳方式將包含降冰片烯基團的氨基酸摻入多肽中。
【專利說明】多肽和方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及通過（擴展的）遺傳密碼而位點特異性的摻入生物正交基團。具體而 言，本發(fā)明涉及將降冰片烯基團摻入多肽中。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 通過遺傳密碼擴展而位點特異性的摻入生物正交基團提供了用任何探針位點特 異性標記蛋白質(zhì)的有力通用策略。但是，可以按遺傳方式編碼的生物正交官能團的緩慢反 應性限制了這項策略的實用性。
[0004] 迫切需要在多樣背景下采用用戶定義的探針位點特異性標記蛋白質(zhì)的通用方法。
[0005] 當前的蛋白質(zhì)標記方法涉及使用熒光蛋白融合物[1-4]、自標記蛋白（例如，SNAP 標簽、HALO標簽、CLIP標簽）[5-8]、連接酶（例如，生物素連接酶、硫辛酸連接酶、分選酶 和磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶）[9-15]和自標記標簽（例如，四半胱氨酸和四絲氨酸） [16, 17]。盡管這些方案中的一些允許快速標記并且已經(jīng)對生物研究產(chǎn)生重大影響，但是它 們需要使用蛋白質(zhì)融合物和/或向目的蛋白引入額外的序列。這可能擾動蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和 功能并使得在蛋白質(zhì)中的任何位置安置探針具有挑戰(zhàn)性。
[0006] 另外，可以通過這些方法中某些方法摻入的探針的范圍有限[3, 4, 18]。
[0007] 用于蛋白質(zhì)標記的理想方法將i)允許將探針容易地置于多種細胞中的蛋白質(zhì)中 的任何位置，ii)是快速和定量的，iii)對蛋白質(zhì)中用戶限定的位點特異，iv)顯示'接通 (turn on)'熒光且具有最少脫位點或背景標記，和v)允許用多種探針標記。原則上，以遺 傳編碼方式位點特異性摻入攜帶生物正交官能團的非天然氨基酸將允許用基本上任何探 針在所定義的位點標記特定蛋白質(zhì)。
[0008] 已經(jīng)使用琥珀抑制基因氨?；鵷RNA合成酶/tRNACUA對通過遺傳方式編碼生物正 交基團，包括疊氮化物、炔、酮、苯胺、烯、四唑和[1，2]氨基硫醇[19-29]。對于所建立的已 經(jīng)在蛋白質(zhì)上證明的的反應，相應模型反應的速率常數(shù)[30]處于ΙΟΑΓ 1^至ΙΟΛΓ1^的 范圍內(nèi)（雖然對于新出現(xiàn)的方法有報道更高的速率）[29, 31，32]。
[0009] 所建立反應的速率顯然足以允許在細胞表面上以高密度存在的以代謝方式摻 入的攜帶疊氮基和酮的聚糖類似物的有用標記，和在蛋白質(zhì)組摻入氨基酸類似物的標記 [33-35]。但是所建立的生物正交反應的遲緩性經(jīng)常造成難以在體外在限定的位點定量標 記物蛋白質(zhì)，并且可以解釋如下事實：目前沒有使用遺傳編碼的非天然氨基酸標記在哺乳 動物細胞表面上表達的蛋白質(zhì)的例子。
[0010] 本發(fā)明尋求克服與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。
[0011] 發(fā)明簡述
[0012] 生物正交化學的最新進展已經(jīng)證明，包括降冰片烯和反-環(huán)辛烯在內(nèi)的應變烯 (strainded alkene)與四嗪在逆向電子需求Diels-Alder環(huán)加成中迅速并特異性反應以 形成穩(wěn)定加合物，速率常數(shù)量級快于已建立的生物正交反應[36-38]。本發(fā)明人已經(jīng)產(chǎn)生了 用于以遺傳方式編碼這些反應的組分的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括方法和新試劑。這為位點特異 性快速蛋白質(zhì)標記的實現(xiàn)提供了有效的策略。
[0013] 更具體地，發(fā)明人證明了在大腸桿菌和哺乳動物細胞中使用吡咯賴氨酰-tRNA合 成酶/tRNA^對按遺傳方式編碼降冰片烯氨基酸。發(fā)明人提供了一系列基于四嗪的探針， 所述探針與降冰片烯快速反應時顯示"接通"的熒光。發(fā)明人證明，對所編碼的降冰片烯的 標記相對于整個蛋白質(zhì)組是特異的并且比所建立的可編碼生物正交反應快數(shù)千倍。發(fā)明人 明確顯示了，對于體外蛋白標記和在哺乳動物細胞上的蛋白標記，本發(fā)明的方法優(yōu)于現(xiàn)有 的生物正交反應，這證明了哺乳動物細胞表面上的蛋白質(zhì)的首次生物正交性位點特異性標 記。
[0014] 本發(fā)明人還進一步教導了，遺傳編碼的降冰片烯通過快速生物正交環(huán)加成指導哺 乳動物細胞表面上的位點特異性蛋白質(zhì)標記。
[0015] 發(fā)明詳述
[0016] 在一個方面，本發(fā)明提供了包含具有降冰片烯基團的氨基酸的多肽。摻入降冰片 烯基團具有本文中描述并證明的許多益處。
[0017] 合適的，降冰片烯基團作為氨基酸殘基降冰片烯賴氨酸存在。
[0018] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含單個具有降冰片烯基團的氨基酸的多肽。 僅具有單個攜帶降冰片烯基團的氨基酸提供了準確限定的多肽產(chǎn)物。僅具有單個攜帶降冰 片烯基團的氨基酸避免了多重標記或不完全標記問題（如果反應沒有完成，則可以產(chǎn)生異 質(zhì)產(chǎn)物，這可能是通過僅具有單個攜帶降冰片烯基團的氨基酸而有效解決的問題）。在一個 優(yōu)選實施方案中，所述降冰片烯基團作為氨基酸殘基降冰片烯賴氨酸而存在。優(yōu)選地，所述 單個氨基酸不是N端氨基酸。優(yōu)選地，N末端氨基不包含降冰片烯。優(yōu)選地，攜帶降冰片烯 的氨基酸殘基是多肽的內(nèi)部氨基酸。
[0019] 在另一個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含降冰片烯基團的多肽的方法，所述方法包括 以遺傳方式將包含降冰片烯基團的氨基酸摻入多肽中。以遺傳方式摻入降冰片烯基團能夠 準確的構(gòu)建給定的多肽。降冰片烯基團的位置可受到準確控制。這有利地避免了為了添加 降冰片烯基團而使整個多肽經(jīng)歷復雜反應步驟的需求。
[0020] 合適的，所描述的用于產(chǎn)生多肽的方法包括：
[0021] (i)提供編碼所述多肽的核酸，所述核酸包含編碼具有降冰片烯基團的氨基酸的 正交密碼子；
[0022] (ii)在能夠識別所述正交密碼子并將所述具有降冰片烯基團的氨基酸摻入多肽 鏈的正交性tRNA合成酶/tRNA對存在下翻譯所述核酸。
[0023] 適當?shù)?，所述正交密碼子包含琥珀密碼子（TAG)，所述tRNA包含MbtRNAeuA，所述 tRNA合成酶包含MbPylRS。
[0024] 適當?shù)兀霭当┗鶊F的氨基酸是降冰片烯賴氨酸。
[0025] 適當?shù)?，所述氨基酸是?ε -5-降冰片烯-2-基氧羰基-L-賴氨酸。
[0026] 適當?shù)?，在與野生型多肽中賴氨酸殘基相對應的位置摻入所述具有降冰片烯基團 的氨基酸。這具有以下優(yōu)點：維持含有降冰片烯的多肽與從中衍生該多肽的野生型多肽的 可能的最密切的結(jié)構(gòu)關(guān)系。
[0027] 適當?shù)?，該多肽包含單個降冰片烯基團。這具有以下優(yōu)點：維持可能指向降冰片烯 基團的任何進一步的化學修飾的特異性。例如當目的多肽中僅存在單個降冰片烯基團時， 則有利地避免了可能的部分修飾的問題（例如，其中多肽中僅降冰片烯基團的子集隨后被 修飾的情況下，或相同多肽中可替代的降冰片烯基團之間反應微環(huán)境不同的問題（這可能 導致該多肽中不同位置處不同降冰片烯基團之間的不均等反應性）。適當?shù)?，所述多肽包?單個降冰片烯氨基酸殘基。
[0028] 摻入降冰片烯基團的重要優(yōu)勢在于，允許多種非常有用的進一步的化合物如標記 物容易且特異地連接至降冰片烯基團。
[0029] 適當?shù)?，所述降冰片烯基團與四嗪基團連接。
[0030] 適當?shù)?，所述四嗪基團進一步與熒光團連接。
[0031] 適當?shù)?，所述四嗪基團進一步與PEG基團連接。
[0032] 適當?shù)?，所述熒光團包括熒光素、四甲基羅丹明（TAMRA)或硼-二吡咯亞甲基 (B0DIPY)。
[0033] 在另一個方面，本發(fā)明涉及包含降冰片烯基團的新的非天然氨基酸，如Ν ε -5-降 冰片烯_2_基氧撰基-L-賴氨酸。
[0034] 適當?shù)兀?ε -5-降冰片烯-2-基氧羰基-L-賴氨酸對應于式2 :
[0035]
【權(quán)利要求】
1. 包含具有降冰片烯基團的單個氨基酸的多肽，其中所述降冰片烯基團作為氨基酸殘 基降冰片烯賴氨酸而存在。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述單個氨基酸不是N-末端氨基酸。
3. 產(chǎn)生包含降冰片烯基團的多肽的方法，所述方法包括以遺傳方式將包含降冰片烯基 團的氨基酸摻入多肽中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中產(chǎn)生所述多肽包括 (i) 提供編碼所述多肽的核酸，其中所述核酸包含編碼具有降冰片烯基團的氨基酸的 正交密碼子； (ii) 在能夠識別所述正交密碼子并將所述具有降冰片烯基團的氨基酸摻入多肽鏈的 正交性tRNA合成酶/tRNA對存在下，翻譯所述核酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述正交密碼子包括琥珀密碼子（TAG)，所述tRNA 包括MbtRNAeuA并且所述tRNA合成酶包括MbPyIRS。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3至5任一項所述的方法，其中所述包含降冰片烯基團的氨基酸是降 冰片烯賴氨酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求3至6任一項所述的方 法，其中所述氨基酸是Ν ε -5-降冰片烯-2-基氧羰基-L-賴氨酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或7所述的多肽或根據(jù)權(quán)利要求3至7任一項所述的方法，其中 在與野生型多肽中賴氨酸殘基相對應的位置摻入所述具有降冰片烯基團的氨基酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、7或8中任一項所述的多肽，其包含單個降冰片烯基團。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、7、8或9中任一項所述的多肽，其中所述降冰片烯基團與四嗪基 團連接。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的多肽，其中所述四嗪基團還與熒光團或與PEG基團連接。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽，其中所述熒光團包括熒光素、四甲基羅丹明（TAMRA) 或硼-二吡咯亞甲基（BODIPY)。
13. Ν ε -5-降冰片烯_2_基氧撰基-L-賴氨酸。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的Ν ε -5-降冰片烯-2-基氧羰基-L-賴氨酸，具有下式
15. 與熒光團連接的四嗪化合物或與聚乙二醇（PEG)基團連接的四嗪化合物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的四嗪化合物，其中所述四嗪選自圖1的5、6、7或8。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的四嗪化合物，其中所述熒光團包括熒光素、 四甲基羅丹明（TAMRA)或硼-二吡咯亞甲基（BODIPY)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的四嗪化合物，其中所述四嗪化合物選自圖1的9、10、11、 12、13 或 14。
19. 產(chǎn)生包含四嗪基團的多肽的方法，所述方法包括提供權(quán)利要求1、2、7、8或9中任一 項所述的多肽，使所述多肽與四嗪化合物接觸，并溫育以使所述四嗪通過環(huán)加成反應與降 冰片烯基團連接。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述環(huán)加成反應是逆向電子需求Diels-Alder 環(huán)加成反應。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中使所述反應進行16小時或更短時間。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中使所述反應進行2小時或更短時間。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中使所述反應進行30分鐘或更短時間。
24. 根據(jù)權(quán)利要求19至23中任一項所述的方法，其中所述四嗪化合物是根據(jù)權(quán)利要求 15至18中任一項所述的四嗪化合物。
25. 使多肽PEG化的方法，包括實施權(quán)利要求19至23中任一項所述的方法，其中所述 四嗪化合物是與PEG基團連接的四嗪化合物。
26. 四嗪化合物，選自圖1的5、6、7或8。
27. 具有突變 L275A、C314S、M316I 的 MbtRNA 合成酶（MbPyIRS)。
28. 基本上如本文所述的化合物、多肽或方法。
29. 參考附圖基本上如本文所述的化合物、多肽或方法。
【文檔編號】A61K49/00GK104203971SQ201380015571
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月20日
【發(fā)明者】賈森·欽, 亞歷山大·戴特斯 申請人:醫(yī)藥研究委員會, 北卡羅來納州大學