一種禽腦脊髓炎和雞痘二聯(lián)活疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種禽腦脊髓炎和雞痘二聯(lián)活疫苗，由抗原和保護(hù)劑組成的，其中抗原包含有雞痘病毒和保藏編號(hào)為CGMCC?No.8505的禽腦脊髓炎病毒。本發(fā)明制備的二聯(lián)苗可同時(shí)預(yù)防禽腦脊髓炎和雞痘，達(dá)到了一針兩防的目的。而且，組成本發(fā)明篩選的禽腦脊髓炎病毒為弱毒株，通過水平傳播感染在雞體連續(xù)傳代，均未見毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，遺傳性穩(wěn)定，符合禽腦脊髓炎弱毒疫苗株無(wú)毒力返強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)，制成的疫苗能夠提供有效的免疫保護(hù)，具有很好的商品化開發(fā)前景。
【專利說(shuō)明】一種禽腦脊髓炎和雞痘二聯(lián)活疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于家禽疫苗制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種禽腦脊髓炎和雞痘二聯(lián)活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]禽腦脊髓炎(AE)是由禽腦脊髓炎病毒(AEV)引起的一種主要危害4周齡以下雛雞，以侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起非化膿性腦炎為主要病理特征的病毒性傳染病，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)失調(diào)、頭頸震顫和后趾麻痹等神經(jīng)癥狀，特別是頭和頸部的震顫。因此，過去常稱為“流行性震顫”。4周齡以下雛雞感染AEV后，發(fā)病率一般為20%~60%，死亡率平均為25%，也可超過50% ;成年雞感染不表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，但可引起一過性產(chǎn)蛋下降，下降幅度為16%~43%，有的高達(dá)60%以上，但不出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，約兩周后產(chǎn)蛋可恢復(fù)正常。但此時(shí)期所產(chǎn)的種蛋高度帶毒，在孵化時(shí)呈現(xiàn)兩種趨勢(shì):一部分雞胚在孵化后期死亡；另一部分雖可孵化出殼，但在出殼時(shí)或出殼后數(shù)天內(nèi)即能表現(xiàn)癥狀，這些雛雞的糞便中帶有大量病毒，能造成其他雛雞的感染。禽腦脊髓炎在全世界均有發(fā)生，易感雞群在一年四季均可發(fā)病，冬春發(fā)生較多。幾乎所有雞群最終都會(huì)被病毒感染，但臨床發(fā)病率較低。
[0003]1930年，Jones首先在2周齡商品代洛島紅雞發(fā)現(xiàn)AE，表現(xiàn)為震顫。1931年觀察到兩次暴發(fā)，發(fā)生在不同雞場(chǎng)的I周齡和4周齡雞群，這兩個(gè)群源于同一種雞群。在以后的兩年間，在新英格蘭地區(qū)多個(gè)州均發(fā)現(xiàn)了 AE的暴發(fā)，因此又稱為“新英格蘭病”。1934年，Jones取自然發(fā)病雞的腦組 織濾液經(jīng)腦內(nèi)接種易感雞復(fù)制出了本病。1938年，Van Roekel等指出:并不是總能觀察到震顫，當(dāng)出現(xiàn)震顫時(shí)隨后會(huì)出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)，因?yàn)榇瞬∮袀魅拘院椭饕趾χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)，所以提出稱為“傳染性禽腦脊髓炎”，后來(lái)縮為“禽腦脊髓炎”并于1939年被美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)委員會(huì)采用。1958年，Schaaf第一次報(bào)道通過免疫成功控制了本病。1960年Calnek等闡明了 AE的流行病學(xué)，隨后開發(fā)出了口服疫苗，成為當(dāng)今世界商品雞群控制AE的基礎(chǔ)。該病現(xiàn)已遍布世界各地，很多國(guó)家和地區(qū)都有該病發(fā)生的報(bào)道。
[0004]我國(guó)許多省市，均有發(fā)生本病的報(bào)道，已給養(yǎng)禽業(yè)造成多方面的損失。1980年張澤紀(jì)首先在廣東的雛雞群中發(fā)現(xiàn)疑似AE。1982年李心平通過病理組織學(xué)確診該病。1983年畢英佐通過流行病學(xué)、病理組織學(xué)確診此病。姚大明、秦愛建、趙振華、姚永秀等相繼進(jìn)行了AEV的分離和鑒定工作及疫苗的研制與應(yīng)用試驗(yàn)。近年來(lái)遼寧、江蘇、黑龍江、河北、山東、內(nèi)蒙古、福建、上海、河南、江西、陜西等地陸續(xù)出現(xiàn)AE的報(bào)道。黃駿明等用雞腦敏感試驗(yàn)檢測(cè)了哈爾濱市17個(gè)蛋雞群，發(fā)現(xiàn)這些蛋雞群對(duì)AE的污染率為95.1%。由此可見，該病在我國(guó)是廣泛存在的。
[0005]雞痘(Fowl Pox)是由雞痘病毒引起的雞和火雞的一種急性、接觸性傳染病，世界各地均有發(fā)生。這種病傳播速度慢，特點(diǎn)是皮膚有增生性病變并結(jié)痂，上消化道和呼吸道白喉狀病變。皮膚型病例死亡率通常較低，比白喉型病例易康復(fù)。白喉型則在鼻道、咽或喉發(fā)生增生性病變，從而造成呼吸困難，窒息致死?？墒鼓鸽u產(chǎn)蛋暫時(shí)減少，青年雞生長(zhǎng)滯緩?，F(xiàn)已有商品化的由雞痘病毒致弱活疫苗，通過雞胚或禽類細(xì)胞培養(yǎng)制造。在雞痘流行地區(qū)或診斷有雞痘感染的雞場(chǎng)可以使用疫苗。
[0006]對(duì)急性暴發(fā)AE的雛雞沒有有效的治療方法。在育成期接種疫苗，能控制種雞群在性成熟后不再發(fā)生感染，同時(shí)也能防止病毒經(jīng)蛋途徑擴(kuò)散。此外，母源抗體能保護(hù)雛雞在最易感的頭2~3周抵抗AEV感染。商品產(chǎn)蛋雞群也可以進(jìn)行免疫接種，以防止由AE引起的一過行產(chǎn)蛋下降。世界上許多國(guó)家已經(jīng)將活疫苗用于免疫接種多數(shù)雞群，國(guó)內(nèi)已研制成功滅活疫苗，可用于開產(chǎn)雞或者限制使用活疫苗的地區(qū)，目前國(guó)內(nèi)還沒有活疫苗產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種禽腦脊髓炎和雞痘二聯(lián)活疫苗(以下簡(jiǎn)稱二聯(lián)苗)，即由禽腦脊髓炎弱毒疫苗株和雞痘鵪鶉化弱毒株作為抗原制備的疫苗，本發(fā)明的疫苗對(duì)目前中國(guó)禽腦脊髓炎病毒的攻擊和雞痘病毒的攻擊提供良好的免疫保護(hù)效力。
[0008]本發(fā)明的禽腦脊髓炎和雞痘二聯(lián)活疫苗，由抗原和保護(hù)劑組成的，其中抗原包含有雞痘病毒和保藏編號(hào)為CGMCC N0.8505的禽腦脊髓炎病毒。
本發(fā)明所使用的禽腦脊髓炎病毒YBF02株(禽腦脊髓炎病毒Avian Encephalomyelitisvirus)，該病毒株于2013年11月08日保藏在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為=CGMCC N0.8505。
[0009]其中的保護(hù)劑可以為目前使用的任一種病毒疫苗用保護(hù)劑，例如蔗糖和明膠，其在疫苗中的質(zhì)量百分比終濃度分別為5%和1% ；
[0010]為了提高疫苗保護(hù)劑的抗熱性，在保護(hù)劑中還添加有酪蛋白酸鈉，添加的質(zhì)量百分比濃度為0.5%，使疫苗在冷凍條件長(zhǎng)期保存后，效力仍能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。
[0011]上述的疫苗中加入了抗生素，青霉素、鏈霉素終濃度為200單位/ml ；
`[0012]上述的二聯(lián)苗的制備方法，是將禽腦脊髓炎病毒接種雞胚，收獲胚液和雞胚腦、胃、腸、胰腺，混合研磨、凍融、離心后取上清獲得病毒液；雞痘病毒接種SPF雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng),收獲病毒培養(yǎng)物，然后禽腦脊髓炎病毒液和雞痘病毒培養(yǎng)液混合后，加入保護(hù)劑制成的。
[0013]本發(fā)明制備的二聯(lián)苗可同時(shí)預(yù)防禽腦脊髓炎和雞痘，達(dá)到了一針兩防的目的。而且，組成本發(fā)明篩選的禽腦脊髓炎病毒為弱毒株，通過水平傳播感染在雞體連續(xù)傳代，均未見毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，遺傳性穩(wěn)定，符合禽腦脊髓炎弱毒疫苗株無(wú)毒力返強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)，制成的疫苗能夠提供有效的免疫保護(hù)，具有很好的商品化開發(fā)前景。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，可以選用本領(lǐng)域常用的方法步驟，而不僅限于本發(fā)明說(shuō)明書實(shí)施例的具體記載。
[0015]實(shí)施例1:禽腦脊髓炎病毒株的選育
[0016]取患有禽腦脊髓炎雛雞的腦、胰腺和十二指腸，在無(wú)菌條件下研磨，用滅菌生理鹽水作1:5稀釋、反復(fù)凍融3次、4000rpm離心30分鐘，取上清液濾器過濾后，腦內(nèi)接種I日齡SPF雛雞10只，0.1ml/只，待出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)、頭頸震顫等癥狀后采血致死，無(wú)菌取病雛雞的腦、胰腺和十二指腸，在無(wú)菌條件下研磨，用滅菌生理鹽水作1:5稀釋，反復(fù)凍融3次、4000rpm離心30分鐘,取上清液作為第I代分離毒(Fl)保存?zhèn)溆?。取Fl代同上方法腦內(nèi)接種I日齡SPF雛雞傳代，制備第2代分離毒(F2)。如此連傳4代。雞胚致病性試驗(yàn)表明分離毒為一株非雞胚適應(yīng)性的禽腦脊髓炎病毒弱毒。取I日齡SPF雛雞傳代的F4代種毒，10倍稀釋后，卵黃囊接種6日齡SPF雞胚，繼續(xù)在37~38°C孵育至16日齡收毒:吸取胚液，觀察胚體活動(dòng)和發(fā)育情況，稱胚體重和腦重，檢查胚體，胚腦病變(出血，積水，萎縮等)；并取胚腦，胃，腸，胰腺，用胚液作1:5稀釋,加雙抗,研磨，反復(fù)凍融3次,4000rpm離心30分鐘，制成懸液備用。這樣連續(xù)傳至第18代。選取作為疫苗研制的候選毒株AEV YBF02株，并于2013年11月08日保藏在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為=CGMCC N0.8505。
[0017]AEV YBF02株毒種安全性試驗(yàn):分別將基礎(chǔ)種子的第5、7、10代毒種稀釋，取I~10周齡SPF雞各10只，每只刺種或口服IO4EID5tl的YBF02株病毒，觀察28日，并記錄結(jié)果。結(jié)果表明:AEV YBF02株基礎(chǔ)種子第5、7、10代毒種對(duì)I~10周齡SPF雞是安全的，無(wú)任何禽腦脊髓炎特異性癥狀，不影響生長(zhǎng)發(fā)育。
[0018]表1:AEV YBF02株安全性試驗(yàn)結(jié)果
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種禽腦脊髓炎和雞痘二聯(lián)疫苗，其特征在于，所述的疫苗由抗原和保護(hù)劑組成，其中抗原包含有雞痘病毒和保藏編號(hào)為CGMCC N0.8505的禽腦脊髓炎病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于所述的禽腦脊髓炎病毒含量≥ IO3 5EID50 ;雞痘病毒含量≥IO3-5EID500
3.如權(quán)利要求1所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于所述的保護(hù)劑為蔗糖和明膠，其在疫苗中的質(zhì)量百分比終濃度分別為5%和1%。
4.如權(quán)利要求1所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于所述的保護(hù)劑中添加有酪蛋白酸鈉，添加的質(zhì)量百分比濃度為0.5%。
5.如權(quán)利要求1所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于所述的保護(hù)劑中加入抗生素。
6.如權(quán)利要求5所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于所述的抗生素為青霉素和鏈霉素，終濃度為200單位/ml。
7.權(quán)利要求1所述的二聯(lián)疫苗的制備方法，是將禽腦脊髓炎病毒接種雞胚，收獲胚液和雞胚腦、胃、腸、胰腺，混合研磨、凍融、離心后取上清獲得病毒液；雞痘病毒接種SPF雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒培養(yǎng)物，然后禽腦脊髓炎病毒液和雞痘病毒培養(yǎng)液混合后，加入保護(hù)劑制成的。
【文檔編號(hào)】A61K39/275GK103721253SQ201410001286
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】王紅, 范根成, 杜元釗, 宋新宇, 胡瀟, 宮曉, 郭偉偉, 孫健 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司