一種基于抗egfr單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白與應(yīng)用，包括通過連接肽相連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)的末端連接有精氨酸九聚體；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。本發(fā)明采用經(jīng)過篩選的連接肽連接單鏈的EGFR抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，既保留了抗體與EGFR結(jié)合的特異性和親和力，保證了所構(gòu)建的融合蛋白對EGFR的靶向性；而且降低了融合蛋白的大小，一方面既方便其構(gòu)建、表達(dá)和純化，實(shí)現(xiàn)了其低成本的獲取，另一方面保證了其對EGFR結(jié)合、尤其是內(nèi)化入細(xì)胞對分子大小、抗體活性的要求，確保了其對EGFR結(jié)合、靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)化的可行性和準(zhǔn)確性。
【專利說明】—種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗腫瘤【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]表皮生長因子受體(EGFR)家族是一類跨膜蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，通過調(diào)節(jié)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。膠質(zhì)細(xì)胞、腎癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等組織中都有EGFR的過表達(dá)。EGFR的高表達(dá)對一些惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、侵襲及新生血管形成等方面起關(guān)鍵作用(Mendelsohn J, J ClinOncol, 2003, 21(14): 2787-2799)，EGFR成為抗腫瘤藥物或者疫苗的重要靶點(diǎn)。
[0003]EGFR在腫瘤中高表達(dá)以及其在腫瘤生長分化中起的重要作用，使其成為腫瘤診斷、抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。目前，研發(fā)抑制惡性腫瘤中EGFR高表達(dá)的藥物已成為治療惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要手段之一。然而，在EGFR抑制劑研發(fā)中，雖有吉非替尼、西妥昔單抗等已被應(yīng)用于臨床，但療效并非理想，其它一些生物抑制劑仍處于基礎(chǔ)研究和臨床研究階段。同時(shí)，以EGFR作為靶點(diǎn)，尋找抑制惡性腫瘤中EGFR高表達(dá)的藥物是研發(fā)抗腫瘤新藥或類似化合物的重要途徑之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白與應(yīng)用，達(dá)到對腫瘤細(xì)胞起到特異性的殺傷作用，且毒副作用小。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0006]—種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白，包括通過連接肽相連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)的末端連接有精氨酸九聚體；其氨基酸序列如SEQ.1D.N0.3 所示。
[0007]一種編碼基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.4所示。
[0008]一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白的制備方法，包括以下操作:
[0009]I)將如SEQ.1D.N0.4所示的核苷酸克隆入pGEX4T_l表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0010]2)將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌，并在含氨芐青霉素的YTA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D600為0.4~0.6時(shí)，添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)后的菌液離心，收集細(xì)菌后破菌、離心，收集上清；
[0011 ] 3 )使用GST親和層析柱純化分離上清中的融合蛋白，得到基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白。
[0012]一種抗EGFR單鏈抗體，包括通過連接肽相連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
[0013]一種編碼抗EGFR單鏈抗體的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示。
[0014]所述的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物、抗腫瘤輔助藥物或腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
[0015]所述的融合蛋白在制備靶向EGFR的藥用載體、攜帶載體中的應(yīng)用。
[0016]所述的應(yīng)用，包括所述的融合蛋白在攜帶siRNA、microRNA、脂質(zhì)體中的一種或幾種進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部并釋放的應(yīng)用。
[0017]所述的核苷酸在構(gòu)建表達(dá)載體，以及制備抗腫瘤藥物、抗腫瘤輔助藥物或腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:[0019]本發(fā)明提供的基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白，采用經(jīng)過篩選的連接肽連接單鏈的EGFR抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，既保留了抗體與EGFR結(jié)合的特異性和親和力，保證了所構(gòu)建的融合蛋白對EGFR的靶向性；而且降低了融合蛋白的大小，一方面既方便其構(gòu)建、表達(dá)和純化，實(shí)現(xiàn)了其低成本的獲取，另一方面保證了其對EGFR結(jié)合、尤其是內(nèi)化入細(xì)胞對分子大小、抗體活性的要求，確保了其對EGFR結(jié)合、靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)化的可行性和準(zhǔn)確性。
[0020]進(jìn)一步的，精氨酸九聚體是一種連續(xù)的由9個(gè)精氨酸構(gòu)成的短肽，作為內(nèi)化工具可以使多肽、多聚核苷酸、脂質(zhì)體等極小微粒進(jìn)入細(xì)胞。通過與單鏈抗體融合表達(dá)，可以將抗腫瘤的物質(zhì)靶向輸送到腫瘤所在部位，并內(nèi)化入腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤的治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其具有免疫原性和靶向性，而且內(nèi)化性效果良好。
[0021]本發(fā)明提供的在大腸桿菌中表達(dá)的基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白，可以利用單鏈抗體對腫瘤細(xì)胞的靶向性和精氨酸九聚體的內(nèi)化作用，協(xié)同其他抗腫瘤分子，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞起到特異性的殺傷作用，效果明顯，且毒副作用小，制備簡單方便，有良好的應(yīng)用前景，為腫瘤的治療提供了一種新的選擇。
[0022]本發(fā)明提供的基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白，可應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物、抗腫瘤輔助藥物或腫瘤診斷試劑；可應(yīng)用于靶向EGFR的藥用載體、攜帶載體，包括所述的融合蛋白在攜帶siRNA、microRNA、脂質(zhì)體中的一種或幾種進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部并釋放；而其相對應(yīng)的編碼核苷酸，則可以參與載體的構(gòu)建，或者進(jìn)行表達(dá)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為表達(dá)載體酶切鑒定結(jié)果。
[0024]圖2 為 scFv (ant1-EGFR), scFv_9R 進(jìn)行表達(dá)鑒定。
[0025]圖3為ELISA實(shí)驗(yàn)檢測scFv (ant1-EGFR), scFv_9R的抗原結(jié)合活性。
[0026]圖4a~圖4c為免疫熒光檢測scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R靶向結(jié)合能力。
[0027]圖5a~圖5c為流式細(xì)胞術(shù)檢測scFv (ant1-EGFR), scFv_9R靶向結(jié)合能力。
[0028]圖6為凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)檢測scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R攜帶核酸能力。
[0029]圖7a~圖7c為scFv (ant1-EGFR)> scFv_9R的革巴向性攜帶核酸內(nèi)化能力。
[0030]圖8a~圖8c為scFv (ant1-EGFR)> scFv_9R的體內(nèi)革巴向性結(jié)合能力。
【具體實(shí)施方式】[0031]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0032]1、抗EGFR單鏈抗體、融合蛋白的構(gòu)建和制備
[0033](I)序列的構(gòu)建
[0034]為了提高抗EGFR抗體所能夠發(fā)揮的作用，本發(fā)明利用重組抗體單鏈來降低抗體蛋白的大小，在發(fā)揮其特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上便于重組蛋白的表達(dá)、內(nèi)化。所構(gòu)建的EGFR單鏈抗體由連接肽連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)而構(gòu)成，所述的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)和連接肽均經(jīng)過大量的篩選，尤其是以融合表達(dá)之后的活性作為重要依據(jù)。
[0035]本發(fā)明所構(gòu)建的抗EGFR單鏈抗體的氨基酸序列如下(SEQ.1D.N0.1)所示:
[0036]LQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPffTFGQGTKLQI[0037]該單鏈抗體具有244個(gè)氨基酸殘基，其中第I到第119aa為重鏈可變區(qū)，第120到第135aa為連接肽，第136到第244aa為輕鏈可變區(qū)。
[0038]從抑制抗腫瘤抗體氨基酸序列反向設(shè)計(jì)核酸表達(dá)序列，合成單鏈抗體及其與精氨酸九聚體融合蛋白的融合基因，之后進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)。
[0039]在單鏈抗體的基礎(chǔ)上，反向設(shè)計(jì)基因表達(dá)序列并進(jìn)行密碼子優(yōu)化，所得的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示。
[0040]將SEQ.1D.N0.2所示的核苷酸序列克隆入pGEX4T-l表達(dá)載體的BamH I和XhoI位點(diǎn)之間,構(gòu)建重組質(zhì)粒。
[0041]為使抗EGFR單鏈抗體具有攜帶siRNA、microRNA、脂質(zhì)體、示蹤劑等的作用，本發(fā)明采用精氨酸九聚體對其進(jìn)行修飾，修飾后的氨基酸序列如下(SEQ.1D.N0.3)所示:
[0042]LQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPffTFGQGTKLQIRRRRRRRRR ；
[0043]該融合蛋白具有253個(gè)氨基酸殘基，其中第I到第244aa單鏈抗體段scFv(ant1-EGFR)，第245到第253aa為精氨酸九聚體段。
[0044]精氨酸九聚體是一種連續(xù)的由9個(gè)精氨酸構(gòu)成的短肽，作為內(nèi)化工具可以使多肽、多聚核苷酸、脂質(zhì)體等極小微粒進(jìn)入細(xì)胞。
[0045]本發(fā)明通過精氨酸九聚體與單鏈抗體融合表達(dá)，可以將上述物質(zhì)靶向輸送到腫瘤所在部位，并內(nèi)化入腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤的治療作用。
[0046]同樣將反向設(shè)計(jì)基因表達(dá)序列并進(jìn)行密碼子優(yōu)化，所得的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2，SEQ.1D.N0.4所示。并分別在核苷酸序列C端加入6XHis.tag序列后克隆入PEGX4T-1表達(dá)載體的BamH I和Xho I位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
[0047](2)重組大腸桿菌的構(gòu)建
[0048]為了便于融合蛋白的表達(dá)，本發(fā)明采用原核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，并進(jìn)行提取。
[0049]將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，大腸桿菌擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，酶切鑒定并測序；酶切鑒定結(jié)果見圖1，其中泳道I為maker，泳道2、3分別為ScFv(ant1-EGFR)、scFv-9R的重組載體,可以清晰的看到兩條泳帶,表明表達(dá)序列已連接入pGEX4T-l載體。
[0050]將測序正確的scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，從而獲得重組基因scFv (ant1-EGFR)、scFv-9R的表達(dá)工程菌。
[0051](3) scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R 的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物鑒定。
[0052]挑選scFv(ant1-EGFR)、scFv_9R的單克隆工程菌接種于2X YTA培養(yǎng)基(含氨芐青霉素，Amp)，370C培養(yǎng)至0D600約為0.4-0.6時(shí)，添加異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.1mM誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)后的菌液離心，沉淀重懸于破菌緩沖液(PBS ΡΗ7.4)，超聲破菌、離心，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE檢測出重組蛋白的表達(dá)形式為可溶性蛋白。
[0053]對于上清使用GST親和層析柱純化:(I)用10倍介質(zhì)體積緩沖液A(10mMNa2HP04,1.8mM KH2P04,140mM NaCl，2.7mM KCl，調(diào)節(jié) pH 值至 8.0)過柱，平衡介質(zhì)；(2)上樣；(3)用10倍介質(zhì)體積緩沖液A過柱，洗去層析柱中殘余上樣液并重新平衡介質(zhì)；(4)用10倍介質(zhì)體積緩沖液B(10mM Glutathione, 50mM Tris-HCl,調(diào)節(jié)pH值至8.0)洗脫，收集洗脫液。(5)經(jīng)Millipore超濾管超濾濃縮后,使用Bradford繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定蛋白質(zhì)濃度。(6)使用Novagen Thrombin kit去除融合蛋白標(biāo)簽,每Img融合蛋白加入4U凝血酶，20°C酶切8小時(shí)，之后再次經(jīng)GST親和層析柱純化收集穿透液，得到C端具有6XHis.tag的scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R單鏈抗體融合蛋白。
[0054]2、對scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R單鏈抗體融合蛋白進(jìn)行鑒定及功能驗(yàn)證
[0055](1)對制備的 scFv (ant1-EGFR)、ScFv-9R 進(jìn)行鑒定:
[0056]將純化之后的scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R利用western blot的方法進(jìn)行鑒定，一抗為抗6XHis.tag抗體,二抗為Dylight488標(biāo)記抗小鼠二抗:樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，100V80分鐘轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后封閉I小時(shí)。之后與一抗孵育2小時(shí)、二抗孵育I小時(shí)。掃膜儀掃膜之后，結(jié)果如圖2所示，樣品呈陽性結(jié)果，表明單鏈抗體融合蛋白表達(dá)成功。
[0057](2) scFv (ant1-EGFR)、scFv-9R的EGFR抗原特異性結(jié)合活性及細(xì)胞內(nèi)靶向性內(nèi)化能力:
[0058]通過ELISA實(shí)驗(yàn)及針對A549細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)，檢測scFv(ant1-EGFR)、scFv_9R的靶向性及內(nèi)化能力。
[0059]ELISA檢測單鏈抗體融合蛋白抗原結(jié)合活性:
[0060](I) ELISA板中每孔加入100 μ L用ρΗ9.6碳酸鹽包被緩沖液稀釋的重組人EGFR蛋白(10mg/L)4°C過夜；(2)每孔加入羊血清封閉液200 μ L，37°C封閉Ih ;(3)每孔加入不同濃度的蛋白稀釋樣品，37°C孵育2h同時(shí)設(shè)3個(gè)復(fù)孔及陰性對照孔；(4)每孔加入按照1:1000比例稀釋的抗6 XHis —抗37°C孵育Ih，每孔加入按照1:5000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠的二抗37°C孵育Ih ; (5)每孔加入100 μ LTMB顯色液，避光20min明顯顯色后，加入終止液50 μ L終止反應(yīng)；(6)酶標(biāo)儀測定各孔波長為450nm的吸光值。
[0061]如圖3所示，結(jié)果表明:隨著蛋白稀釋度的增加，scFv、scFv_9R融合蛋白與EGFR抗原的結(jié)合也相應(yīng)減少，與陰性對照BSA及陽性對照scFv相比較,融合蛋白scFv-9R也能與細(xì)胞表面HER2抗原特異性結(jié)合，因此9R片段的融合對scFv與EGFR抗原的結(jié)合無明顯影響。
[0062]免疫熒光檢測靶向結(jié)合能力:[0063]將胰酶消化的A549細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)蓋玻片之上。37°C，5%C02培養(yǎng)箱中過夜；將 scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R、BSA 用 PBS (PH7.4)稀釋至 10 μ g/ml，取出 6 孔板，將上述試劑分別與A549細(xì)胞共孵育4小時(shí)；PBS洗滌細(xì)胞3次；將稀釋好的抗6XHis —抗(I:2000)加入6孔板中與細(xì)胞共孵育2小時(shí)；PBS洗滌細(xì)胞后，用稀釋好的cy3標(biāo)記的抗小鼠二抗(1:200)與細(xì)胞共孵育I小時(shí)；PBS洗滌細(xì)胞3次，加入I:10000比例稀釋的DAPI染液復(fù)染細(xì)胞核；PBS洗滌后激光共聚焦顯微鏡觀察。
[0064] 結(jié)果表明:相對于BSA (圖4a所示，幾乎沒有結(jié)合)孵育的細(xì)胞之后，scFv(ant1-EGFR)(圖4b所示，與細(xì)胞EGFR結(jié)合并內(nèi)化入細(xì)胞內(nèi))、scFv_9R (圖4c所示，與細(xì)胞EGFR進(jìn)行結(jié)合并內(nèi)化入細(xì)胞內(nèi))能夠特異性的結(jié)合于EGFR高表達(dá)的A549細(xì)胞株，并內(nèi)化入細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)，因此后兩者具有明顯的腫瘤細(xì)胞靶向性。
[0065]流式細(xì)胞術(shù)檢測靶向性結(jié)果:
[0066]收集對數(shù)生長期A549細(xì)胞，接種于6孔板，37°C，5%C02培養(yǎng)箱中過夜；將用PBS(PH7.4)稀釋至10 μ g/ml的scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R、BSA加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，與細(xì)胞共孵育4小時(shí)后收取細(xì)胞至EP管，預(yù)冷的PBS洗滌。將稀釋好的抗6XHis—抗(1:2000)加入管中混勻，冰上放置2小時(shí)。預(yù)冷的PBS洗滌后，用稀釋好的FITC標(biāo)記的抗小鼠二抗(1:200)與細(xì)胞冰上共孵育I小時(shí)，PBS洗滌之后重懸送檢。
[0067]檢測結(jié)果表明:與BSA (圖5a所示，基本都落在了 Ml區(qū))孵育細(xì)胞相比，scFv(ant1-EGFR)(圖5b所示，基本都落在了 M2區(qū))、scFv_9R (圖5c所示，大部分都落在了 M2區(qū))均能夠與A549細(xì)胞特異性結(jié)合，表現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞的靶向性、高親和力。
[0068]3、scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R革巴向攜帶核酸及內(nèi)化能力
[0069]通過對凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)檢測scFv (ant1-EGFR)、scFv-9R攜帶核酸及內(nèi)化能力。
[0070](I)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)檢測scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R攜帶核酸能力:
[0071]各取I μ g非特異性的PCR產(chǎn)物，分別與I μ g，4l.! g，10μ g純化的單鏈抗體、融合蛋白于0.2mol/L NaCl溶液中室溫孵育30min后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。
[0072]結(jié)果詳見圖6:與BSA、scFv (ant1-EGFR)相比，scFV_9R組隨蛋白濃度增大核酸電泳速度逐漸減慢，表明其具有攜帶核酸能力。
[0073](2) scFv (ant1-EGFR)、scFv_9R的革巴向性攜帶核酸內(nèi)化能力:
[0074]BSA、scFv (ant1-EGFR), scFv_9R 各 10 μ g 分別與 20nM FAM-siRNA (siRNA 為非特異性)混合室溫下放置30分鐘后，加入預(yù)先接種于蓋玻片之上的A549細(xì)胞中，4小時(shí)后取出蓋玻片經(jīng)多聚甲醛固定20分鐘、DAPI復(fù)染細(xì)胞核。
[0075]激光共聚焦拍攝結(jié)果如圖所示:與BSA (圖7a所示，未見綠色熒光)、scFv(ant1-EGFR)(圖7b所示，未見綠色熒光)相比，scFv-9R (圖7c所示，綠色熒光可見于胞膜表面、胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞核)可攜帶綠色熒光的FAM-siRNA內(nèi)化入A549細(xì)胞漿及細(xì)胞核。
[0076]4、scFv (ant1-EGFR)、ScFv-9R 體內(nèi)革巴向結(jié)合能力
[0077]將scFv (ant1-EGFR)及scFv_9R融合蛋白及BSA透析至硼酸鈉溶液(PH值8.5)，與Dylight800染料室溫下結(jié)合I小時(shí)，再次透析至PBS溶液(PH值7.4)。經(jīng)鼠尾靜脈注射入已荷瘤一周的裸鼠體內(nèi)。經(jīng)48小時(shí)后使用IVIS Lumina II系統(tǒng)拍照。
[0078]結(jié)果表明:與注射了 BSA的裸鼠(如圖8a所示，未見紅色熒光)相比，scFv(ant1-EGFR)(如圖8b所示，可見紅色熒光)及scFv-9R (如圖8c所示，可見紅色熒光且亮度較高)均可靶向結(jié)合于裸鼠背部荷瘤。證明兩種單鏈抗體融合蛋白具有良好的體內(nèi)靶向親和能力。
[0079]鑒于EGFR單鏈抗體scFv (ant1-EGFR)、單鏈抗體與精氨酸九聚體融合蛋白scFv-9R對EGFR的靶向性、高親和力，并可內(nèi)化入目標(biāo)細(xì)胞；因此scFv (ant1-EGFR)、scFv-9R可以進(jìn)行以下應(yīng)用:
[0080]在制備抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物、腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
[0081]具體的，抗EGFR單鏈抗體可與示蹤劑交聯(lián)，發(fā)揮腫瘤示蹤診斷功能。[0082]EGFR與精氨酸九聚體融合蛋白可攜帶正電荷小分子物質(zhì),如siRNA、microRNA、月旨質(zhì)體等進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部并釋放,發(fā)揮抑制、殺傷腫瘤細(xì)胞作用。
【權(quán)利要求】
1.一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白，其特征在于，包括通過連接肽相連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)的末端連接有精氨酸九聚體；其氨基酸序列如SEQ.1D.N0.3所示。
2.一種編碼基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白的核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.4所示。
3.一種基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下操作: 1)將如SEQ.1D.N0.4所示的核苷酸克隆入pGEX4T_l表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒； 2)將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌，并在含氨芐青霉素的YTA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D600為0.4~0.6時(shí)，添加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)后的菌液離心，收集細(xì)菌后破菌、離心，收集上清； 3)使用GST親和層析柱純化分離上清中的融合蛋白，超濾濃縮后經(jīng)凝血酶酶切，得到基于抗EGFR單鏈抗體及精氨酸九聚體的融合蛋白。
4.一種抗EGFR單鏈抗體，其特征在于，包括通過連接肽相連接的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
5.—種編碼抗EGFR單鏈抗體的核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.2所示 ο
6.權(quán)利要求1或4所述的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物、抗腫瘤輔助藥物或腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1或4所述的融合蛋白在制備靶向EGFR的藥用載體、攜帶載體中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，包括所述的融合蛋白在攜帶siRNA、microRNA、脂質(zhì)體中的一種或幾種進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部并釋放的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2所述的核苷酸在構(gòu)建表達(dá)載體，以及制備抗腫瘤藥物、抗腫瘤輔助藥物或腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求5所述的核苷酸在構(gòu)建表達(dá)載體，以及制備抗腫瘤藥物、抗腫瘤輔助藥物或腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK103910799SQ201410081527
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】任新玲, 陸遠(yuǎn), 劉莉, 張瑞, 王媛, 馬進(jìn), 張艱, 李圣清, 李志奎 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)