骨髓間充質(zhì)干細胞作為治療正己烷致周圍性神經(jīng)病的藥物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明所述的骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）的具體應(yīng)用，解決了傳統(tǒng)上沒有針對正己烷致周圍性神經(jīng)病進行有效治療的藥物的問題，為治療該種神經(jīng)病提出了新的思路和具體應(yīng)用，它以患有正己烷致周圍性神經(jīng)病的大鼠作為實驗對象，通過步態(tài)評分，神經(jīng)電生理（神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期、神經(jīng)傳導(dǎo)速度），脊髓和坐骨神經(jīng)的砂羅鉻花青染色、掃描電鏡、髓鞘堿性蛋白和低分子量神經(jīng)絲為檢測指標；結(jié)果顯示，MSCs作為一種藥物，對正己烷致周圍性神經(jīng)病大鼠有顯著的修復(fù)作用，它將在職業(yè)中毒致周圍性神經(jīng)病的治療中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】骨髓間充質(zhì)干細胞作為治療正己烷致周圍性神經(jīng)病的藥物
的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種骨髓間充質(zhì)干細胞的應(yīng)用，特別是一種骨髓間充質(zhì)干細胞作為治療正己烷致周圍性神經(jīng)病的藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]慢性正己烷中毒患者的神經(jīng)系統(tǒng)損傷(正己烷致周圍性神經(jīng)病)，是由正己烷的最終代謝產(chǎn)物和終毒物2，5-己二酮(HD)所引起。其病理特點為軸索的神經(jīng)絲積聚和節(jié)段性腫脹，并繼發(fā)節(jié)段性脫髓鞘改變，以長、粗纖維最為明顯。許多學(xué)者從軸索骨架蛋白、能量代謝障礙以及NGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面，對正己烷中毒性周圍神經(jīng)病的發(fā)病機制進行了研究，但迄今尚未十分明了。目前慢性正己燒中毒患者的治療，包括脫離接觸、保證患者有足夠營養(yǎng)、給予B族維生素、能量合劑、活血化瘀、通絡(luò)補腎的中藥、及輔以針灸、理療、和四肢運動功能鍛煉，尚無特效藥物治療。因此現(xiàn)在需要找到或開發(fā)出一種能夠治療正己烷致周圍性神經(jīng) 病的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提出一種能夠治療正己烷致周圍性神經(jīng)病藥物的相關(guān)應(yīng)用，特別是骨髓間充質(zhì)干細胞作為治療正己烷致周圍性神經(jīng)病的藥物的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種骨髓間充質(zhì)干細胞作為治療正己烷致周圍性神經(jīng)病的藥物的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點:
本發(fā)明所述的骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的具體應(yīng)用，解決了傳統(tǒng)上沒有針對正己烷致周圍性神經(jīng)病進行有效治療的藥物的問題，為治療該種神經(jīng)病提出了新的思路和具體應(yīng)用，它以患有正己烷致周圍性神經(jīng)病的大鼠作為實驗對象，通過步態(tài)評分，神經(jīng)電生理(神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期、神經(jīng)傳導(dǎo)速度)，脊髓和坐骨神經(jīng)的砂羅鉻花青染色、掃描電鏡、髓鞘堿性蛋白(MBP)和低分子量神經(jīng)絲(低分子量神經(jīng)絲)為檢測指標；結(jié)果顯示，MSCs作為一種藥物，對正己烷致周圍性神經(jīng)病大鼠有顯著的修復(fù)作用，它將在職業(yè)中毒致周圍性神經(jīng)病的治療中發(fā)揮重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性。
[0007]圖2 MSCs移植對大鼠行為能力的影響。
[0008]圖3 MSCs移植對大鼠神經(jīng)電生理的影響。
[0009]圖4脊髓橫切面的砂羅鉻花青染色(X 200)。
[0010]圖5坐骨神經(jīng)橫切面的砂羅鉻花青染色(X200)。[0011]圖6脊髓橫切面的掃描電鏡檢測。
[0012]圖7坐骨神經(jīng)橫切面的掃描電鏡檢測。
[0013]圖8 MSCs移植對髓鞘堿性蛋白mRNA表達的影響。
[0014]圖9 MSCs移植對髓鞘堿性蛋白表達的影響。
[0015]圖10 MSCs移植對低分子量神經(jīng)絲mRNA表達的影響。
[0016]圖11 MSCs移植對低分子量神經(jīng)絲蛋白表達的影響。
【具體實施方式】
[0017]首先進行骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的分離培養(yǎng):
大鼠脫白處死，75%乙醇浸沒消毒，無菌剝離股骨及脛骨，去掉干骺端，使骨髓腔暴露，PBS反復(fù)沖洗，收集細胞過篩網(wǎng)并離心，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞并接種于培養(yǎng)皿中，在37 °C、CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液。以后3d換液I次，待細胞達到80%~90%融合時傳代，利用差速貼壁法逐步純化MSCs。取第3代生長狀態(tài)良好的細胞，利用單克隆抗體⑶90、⑶45進行流式檢測，以對MSCs進行鑒定。
[0018]建立正己烷致周圍神經(jīng)病的大鼠模型:
輕度疾病模型——200 mg/kg 2，5-己二酮大鼠腹腔注射，I天I次，I周5次，連續(xù)6周。
[0019]重度疾病模型-400 mg/kg 2，5_己二酮大鼠腹腔注射，I天I次，I周5次,連
續(xù)6周
建立正己烷致周圍神經(jīng)病模型的檢測平臺:
一般情況觀察，包括發(fā)育情況、行動、皮毛、飲食、體重等。
[0020]神經(jīng)電生理檢測:大鼠乙醚麻醉，俯臥位放置于大鼠固定器內(nèi)，暴露尾部。在尾部距離尾部起始點的3cm、10cm、15cm處分別標記為A、B、C點，A點放置刺激電極,B點及C點放置記錄電極，記錄AB間、AC間的神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期,按照公式MCV=Length BC/Latency BC(Length BC為BC兩點間距離，Latency BC為BC兩點間潛伏時間)計算神經(jīng)傳導(dǎo)速度。
[0021]脊髓和坐骨神經(jīng)的砂羅鉻花青染色:石蠟切片脫蠟至水，按照試劑盒說明，滴加砂羅鉻花青染色20min，流水洗2min，滴加硫酸鐵銨，至膠原纖維呈淡灰色，髓鞘呈清晰藍色，流水沖洗5min，滴加熒光桃紅復(fù)染數(shù)秒，稍水洗，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。
[0022]脊髓和坐骨神經(jīng)的掃面電鏡檢測:大鼠麻醉、固定，固定液為2.5%多聚甲醛+2.0%戊二醛0.lmol/L的磷酸緩沖液(pH=7.4)，固定完成后取脊髓和坐骨神經(jīng)。迅速將脊髓和坐骨神經(jīng)，置于上述灌注液中繼續(xù)固定24h，IOg /L鋨酸固定lh，丙酮梯度脫水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在SOkV電壓下用H-600型透射電鏡觀察并攝片。
[0023]脊髓和坐骨神經(jīng)的髓鞘堿性蛋白檢測:分別用real time PCR和Western blot檢測髓鞘堿性蛋白的mRNA水平和蛋白水平的表達。
[0024]脊髓和坐骨神經(jīng)的低分子量神經(jīng)絲檢測:分別用real time PCR和Western blot檢測低分子量神經(jīng)絲的mRNA水平和蛋白水平的表達。
[0025]MSCs移植正己烷致周圍神經(jīng)病大鼠:
每只模型大鼠尾靜脈移植IXlO6 MSCs0按照建立正己烷致周圍神經(jīng)病模型檢測平臺的操作步驟進行檢測。
[0026]結(jié)果
大鼠骨髓骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)和鑒定:
原代細胞接種72h后，大部分細胞貼壁，10-15天后細胞達到80%~90%融合，進行傳代。培養(yǎng)3代以后，細胞形態(tài)趨向均一，類似成纖維細胞樣，呈束狀或漩渦狀有序排列(圖W。取第3代細胞進行流式檢測，表面分子⑶90和⑶45的陽性表達率分別為96.61%和0.40%(圖1B、1C)。培養(yǎng)所得細胞為移植可用的MSCs。
[0027]在圖1A中，第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，細胞形態(tài)均一，類似成纖維細胞樣，呈束狀或漩渦狀有序排列；在圖1B中，流式檢測顯示96.61%的細胞表達CD90 ;在圖1C中，流式檢測顯示0.40%的細胞表達⑶45。
[0028]正己烷致周圍神經(jīng)病模型的建立:
對照組動物發(fā)育正常、行動迅速、毛色有光澤，實驗過程中無步態(tài)異常。中毒大鼠模型攝食減少、毛色晦暗、行動遲緩甚至癱瘓、體重增長緩慢甚至下降。至染毒第5周，輕度中毒大鼠出現(xiàn)明顯的以膝關(guān)節(jié)下降和拖尾為特征的運動異常，重度中毒大鼠后肢拖拉、完全無法站立、后掌上翻，步態(tài)評分均隨染毒時間的延長而逐漸增高。對照組大鼠步態(tài)始終正常。
[0029]MSCs移植對正己烷致周圍神經(jīng)病的影響:
行為能力觀察=MSCs移植后，輕度及重度模型大鼠的行為能力都得到明顯改善(圖2)。
[0030]圖2A、圖2D為正常對照大鼠，活動自如；圖2B為輕度中毒大鼠，出現(xiàn)明顯的以膝關(guān)節(jié)下降和拖圖2A尾為特征的運動異常；圖2C為輕度中毒大鼠移植MSCs后，后肢外展程度減輕；圖2E為重度中毒大鼠，出現(xiàn)后肢拖拉和完全無法站立，后掌上翻；圖2F為重度中毒大鼠移植MSCs后，略有恢復(fù)，后掌上翻消失，后肢可以撐地，但有外展。
[0031]神經(jīng)電生理檢測:MSCs移植后，輕度、重度模型大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期逐漸縮短，神經(jīng)傳導(dǎo)速度逐漸變快(圖3A、3B)。MSCs移植能明顯改善正己烷致周圍神經(jīng)病大鼠的神經(jīng)電生理。
[0032]通過圖3A能夠看出，MSCs移植后，中毒大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度逐漸加快,基本恢復(fù)正常；通過圖3B能夠看出，MSCs移植后，中毒大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期逐漸縮短，基本接近正
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[0033]脊髓和坐骨神經(jīng)的砂羅鉻花青染色:中毒大鼠的脊髓和坐骨神經(jīng)均出現(xiàn)明顯的脫髓鞘和神經(jīng)纖維排列紊亂，MSCs移植后脫髓鞘和神經(jīng)纖維排列紊亂現(xiàn)象均得到明顯改善(圖4，圖5)。
[0034]圖4A，正常大鼠脊髓白質(zhì)結(jié)構(gòu)致密規(guī)整；圖4B，輕度中毒大鼠，脊髓白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，部分區(qū)域出現(xiàn)脫髓鞘；圖4C，輕度中毒大鼠移植MSCs，脊髓白質(zhì)結(jié)構(gòu)較致密，脫髓鞘現(xiàn)象部分恢復(fù)；圖4D，重度中毒大鼠，嚴重脫髓鞘，部分區(qū)域有空泡結(jié)構(gòu)形成；圖4E，重度中毒大鼠移植MSCs，脫髓鞘現(xiàn)象改善，空泡結(jié)構(gòu)基本消失。
[0035]圖5A，正常大鼠，有髓纖維分布密集且均勻，單個纖維飽滿；圖5B，輕度中毒大鼠，軸索稀疏，部分軸突出現(xiàn)萎縮；圖5C，輕度中毒大鼠移植MSCs，軸突萎縮現(xiàn)象部分改善；圖5D，重度中毒大鼠，軸索稀疏排列，軸突出現(xiàn)明顯萎縮；圖5E，重度中毒大鼠移植MSCs，軸索間隙明顯縮小，軸突萎縮明顯改善。
[0036]脊髓和坐骨神經(jīng)的掃描電鏡檢測:MSCs移植后，中毒大鼠的脊髓脫髓鞘和脊髓分層增多現(xiàn)象明顯改善，坐骨神經(jīng)的髓鞘凹陷和神經(jīng)絲密度不均勻現(xiàn)象基本消失(圖6，圖7)。
[0037]圖6A.正常大鼠，髓鞘結(jié)構(gòu)完整；圖68，輕度中毒大鼠，部分髓鞘向軸突凹陷，出現(xiàn)輕度脫髓鞘；圖6C，輕度中毒大鼠移植MSCs，髓鞘凹陷部分恢復(fù)，脫髓鞘現(xiàn)象部分消失；圖6D，重度中毒大鼠，嚴重脫髓鞘，髓鞘分層明顯增多；圖6E，重度中毒大鼠移植MSCs，脫髓鞘現(xiàn)象部分恢復(fù)，髓鞘分層部分減少。
[0038]圖7A，正常大鼠，髓鞘結(jié)構(gòu)完整；圖7B，輕度中毒大鼠，部分髓鞘向軸突凹陷，軸突輕度萎縮；圖7(:，輕度中毒大鼠移植MSCs，髓鞘凹陷部分恢復(fù)，軸突部分恢復(fù)正常；圖70，重度中毒大鼠，髓鞘凹陷，軸突明顯萎縮；圖7E，重度中毒大鼠移植MSCs，髓鞘凹陷部分恢復(fù)，軸突部分恢復(fù)正常。
[0039]脊髓和坐骨神經(jīng)的髓鞘堿性蛋白檢測=Ptl是周圍神經(jīng)髓鞘上的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，占組織蛋白總量的50%以上，在周圍神經(jīng)髓鞘組織中發(fā)揮了粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要作用。real time PCR和WB檢測均顯示，MSCs移植后中毒大鼠脊髓和坐骨神經(jīng)中髓鞘堿性蛋白的mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯著恢復(fù)(圖8，圖9)。
[0040]圖8A和圖8B，MSCs移植對輕度、重度中毒大鼠脊髓髓鞘堿性蛋白mRNA表達的影響；圖8C和圖8D，MSCs移植對輕度、重度中毒大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘堿性蛋白mRNA表達的影響。
[0041]脊髓和坐 骨神經(jīng)的低分子量神經(jīng)絲(低分子量神經(jīng)絲)檢測:NF在維持神經(jīng)細胞的形態(tài)和運動功能、維持軸突的空間構(gòu)型及其正常的神經(jīng)信號傳導(dǎo)速度中發(fā)揮重要的作用。2，5-HD染毒干擾了 NF正常的組裝和去組裝之間的平衡，干擾了動態(tài)池中的NF單體和靜態(tài)池中的NF網(wǎng)狀骨架之間的動態(tài)交換，故引起神經(jīng)絲結(jié)構(gòu)紊亂。MSCs移植后，低分子量神經(jīng)絲水平得到明顯恢復(fù)(圖10，圖11)。
[0042]圖1OA和圖10B，MSCs移植對輕度、重度中毒大鼠脊髓低分子量神經(jīng)絲mRNA表達的影響；圖1OC和圖10D，MSCs移植對中毒大鼠坐骨神經(jīng)低分子量神經(jīng)絲mRNA表達的影響。
[0043]圖1lA和圖11B，MSCs移植中毒大鼠脊髓低分子量神經(jīng)絲蛋白表達的影響；圖11C，和圖llD，MSCs移植對中毒大鼠坐骨神經(jīng)低分子量神經(jīng)絲蛋白表達的影響。
[0044]綜上所述，MSCs移植到正己烷致周圍性神經(jīng)病大鼠體內(nèi)，能顯著修復(fù)其受損神經(jīng)組織的組織結(jié)構(gòu)，改善神經(jīng)電生理功能，并使其神經(jīng)行為趨向正常。MSCs可作為治療正己烷致周圍性神經(jīng)病的一種新方法。
【權(quán)利要求】
1.一種骨髓間充質(zhì) 干細胞作為治療正己烷致周圍性神經(jīng)病的藥物的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K35/28GK103919806SQ201410139573
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】樸豐源, 李雙月, 王哲敏, 董偉, 陳若霖, 戚媛, 劉爽 申請人:大連醫(yī)科大學(xué)