亞群的制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞，具體涉及骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群的制備及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]骨龕的組成復(fù)雜多樣，包含了多種細(xì)胞成分、細(xì)胞外基質(zhì)成分、氧氣張力生長因子、細(xì)胞因子，以及維持微環(huán)境的PH、離子強(qiáng)度、代謝物等物理化學(xué)因素。骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-associated MSC)是骨龕的組分細(xì)胞之一，其具有多種分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下，骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞可以發(fā)育為骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供的骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群的制備方法包括:利用抗-⑶45抗體、抗_Terll9抗體和抗-Scal抗體對骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分選得到骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群。
[0004]本發(fā)明同時還提供了骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群用于治療腫瘤相關(guān)性貧血的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明還提供了骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群制備緩解急性移植物抗宿主病的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0006]圖1為流式細(xì)胞儀鑒定骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群分選純化的結(jié)果。
[0007]圖2為分選的骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群，⑶271 +亞群和SSEA4-1 +亞群體外培養(yǎng)5d后檢測細(xì)胞增殖結(jié)果，顯微鏡放大倍率為400 X。
[0008]圖3為骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群支持造血重建結(jié)果；圖A為技術(shù)路線示意圖；圖B為克隆形成分析結(jié)果；圖C為骨髓移植后1-4月HSC重建形成分析，a圖為HSC重建分析；b圖為T細(xì)胞重建分析；c圖為髓系細(xì)胞重建分析；d圖為B細(xì)胞重建分析。
[0009]圖4為野生型小鼠(Ctrl)、未治療組(B16)、混合群治療組(B16/MSC)和亞群治療組(B16/Scal)小鼠生存曲線比較結(jié)果。
[0010]圖5為野生型小鼠(Ctrl)、未治療組(B16)、混合群治療組(B16/MSC)和亞群治療組(B16/Scal)的長骨比較。
[0011]圖6為骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群移植治療后，野生型(Ctrl)，未治療組(B16)，混合群治療組(B16/MSC)和亞群治療組(B16/Scal)小鼠外周血檢測結(jié)果比較；圖八為外周血中紅細(xì)胞計數(shù)；圖B為外周血中紅細(xì)胞壓積；圖C為外周血中血紅蛋白的濃度；圖中*代表顯著性差異程度，*P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001 ；ns代表沒有顯著差異。
[0012]圖7為骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群移植治療后，野生型(Ctrl)，未治療組(B16)，混合群治療組(B16/MSC)和亞群治療組(B16/Scal)小鼠的骨髓中紅系細(xì)胞發(fā)育檢測，圖A為流式檢測圖，圖B為數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析圖。
[0013]圖8為骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療后，同種骨髓移植組(Ctrl)，異種骨髓移植組(BM)、混合群治療組(MSC)和亞群治療組(Seal)的生存曲線比較結(jié)果。
[0014]圖9為骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療后，同種骨髓移植組(Ctrl)，異種骨髓移植組(BM)、混合群治療組(B16/MSC)和亞群治療組(B16/Scal)的臨床評分比較結(jié)果。
【具體實施方式】
[0015]造血微環(huán)境(Niche)這一概念在1978年由Schofield首先提出。這是一種從低等動物到哺乳動物都存在的造血調(diào)控模式。多項研宄證實，Niche是調(diào)控HSC生理功能的主要功能單位，是HSC的維持和調(diào)控依賴的特定細(xì)胞微環(huán)境。Niche內(nèi)的多種細(xì)胞可通過產(chǎn)生細(xì)胞因子，或者細(xì)胞直接接觸的方式，去調(diào)控HSC的自我更新、多向分化和不對稱分裂。如Niche內(nèi)Wnt信號的非經(jīng)典成員Flamingo和Frizzled分子之間的相互作用，直接參與維持HSC的穩(wěn)態(tài)；抑制Wnt信號同時活化mTOR信號，體內(nèi)外均可有效維持HSC ；內(nèi)皮細(xì)胞來源的Notch受體能促進(jìn)LT-HSC的增殖；Niche來源的Hedgehog信號參與維持HSC，腺苷脫氨酶信號則可以對抗Hedgehog對HSC的調(diào)控作用。目前認(rèn)為Niche主要有血管龕和骨龕兩種經(jīng)典的結(jié)構(gòu)。血竇內(nèi)皮龕除了定位于骨髓以外，還存在于肝臟、脾臟等具有血竇結(jié)構(gòu)的器官內(nèi)；骨龕僅位于骨髓。骨龕通過其構(gòu)成細(xì)胞產(chǎn)生的各種造血相關(guān)細(xì)胞因子或者信號分子對HSC的增生分化、發(fā)育、成熟、迀移、定居、釋放、凋亡等活動產(chǎn)生直接影響作用，從而實現(xiàn)對HSC生物學(xué)行為的調(diào)控。
[0016]作為Niche的重要組成部分，骨相關(guān)MSC不僅對HSC生理功能的調(diào)控過程起到了重要作用，而且對各系細(xì)胞，尤其是免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、DC細(xì)胞等的分化發(fā)育都起到了調(diào)節(jié)作用。但是骨相關(guān)MSC是多種類型細(xì)胞組成的混合群細(xì)胞，其功能與MSC的來源、分離純化技術(shù)、分選標(biāo)記都有密切關(guān)系。
[0017]腫瘤相關(guān)性貧血(cancer related anemia, CRA)是惡性腫瘤常見的并發(fā)癥之一，能顯著影響臨床治療效果和腫瘤患者生存期。CRA發(fā)生的本質(zhì)是實體腫瘤發(fā)生時，紅系細(xì)胞發(fā)育分化的過程異常，導(dǎo)致患者外周血中單位容積內(nèi)紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白濃度或紅細(xì)胞壓積異常，即臨床癥狀為貧血。目前臨床上CRA的治療方案主要是采用對癥治療、輸血治療、重組EPO以及鐵劑補(bǔ)充等方法。這些治療方法能暫時改善患者貧血的臨床癥狀，但是并不能完全從根本上治療CRA。同時這些治療方法本身還存在一定局限性與副作用。因此如果能夠從根本上，即從影響紅系細(xì)胞的生成發(fā)育過程的因素對CRA進(jìn)行治療，可能會大大提高CRA的治療效果。造血微環(huán)境是調(diào)控紅系生成發(fā)育的重要因素之一，而骨相關(guān)MSC作為其重要組成部分，也參與了紅系生成發(fā)育得調(diào)控。因此以其作為CRA治療的靶向目標(biāo)，不僅能從根本上對CRA起到治療作用，同時還會減低CRA的復(fù)發(fā)率，最終提高腫瘤患者的生存治療。
[0018]造血干細(xì)胞移植是治療血液惡性疾病的有效途徑，然而并發(fā)癥移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)的發(fā)生成為阻礙造血干細(xì)胞移植成功的主要原因。接受異體移植物的受體發(fā)生急性移植物抗宿主病(acute graft versus hostdisease, aGVHD)的概率是50%，其中不到20%的人移植后能存活超過5年，尤其是抗固醇類aGVHD能導(dǎo)致90 %的致死率。目前，臨床上采用多種細(xì)胞治療方法預(yù)防或治療GVHD，其中包括不同來源的MSCs。但是目前誘導(dǎo)移植免疫耐受時多使用MSCs混合群，而MSCs亞群眾多，功能差異較大，為了使MSCs在臨床上得到更好的應(yīng)用，需要探索MSCs各細(xì)胞亞群在免疫耐受誘導(dǎo)中的作用以及機(jī)制。
[0019]發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，將從小鼠脛骨、股骨上得到的骨相關(guān)MSC利用發(fā)明人獨創(chuàng)的分選標(biāo)記對其進(jìn)行分選鑒定，獲得了較高純度的Scal+亞群細(xì)胞。
[0020]發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)，上述獲得的Scal+亞群細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)并增殖；并且參與支持造血重建。
[0021]發(fā)明人利用分選得到的Scal+亞群細(xì)胞對CRA模型小鼠進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)治療后的模型小鼠外周血貧血癥狀被糾正，同時改善了骨髓中紅系前體細(xì)胞發(fā)育異常的情況；且治療效果比混合群細(xì)胞明顯。
[0022]發(fā)明人利用分選得到Scal+亞群細(xì)胞對aGVHD小鼠模型進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)治療后的模型小鼠aGVHD臨床癥狀有所改善，生存時間延長；且治療效果比混合群細(xì)胞明顯。
[0023]實施例1.骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞制備
[0024]1、取小鼠股骨和腔骨，去除所有肌肉組織，PBS沖洗骨頭后，放于研磨杯內(nèi)研磨至骨髓釋放，分離收集骨髓待用。加入PBS沖洗骨頭，再次研磨和沖洗，直到骨頭全部變成白色;
[0025]2、用吸水紙吸干殘余PBS，加入0.5 %膠原酶(3mg/mL, Sigma, Ronkonkoma, NY, USA)混勾后，搖床上 37°C消化 Ih ；
[0026]3、取60 μ m孔徑濾網(wǎng)，過濾消化后骨混合物，收集慮過液，1500rpm離心5min后棄上清;
[0027]4、向上述細(xì)胞沉積中加入適量紅細(xì)胞裂解液，室溫靜止2min，加入過量的PBS后，1500rpm離心5min，棄上清，獲得細(xì)胞沉積即為骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0028]實施例2.骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞亞群細(xì)胞制備
[0029]1、骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群的制備
[0030]1.1將得到骨相關(guān)MSC細(xì)胞轉(zhuǎn)入5mL試管中并計數(shù)，然后按照磁珠分選試劑盒(easysep mouse select1n kit, Stem Cell Ltd.Vancouver, Canada)要求加入適量的分選緩沖液以及標(biāo)記緩沖液、磁珠。按照磁珠分選試劑盒操作要求進(jìn)行細(xì)胞分選。
[0031]1.2將分選得到的細(xì)胞計數(shù)，取適量細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管中，1500rpm離心5min后棄上清。
[0032]1.3 在 20 μ I 流式緩沖液中加入抗-CD45(30-F11, B1legend, California, USA)，抗-Terll9(17-5921，eB1science, San Diego, USA)，抗-Seal (E13-161.7, B1legend, California, USA)流式抗體，混勾。
[0033]1.4將上述預(yù)混的流式抗體加入到所得的細(xì)胞沉積中，2-8°C染色20min，流式緩沖液重懸后1500rpm離心5min，細(xì)胞重懸于300 μ I流式緩沖液，流式儀上機(jī)分選骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞Scal+亞群，結(jié)果如圖1所示。
[0034]2、骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞⑶271+亞群細(xì)胞的制備
[0035]2.1將得到骨相關(guān)MSC細(xì)胞轉(zhuǎn)入5mL試管中并計數(shù)，然后按照磁珠分選試劑盒要求加入適量的分選緩沖液以及標(biāo)記緩沖液、磁珠。按照磁珠分選試劑盒操作要求進(jìn)行細(xì)胞分選。
[0036]2.2將分選得到的細(xì)胞計數(shù)，取適量細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管中，1500rpm離心5min后棄上清。
[0037]2.3在20 μ I流式緩沖液中加入抗-⑶45，抗-Terl 19，抗-⑶271流式抗體，混勻。
[0038]2.4將上述預(yù)混的流式抗體加入到所得的細(xì)胞沉積中，2-8°C染色20min，流式緩沖液重懸后1500rpm離心5min，細(xì)胞重懸于300 μ I流式緩沖液，流式儀上機(jī)分選⑶271+亞群細(xì)胞。
[0039]3、骨相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞SSEA4+亞群細(xì)胞的制備
[0040]3.1將得到骨相關(guān)MSC細(xì)胞轉(zhuǎn)入5mL試管中并計數(shù)，然后按照磁珠分選試劑盒要求加入適量的分選緩沖液以及標(biāo)記緩沖液、磁珠。按照磁珠分選試劑盒操作要求進(jìn)行細(xì)胞分選。
[0041]3.2將分選得到的細(xì)胞計數(shù)，取適量細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管中，1500rpm離心5min后棄上清。
[0042]3.3在20 μ I流式緩沖液中加入抗-CD45，抗-Terl 19，抗-SSEA4流式抗體，混勻。
[0043]3.4將