專利名稱：抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體zub4及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells，間充質(zhì)干細胞)是近年來成體干細胞研究領(lǐng)域的一個熱點，其可以從骨髓、臍帶血、脂肪組織、滑膜、骨骼肌、肺、乳牙中分離獲得，具有分裂、增殖、分化成多種細胞的潛能，在一定的體內(nèi)或體外誘導(dǎo)條件下可以分化為各個胚層的細胞，如脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肌腱細胞、肌肉細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞、上皮細胞等；間充質(zhì)干細胞免疫原性弱，不表達MHC-II類分子和T細胞共刺激分子，并具有免疫調(diào)節(jié)活性，這使異基因間充質(zhì)干細胞的應(yīng)用成為可能；通過基因修飾方法，可使間充質(zhì)干細胞定向地表達某些特異的分子而作為細胞介導(dǎo)的基因治療的理想載體。間充質(zhì)干細胞是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的種子細胞，在臨床應(yīng)用中有廣闊的前景。目前美國和歐洲多個研究中心已開展自體和異基因間充質(zhì)干細胞治療多種疾病的I、II期臨床試驗，主要應(yīng)用于心肌梗死、成骨不全、大塊的骨缺損、軟骨缺損、肌腱損傷、韌帶損傷的修復(fù)和重建，并對異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(Metachromatic Leukodystrophy，MLD)、赫爾利綜合征(HurlerSyndrome，MPSIH)、重型再生障礙性貧血、移植物抗宿主病等疾病的治療有一定的臨床療效；國內(nèi)亦著手開展間充質(zhì)干細胞治療重大疾病的I期臨床研究。
骨髓間充質(zhì)干細胞是由Friedenstein在20世紀60年代首次證實，是在骨髓中的一種非造血系統(tǒng)的干細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞在骨髓中以低密度存在，約104～105個單個核細胞中含有一個間充質(zhì)干細胞，但其在體外培養(yǎng)可以倍增50次而不改變其表型特征和分化潛能。迄今為止間充質(zhì)干細胞沒有特異性的表面標記，其不表達CD34、CD45、CD14、血型糖蛋白A及T或B淋巴細胞的表面標志，認為相對特異性表面抗原有SH2、SH3、SH4、STRO-1、CD166等。目前各個實驗室主要還是通過密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)方法和免疫分選法陽性或陰性篩選獲得間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)傳代的間充質(zhì)干細胞是一群相對均一的細胞，但是不同的分離培養(yǎng)條件導(dǎo)致獲得的間充質(zhì)干細胞可能來源于不同的亞群，其生物學(xué)特性可能存在一定的差異。研究者正努力尋求間充質(zhì)干細胞的特異性標記，以進一步認識其生物學(xué)特性。
20世紀90年代起研究者通過雜交瘤技術(shù)，研制開發(fā)了多種人間充質(zhì)干細胞相關(guān)的單克隆抗體1991年P(guān)aul J.Simmons等以骨髓CD34+細胞免疫小鼠獲得了人骨髓基質(zhì)細胞新的單克隆抗體STRO-1；1992年Haynesworth SE等研制了3個間充質(zhì)干細胞的單克隆抗體SH2、SH3、SH4，之后進一步研究證實SH2的抗原表位位于CD105上，SH3、SH4的抗原表位位于CD73上；1997年J.C.Joyner等研制的單克隆抗體HOP-26，針對間充質(zhì)干細胞成骨分化的前體細胞有特異性，研究證實其抗原表位為CD63上的肽段；1997年S.P.Eruder等將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化的成骨細胞免疫小鼠獲得單克隆抗體SB-10，與間充質(zhì)干細胞成骨分化相關(guān)，SB-10的抗原表位位于CD166上；2005年Hyun-Jung Hoo等報道采用骨髓間充質(zhì)干細胞及細胞膜蛋白提取物免疫小鼠，獲得單克隆抗體YS08、YS14、YS18。間充質(zhì)干細胞及其相關(guān)細胞的單克隆抗體的研究豐富了對間充質(zhì)干細胞表面分子及其分化抗原的認識，但目前對間充質(zhì)干細胞表型仍缺乏全面的認識，尚未發(fā)現(xiàn)其單一的特異性標記，因此進一步認識間充質(zhì)干細胞的特異性標記及生物學(xué)特性，將推進間充質(zhì)干細胞的研究和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體，該單克隆抗體亞型為IgG1、κ型，命名ZUB4，能與人骨髓間充質(zhì)干細胞表面分子特異性結(jié)合，用ZUB4通過免疫印跡法檢測提取的人骨髓間充質(zhì)干細胞蛋白，可獲得單一的特異性陽性條帶。該單克隆抗體與人外周血淋巴細胞、人血液系統(tǒng)細胞株及其他組織細胞株、人間充質(zhì)組織及非間充質(zhì)組織、大鼠間充質(zhì)干細胞、其他動物骨髓細胞無交叉反應(yīng)。
本發(fā)明的第二個目的是提供抗骨髓人間充質(zhì)干細胞單克隆抗體的制備方法，通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)(1)免疫原的準備以多供體來源的傳代培養(yǎng)、低溫凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的第三～第五代的人骨髓間充質(zhì)干細胞作為動物免疫的抗原。人骨髓間充質(zhì)干細胞采用Ficoll-paque密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)獲得，目前公認的人間充質(zhì)干細胞表面分子CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽性標記出現(xiàn)單峰，造血細胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達陰性，是一高度均質(zhì)細胞群；可以多次傳代，擴增至第8代細胞數(shù)可達(2～3)×1010左右；通過體外定向誘導(dǎo)可分化為間充質(zhì)來源的的成骨細胞和脂肪細胞，也能分化為其他胚層來源的細胞(如神經(jīng)元樣細胞)；所用的凍存方法在復(fù)蘇后人骨髓間充質(zhì)干細胞存活率高，不影響細胞的生長特性、免疫表型、及增殖和多向分化潛能。
(2)動物免疫選取2～3份供體來源的混合的人骨髓間充質(zhì)干細胞，免疫BALB/c小鼠，以期產(chǎn)生針對間充質(zhì)干細胞共同識別位點的特異性單克隆抗體。每只小鼠以1.0×106細胞腹腔注射，每周1次，共3次；第4周加強免疫一次，3天后待融合。
(3)雜交瘤細胞系的建立取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)以PEG介導(dǎo)融合。融合后細胞經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)，以間接免疫熒光法篩選陽性克隆。用有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)，直到克隆化細胞抗體陽性率為100％。將雜交瘤細胞經(jīng)體外連續(xù)傳代3個月以上和反復(fù)凍存、復(fù)蘇，直到細胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。
(4)單克隆抗體的制備與純化將建系的雜交瘤細胞注射到經(jīng)石蠟油預(yù)處理的小鼠腹腔，誘生腹水。誘生的腹水用鹽析法和離子交換法獲得純化的單克隆抗體。
本發(fā)明的第三目的是提供產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞，它是由免疫的BALB/c小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細胞經(jīng)融合、篩選、克隆、傳代和反復(fù)凍存、復(fù)蘇后獲得的小鼠雜交瘤細胞系ZUB4，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體ZUB4，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC No.C200511，保藏日期為2005年8月30日。
本發(fā)明的第四個目的是建立應(yīng)用該單克隆抗體，通過流式細胞術(shù)、免疫組化、免疫熒光染色、免疫印跡等技術(shù)檢測間充質(zhì)干細胞的方法。
以抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4為探針，通過流式細胞術(shù)可以檢測培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞及骨髓細胞懸液中的間充質(zhì)干細胞，并進行定量分析。
用抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞、骨髓組織切片和其他組織切片中的間充質(zhì)干細胞相應(yīng)抗原的表達，并對間充質(zhì)干細胞的分布進行定位分析。
用抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4，結(jié)合熒光二抗，用免疫熒光染色法標記培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞、全骨髓細胞、其他細胞及組織冰凍切片的相應(yīng)蛋白分子，對間充質(zhì)干細胞的相應(yīng)蛋白分子的表達進行定位和定量分析，并可檢測間充質(zhì)干細胞在組織中的分布。
用抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4，采用免疫印跡法(Western-blot)檢測單克隆抗體ZUB4的相應(yīng)抗原在培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞及其他相關(guān)細胞中的表達。
本發(fā)明應(yīng)用建立的人骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)、凍存體系，采用多供者來源骨髓間充質(zhì)干細胞為抗原免疫BALB/c小鼠，成功了制備一種新的抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體，可用于間充質(zhì)干細胞的鑒定，為研究間充質(zhì)干細胞的特異性標記提供了有效的工具，同時也為進一步闡明間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性提供了平臺，并可推廣應(yīng)用于多種檢測技術(shù)以及臨床研究。


圖1為用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法獲取的人骨髓間充質(zhì)干細胞。A為培養(yǎng)的原代人骨髓間充質(zhì)干細胞，B為凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的人骨髓間充干細胞。
圖2為培養(yǎng)擴增第一代和第四代人骨髓間充質(zhì)干細胞的生長曲線。
圖3低溫凍存前后第四代人骨髓間充質(zhì)干細胞的生長曲線。
圖4培養(yǎng)的第四代人骨髓間充質(zhì)干細胞分別用CD14-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC、CD34-PE、CD29-PE、CD166-PE、CD105-PE標記，圖為流式細胞術(shù)分析圖。
圖5人骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨定向誘導(dǎo)分化。A為誘導(dǎo)分化的成骨細胞，B為誘導(dǎo)成骨分化后Von Kossa法染色。
圖6人骨髓間充質(zhì)干細胞向脂肪定向誘導(dǎo)分化。A為誘導(dǎo)分化的脂肪細胞，B為誘導(dǎo)脂肪分化后油紅O染色。
圖7人骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞定向誘導(dǎo)分化。A為誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細胞，B、C、D、E分別為誘導(dǎo)神經(jīng)分化后用免疫組織化學(xué)染色法檢測神經(jīng)干細胞標志物Nestin、神經(jīng)元標志物NSE、神經(jīng)元標志物NF-M、星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的表達。
圖8以單克隆抗體ZUB4，通過間接免疫熒光染色法檢測人骨髓間充質(zhì)干細胞。
圖9用免疫組織化學(xué)染色法檢測抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4的相應(yīng)抗原在骨髓組織中的表達。
圖10以單克隆抗體ZUB4，通過流式細胞術(shù)檢測人骨髓間充質(zhì)干細胞。A為陰性對照，B為以ZUB4為探針的流式細胞術(shù)分析結(jié)果。
圖11以單克隆抗體ZUB4，通過免疫組織化學(xué)染色法檢測人骨髓間充質(zhì)干細胞。A為人骨髓間充質(zhì)干細胞爬片，B為人骨髓間充質(zhì)干細胞團塊。
圖12以單克隆抗體ZUB4，通過免疫印跡法檢測人骨髓間充質(zhì)干細胞中相應(yīng)抗原的表達。
具體實施例方式
實施例1人骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)、鑒定、凍存及復(fù)蘇(1)人骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)無菌條件下采集六份健康供者的骨髓，肝素抗凝，用Ficoll-paque(比重1.077)密度梯度離心收集單個核細胞，以4×105個細胞/cm2密度接種，用含10％(V/V)胎牛血清的低糖DMEM(LG-DMED)培養(yǎng)液，置于37℃、體積分數(shù)為5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后更換培養(yǎng)液，棄去非貼壁細胞可見有梭形貼壁細胞，之后每3d換液1次，15～20d原代培養(yǎng)細胞貼壁融合達80％～90％，排列有明顯方向性，成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀，與成纖維細胞形態(tài)相似(參見圖1)，用0.25％胰蛋白酶-1mmol EDTA消化，按1∶3比例分瓶傳代培養(yǎng)，并標記為P1細胞。傳代培養(yǎng)過程中每3d換液一次，細胞達90％融合后消化傳代，并標記為P2，以此類推。
(2)人骨髓間充質(zhì)干細胞生長特性的鑒定取培養(yǎng)傳代的人骨髓間充質(zhì)干細胞第一、第四代細胞，按2×104個細胞/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8天，進行細胞動力學(xué)分析。培養(yǎng)具有以下共性特征細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，12h細胞完全貼壁，細胞形態(tài)重新變成梭形細胞，傳代培養(yǎng)潛伏期約為24～36h；傳代培養(yǎng)對數(shù)增殖期約為4～5d；對數(shù)增殖期結(jié)束后進入平臺期；第四代與第一代細胞的生長沒有顯著差異(參見圖2)。
(3)人骨髓間充質(zhì)干細胞表型的鑒定取培養(yǎng)傳代的第一、三、五代細胞，以CD14-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC、CD34-PE、CD29-PE、CD166-PE、CD105-PE單克隆抗體為探針，用流式細胞術(shù)分析間充質(zhì)干細胞表面分子的表達。結(jié)果顯示CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽性標記出現(xiàn)單峰，造血細胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達陰性(參見圖4)。經(jīng)傳代擴增后的各代間充質(zhì)干細胞表面標記表達無明顯差異(參見表1)，表明培養(yǎng)擴增的人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞是一均質(zhì)細胞群。
表1 成人骨髓間充質(zhì)干細胞免疫表型(％，x±s)(n＝6)

(4)人骨髓間充質(zhì)干細胞多分化潛能的鑒定培養(yǎng)傳代細胞的接近70％融合時，更換培養(yǎng)液，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(LG-DMEM，10％胎牛血清、10-8M地塞米松、10mM β-磷酸甘油、0.25mM抗壞血酸)、脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液、神經(jīng)分化預(yù)誘導(dǎo)液(LG-DMEM，20％胎牛血清、1mM硫代甘油)。
經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4d，大約30％細胞形態(tài)發(fā)生變化，由原來的紡錘型變?yōu)榱⒎叫突蚨嘟切停?d后出現(xiàn)鈣化斑點，隨著誘導(dǎo)時間的延長，立方型或多角型細胞以及鈣化斑明顯增加，約14～21d細胞形成廣泛均一的礦化結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)21d后，Von Kossa法染色，可以見到染成棕黑色的細胞外基質(zhì)鈣鹽沉積(參見圖5)，對照組無礦化結(jié)節(jié)形成能力。
經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后，細胞形態(tài)開始變成圓形或多角性，細胞排列無序，可觀察到胞漿中出現(xiàn)高折光性的小脂滴，隨著誘導(dǎo)時間的延長逐漸聚集成大的脂滴。培養(yǎng)21d后，油紅O染色，脂滴為橙紅色，約80％以上間充質(zhì)干細胞均誘導(dǎo)為脂肪細胞(參見圖6)。
經(jīng)神經(jīng)分化預(yù)誘導(dǎo)24后細胞形態(tài)未見明顯變化，更換含5mM硫代甘油的無血清LG-DMEM，在誘導(dǎo)后3-5h中，大多數(shù)間充質(zhì)干細胞變?yōu)榈湫偷纳窠?jīng)元樣細胞，簡單的雙級細胞和復(fù)雜的多級細胞均有出現(xiàn)，多個神經(jīng)元樣細胞突起可相互延伸并形成網(wǎng)狀(參見圖7)。免疫組化染色分析，神經(jīng)元樣細胞的胞體及部分突起神經(jīng)干細胞標志物Nestin、神經(jīng)元標志物NSE、神經(jīng)元標志物NF-M表達陽性、星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP表達陰性(參見圖7)。
(5)人骨髓間充質(zhì)干細胞的凍存和復(fù)蘇將培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞消化后，用凍存保護液(LG-DMEM、5％DMSO、30％胎牛血清)重懸細胞，細胞終濃度為1×106/ml，用程控凍存方法凍存，計算機設(shè)定降溫程序以-1℃/min速率從4℃降至0℃，平衡5min，以-1℃/min速率降至-30℃，然后以-5℃/min速率降至-80℃，快速移入-196℃液氮罐保存。從液氮中取出細胞放入40℃的恒溫水浴箱快速解凍，在1min內(nèi)解凍完畢，細胞復(fù)蘇后經(jīng)臺盼藍染色細胞計數(shù)，臺盼藍拒染回收率87.67±2.52％，復(fù)蘇細胞接種后12h細胞完全貼壁，細胞形態(tài)重新變成梭形細胞。細胞經(jīng)過2-3d休眠期后開始迅速增殖，約7～10d細胞可達80％～90％融合，細胞排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀，與凍存前細胞形態(tài)基本一致(參見圖1)。比較凍存前后的第四代細胞，細胞的生長特性(用MTT法測細胞生長曲線，參見圖3)、免疫表型(參見表2)、及誘導(dǎo)分化潛能(成骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)元樣細胞)均未發(fā)生變化。
表2 第四代人骨髓間充質(zhì)干細胞凍存前后細胞免疫表型(％，x±s)(n＝6)

實施例2抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4的制備和純化(1)動物免疫取雌性6～8周齡的BALB/c小鼠，首次免疫用2份供者來源混合的第三～五代間充質(zhì)干細胞懸于PBS，約1.0×106/只注入小鼠腹腔。第8d、15d繼續(xù)免疫，免疫方法同第一次。第20天，把經(jīng)三次免疫后小鼠眼球采血，離心分離血清，血清與培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細胞共同孵育以間接免疫熒光染色法檢測血清抗體效價，選擇效價高的小鼠準備融合。融合前3天加強免疫一次，細胞數(shù)為2.0×106/只。
(2)雜交瘤細胞系的制備完成免疫過程的小鼠準備取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)融合，在融合前一天制備飼養(yǎng)細胞。融合時無菌下取小鼠脾細胞，與SP2/0細胞以101混合，以50％PEG介導(dǎo)融合，離心后重懸于HAT選擇性培養(yǎng)基中，接種于含有飼養(yǎng)細胞的96板中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，融合后第3d、5d、7d用HAT培養(yǎng)液半量換液，兩周后換用HT培養(yǎng)液。
觀察雜交瘤細胞的生長情況，等克隆長至孔底面積的1/3～1/2，取培養(yǎng)上清液與間充質(zhì)干細胞孵育，用Ig(G+M)-FITC熒光二抗以間接免疫熒光染色法進行抗體檢測，篩選陽性克隆。以有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)，直到克隆化細胞抗體陽性率為100％，此時可將陽性克隆細胞進一步擴大培養(yǎng)。將雜交瘤細胞經(jīng)體外連續(xù)傳代3個月以上和反復(fù)凍存、復(fù)蘇，定期收集上清，用篩選抗體的方法測定上清中的抗體，直到細胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。
(3)單克隆抗體的制備和純化選用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液體石蠟，1～2周后收集生長狀態(tài)良好的單克隆雜交瘤細胞，每只小鼠腹腔注射0.5～1.0×105細胞懸液。接種細胞14天左右的小鼠腹部可見明顯膨大，以頸椎脫臼法處死后打開腹腔，取出腹水。離心后吸取上清，分裝，-20℃保存。取10ml腹水抗體，加入10ml生理鹽水稀釋，用鹽析法以50％的硫酸銨粗提免疫球蛋白，之后用DEAE-纖維素離子交換柱純化。
(4)抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4腹水效價及亞型鑒定取小鼠腹水抗體，倍比稀釋后與免疫的間充質(zhì)干細胞孵育后，用間接免疫熒光染色法檢測(方法同抗體篩選)，抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體效價為1106。抗體亞型測定取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，采用金免疫層析法檢測，屬IgG1型(輕鏈為κ型)。
實施例3單克隆抗體ZUB4的特異性的鑒定(1)單克隆抗體ZUB4在人血液系統(tǒng)細胞、及人類細胞株中特異性的鑒定細胞材料培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細胞、外周血細胞、Ficoll-paque(比重1.077)分離的人外周血單個核細胞、全骨髓細胞、Ficoll-paque(比重1.077)分離的骨髓單個核細胞、HL-60(急性原髓細胞性白血病細胞株)、NB4(急性早幼粒白血病細胞株)、K562(慢性粒細胞性白血病急變期細胞株)、U-937(組織細胞淋巴瘤向單核巨噬細胞分化細胞株)、HEL(急性紅白血病細胞株)、Jurkat(急性T淋巴細胞性白血病細胞株)、Raji(Burkitt淋巴瘤細胞株，B淋巴細胞)、KM3(多發(fā)性骨髓瘤細胞株)。采用活細胞間接免疫熒光染色法檢測間充質(zhì)干細胞膜抗原的表達，以人骨髓間充質(zhì)干細胞為陽性對照(參見圖8)，全骨髓細胞及骨髓單個核細胞中可見散在的陽性細胞，其余細胞均為陰性。單克隆抗體ZUB4與骨髓間充質(zhì)干細胞的特異性結(jié)合可用于區(qū)分骨髓中的間充質(zhì)干細胞與造血細胞，用于骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定。
(2)單克隆抗體ZUB4在人間充質(zhì)組織及非間充質(zhì)組織中特異性的鑒定組織材料肌腱、韌帶、肌肉、血管壁、神經(jīng)、膽囊、皮膚、肺、肝、小腸、脂肪、骨髓，以上組織標本均來自外科手術(shù)標本。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測，以人骨髓間充質(zhì)干細胞細胞團塊的石蠟切片為陽性對照，骨髓組織中可見散在的陽性細胞(參見圖9)，其余組織均為陰性。
(3)單克隆抗體ZUB4在大鼠、小鼠、犬、兔、雞骨髓細胞及大鼠間充質(zhì)干細胞中特異性的鑒定細胞材料大鼠、小鼠、犬、兔、雞全骨髓細胞及培養(yǎng)的大鼠間充質(zhì)干細胞。采用間接免疫熒光染色法檢測，以人骨髓間充質(zhì)干細胞為陽性對照，結(jié)果顯示大鼠、小鼠、犬、兔、雞全骨髓細胞及培養(yǎng)的大鼠間充質(zhì)干細胞均為陰性，由此說明單克隆抗體ZUB4對人間充質(zhì)干細胞有特異性。
實施例4單克隆抗體ZUB4在流式細胞術(shù)檢測間充質(zhì)干細胞中的應(yīng)用取體外培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細胞，以單克隆抗體ZUB4為探針，用間接流式細胞術(shù)分析間充質(zhì)干細胞表面分子的表達。結(jié)果顯示明顯的陽性單峰(參見圖10)，間充質(zhì)干細胞表面分子表達為88.07％，傳代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞上ZUB4相應(yīng)抗原表達無顯著性差異。上述結(jié)果顯示單克隆抗體ZUB4與間充質(zhì)干細胞表面分子有較高的特異性結(jié)合，可用于間充質(zhì)干細胞的檢測和鑒定，并可定量檢測間充質(zhì)干細胞的數(shù)量。以單克隆抗體ZUB4為探針用流式細胞術(shù)檢測骨髓細胞中間充質(zhì)干細胞的數(shù)量，可用于研究骨髓中新鮮間充質(zhì)干細胞的特性及臨床診斷。
實施例5單克隆抗體ZUB4在免疫組織化學(xué)染色法檢測間充質(zhì)干細胞中的應(yīng)用將體外培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細胞爬片固定，用單克隆抗體ZUB4通過免疫組織化學(xué)染色法檢測間充質(zhì)干細胞相應(yīng)抗原的表達，結(jié)果顯示大于95％的細胞呈陽性(參見圖11)。同樣用ZUB4通過免疫組織化學(xué)染色法檢測間充質(zhì)干細胞團塊及骨髓組織的石蠟切片中相應(yīng)抗原的表達，結(jié)果顯示細胞團塊中大于95％的細胞呈陽性、骨髓組織中有散在的陽性細胞(參見圖9)。單克隆抗體ZUB4用于免疫組織化學(xué)染色法檢測方法，可以作為一種間充質(zhì)干細胞的標記，對組織中間充質(zhì)干細胞進行定位及定量的分析。
實施例6單克隆抗體ZUB4在免疫熒光染色法檢測間充質(zhì)干細胞中的應(yīng)用以單克隆抗體ZUB4為探針，結(jié)合FITC標記的熒光二抗，采用間接免疫熒光染色法檢測體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞，結(jié)果顯示95％～100％的間充質(zhì)干細胞呈陽性(參見圖8)。單克隆抗體ZUB4可有效的應(yīng)用于免疫熒光染色法，通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等工具可以有效的觀察間充質(zhì)干細胞中的相應(yīng)抗原的表達，進一步研究該抗原在間充質(zhì)干細胞中的生物學(xué)特性。此外還可以用單克隆抗體ZUB4通過間接免疫熒光染色法檢測骨髓細胞及其他組織中的間充質(zhì)干細胞。
實施例7用單克隆抗體ZUB4，通過免疫印跡法檢測相應(yīng)抗原的表達提取體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞總蛋白，用單克隆抗體ZUB4通過常規(guī)蛋白免疫印跡法檢測相應(yīng)抗原的表達，可見一特異性的陽性條帶(參見圖12)。通過免疫印跡的方法可以進一步研究單克隆抗體ZUB4的相應(yīng)抗原在間充質(zhì)干細胞及相關(guān)細胞中的表達，及該抗原的生物學(xué)特性。
權(quán)利要求
1.抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4，該單克隆抗體亞型為IgG1、к型，能與人骨髓間充質(zhì)干細胞表面分子特異性結(jié)合，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細胞是由免疫的BALB/c小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細胞經(jīng)融合、篩選、克隆、傳代和反復(fù)凍存、復(fù)蘇后獲得的小鼠雜交瘤細胞系ZUB4，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體ZUB4，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNo.C200511，保藏日期為2005年8月30日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4的制備方法，其特征是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)(1)免疫原的準備以多供體來源的傳代培養(yǎng)、低溫凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的第三～第五代的人骨髓間充質(zhì)干細胞作為動物免疫的抗原。人骨髓間充質(zhì)干細胞采用Ficoll-paque密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)獲得，目前公認的人間充質(zhì)干細胞表面分子CD29、CD44、CD166、CD105陽性標記出現(xiàn)單峰，造血細胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達陰性，是一高度均質(zhì)細胞群；可以多次傳代，擴增至第八代細胞數(shù)可達2～3×1010左右；通過體外定向誘導(dǎo)可分化為間充質(zhì)來源的的成骨細胞和脂肪細胞，也能分化為其他胚層來源的細胞；所用的凍存方法在復(fù)蘇后人骨髓間充質(zhì)干細胞存活率高，不影響細胞的生長特性、免疫表型、及增殖和多向分化潛能。(2)動物免疫選取2～3份供體來源的混合的人骨髓間充質(zhì)干細胞，免疫BALB/c小鼠，以期產(chǎn)生針對間充質(zhì)干細胞共同識別位點的特異性單克隆抗體。每只小鼠以1.0×106細胞腹腔注射，每周1次，共3次；第4周加強免疫一次，3天后待融合。(3)雜交瘤細胞系的建立取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞以PEG介導(dǎo)融合。融合后細胞經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)，以間接免疫熒光法篩選陽性克隆。用有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)，直到克隆化細胞抗體陽性率為100％。將雜交瘤細胞經(jīng)體外連續(xù)傳代3個月以上和反復(fù)凍存、復(fù)蘇，直到細胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。(4)單克隆抗體的制備與純化將建系的雜交瘤細胞注射到經(jīng)石蠟油預(yù)處理的小鼠腹腔，誘生腹水。誘生的腹水用鹽析法和離子交換法獲得純化的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4，在檢測人間充質(zhì)干細胞中應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4的應(yīng)用，其特征是以該單克隆抗體為探針，通過流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞及骨髓細胞懸液中的間充質(zhì)干細胞，并進行定量分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4的應(yīng)用，其特征是采用免疫組織化學(xué)染色法檢測培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞、骨髓組織切片和其他組織切片中的間充質(zhì)干細胞相應(yīng)抗原的表達，并對間充質(zhì)干細胞的分布進行定位分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4的應(yīng)用，其特征是結(jié)合熒光二抗，用免疫熒光染色法標記培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞、全骨髓細胞、其他細胞及組織冰凍切片的相應(yīng)抗原，對間充質(zhì)干細胞的相應(yīng)抗原的表達進行定位和定量分析，并可檢測間充質(zhì)干細胞在組織中的分布。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4的應(yīng)用，其特征是采用免疫印跡法檢測單克隆抗體ZUB4的相應(yīng)抗原在培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞及其他相關(guān)細胞中的表達。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗人骨髓間充質(zhì)干細胞單克隆抗體ZUB4。以人骨髓間充質(zhì)干細胞為抗原，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了抗人間充質(zhì)干細胞的單克隆抗體，并建立了以該單克隆抗體為探針通過流式細胞術(shù)、免疫組化、免疫熒光染色、免疫印跡檢測間充質(zhì)干細胞的方法。本發(fā)明為研究間充質(zhì)干細胞的特異性標記提供了有效的工具，同時也為進一步闡明間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性提供了平臺，并可推廣應(yīng)用于多種檢測技術(shù)以及臨床研究。
文檔編號G01N33/577GK1821273SQ20051006103
公開日2006年8月23日 申請日期2005年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月10日
發(fā)明者黃河, 沈建根, 來曉瑜, 羅依 申請人:浙江大學(xué)