被導(dǎo)靶的干擾素顯示強(qiáng)的細(xì)胞凋亡和抗腫瘤活性的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了表現(xiàn)出明顯抗癌效力的新的嵌合部分。某些實(shí)施方案中，所述嵌合部分包含附著于干擾素的導(dǎo)靶部分。某些實(shí)施方案中，所述嵌合部分包含融合蛋白，其中特異結(jié)合癌癥標(biāo)記物的抗體與干擾素α(IFN-α)融合在一起。
【專利說明】被導(dǎo)靶的干擾素顯示強(qiáng)的細(xì)胞凋亡和抗腫瘤活性
[0001]本申請是申請日為2008年9月19日，申請?zhí)枮?00880117225.8 (國際申請?zhí)枮镻CT/US2008/077074)，名稱為“被導(dǎo)靶的干擾素顯示強(qiáng)的細(xì)胞凋亡和抗腫瘤活性”的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]相關(guān)申請的交叉引用
[0003]本申請要求2007年9月21日提交的USSN60/994，717的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，所述申請通過引用全文并入本文。
[0004]關(guān)于政府支持的聲明
[0005]本發(fā)明是在國立衛(wèi)生學(xué)院提供的政府資助N0.CA87990的支持下完成的。政府對本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
發(fā)明領(lǐng)域
[0006]本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域。發(fā)明提供了具有顯著抗癌活性的嵌合構(gòu)建體。
[0007]發(fā)明背景
[0008]盡管可以檢測到抗腫瘤相關(guān)抗原的自發(fā)免疫反應(yīng)(TAAs) (Hrouda et al.(1999)Semin.0ncol.26:45 5-471) (Disis et al.(1997) J.Clin.0ncol.15:3363-3367)，但導(dǎo)致疾病的惡性細(xì)胞不能引發(fā)免疫反應(yīng)，從而進(jìn)行排異。許多研究已表明有可能通過向腫瘤細(xì)胞中引入諸如細(xì)胞因子的免疫刺激分子和協(xié)同刺激分子來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性(Dranoff and Mulligan(1995)Adv.Tmmunol.58:417-454;Hrouda et al.(1999)Semin.0ncol.26:455-471;Hurford et al.(1995)Nat.Genet.10:430-435);但高效的基因轉(zhuǎn)移仍然具有挑戰(zhàn)性。此外，要根除殘存的癌癥細(xì)胞可能需要針對那些無法直接進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的大范圍內(nèi)分散的微轉(zhuǎn)移腫瘤沉積。
[0009]先天性免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)對于提供抗感染性病原菌和腫瘤的保護(hù)作用都是必需的。先天性和獲得性免疫之間的交流通過細(xì)胞和細(xì)胞因子間的相互作用進(jìn)行調(diào)節(jié)。先天免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以直接或間接地激活獲得性免疫反應(yīng)中的細(xì)胞，并且在引發(fā)保護(hù)性抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用(Belardelli andFerrantini (2002) Trends Immunol.23:201-208)。激活先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵是檢測到導(dǎo)致釋放促炎癥細(xì)胞因子(諸如IFN-a、TNF-α和IL_1)的細(xì)菌產(chǎn)物或“危險(xiǎn)”信號。
[0010]IFN-Q是具有強(qiáng)大抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性的促炎癥細(xì)胞因子，并且是樹突狀細(xì)胞(DCs)分化和活性的刺激劑(Santini et al.(2000) J.Exp.Med.191:1777-1788)。I 型IFNs (IFN- α 和 IFN-β)對免疫反應(yīng)有多方面影響(Theofilopoulos et al.(2005)Annu.Rev.1mmunol.23:307-336)。IFN- α 在 Thl 細(xì)胞的分化(Finkelman et al.(1991) J.Exp.Med.174:1179-1188)和應(yīng)答特異抗原時(shí)CD8+T細(xì)胞的長期存活(Tough et al.(1996)Science272:1947-1950)中發(fā)揮作用。
[0011]多項(xiàng)研究顯不IFNs在動物模型(Ferrantini et al.(1994)J.1mmunol.153:4604-4615)以及癌癥患者(14.Gutterman et al.(1980) Ann.1ntern.Med.93:399-406)中也能夠發(fā)揮抗腫瘤效果。除了增強(qiáng)獲得性抗腫瘤免疫反應(yīng)，IFN-α還能夠提高腫瘤抑制基因P53的表達(dá)(Takaoka et al.(2003) Nature424:516-523)、抑制血管發(fā)生(Sidky and Borden(1987)Cancer Res.47:5155-5161)以及在腫瘤細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞凋亡(Rodriguez-ViIlanueva and McDonnell (1995) Int.J.Cancer61:110-11417)。雖然這些性能提示IFN-α應(yīng)當(dāng)是治療癌癥的有效治療劑，其較短的半衰期和系統(tǒng)毒性限制了它的應(yīng)用。
[0012]發(fā)明概述
[0013]在多項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，即將干擾素附著到導(dǎo)靶部分(例如能夠特異和/或優(yōu)先結(jié)合細(xì)胞上的或者與細(xì)胞關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物的分子)上能夠顯著地提高干擾素的治療效果，并且似乎能夠降低其系統(tǒng)毒性。相應(yīng)地，在多項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含附著于導(dǎo)靶部分的干擾素的構(gòu)建體，以及這類構(gòu)建體在某些靶細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)的生長或分化的特異和/或優(yōu)先抑制或者甚至殺傷中的用途。
[0014]相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，提供了這樣的嵌合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含附著于能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的導(dǎo)靶部分的干擾素(例如，干擾素_α、干擾素-β、干擾素-Y等)，當(dāng)所述構(gòu)建體與腫瘤細(xì)胞接觸時(shí)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞被殺死或者其生長或分化被抑制。在某些實(shí)施方案中，提供了這樣的嵌合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含附著于能夠結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)記物或細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物的導(dǎo)靶部分的干擾素，其中導(dǎo)靶部分不是通過(Gly4Ser)3(SEQID Ν0:31)接頭附著于干擾素的。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，干擾素是I型干擾素。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，干擾素是2型干擾素。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，干擾素是干擾素α、干擾素或干擾素-Y。在某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的抗體。在某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分與干擾素化學(xué)偶聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分通過肽接頭與干擾素連接。在某些實(shí)施方案中，所述肽接頭長度低于15、低于14、低于12、低于11、低于10、低于
9、低于8、低于7、低于 6、低于5、低于4、低于3或低于2個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，接頭長度為15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或I個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，接頭不是(Gly4Ser)3(SEQ ID Ν0:31)。在某些實(shí)施方案中，接頭是抗蛋白質(zhì)水解或者基本上抗蛋白質(zhì)水解的接頭。某些實(shí)施方案中，肽接頭是Gly4SeHSEQ ID NO: 32)。在某些實(shí)施方案中，接頭包含表2中的氨基酸序列或者由其組成。某些實(shí)施方案中，構(gòu)建體是重組表達(dá)的融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，抗體特異結(jié)合選自EGFR、HER4、HER3、HER2/neu、MUC-1、G250、間皮素(mesothelin)、gp 100、酪氨酸酶和MAGE的標(biāo)記物。在某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是結(jié)合CD20的抗體。某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是單鏈抗體，所述單鏈抗體包含來自選自抗⑶20(利妥昔單抗(Rituximab))、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan)、托西莫單抗(tositumomab) > AME-133v>OcreIizumab> Ofatumumab>TRU-015> IMMU-106 等的抗體的 CDRs和/或可變區(qū)。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是結(jié)合HER2的抗體。在某些實(shí)施方案中，抗體是C6抗體。在某些實(shí)施方案中，抗體包含VH和VL CDRs或C6MH3-B1的VH和VL。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，抗體是 IgG(例如 IgGU IgG3 等)、IgE、單鏈 Fv(scFv)、FAB、(Fab，)2、(ScFv)2等。某些實(shí)施方案中，抗體是選自 Rituxan、IF5、Bl、lH4、CD19、B4、B43、FVS191、hLL2、LL2、RFB4、M195、HuM195、AT13/5、赫賽汀(HERCEFTTN詠、4D5、HuCC49、HUCC39 Δ CH2B72.3、12C10、IG5、H23、BM-2、BM-7、12H12、MAM-6和HMFG-1的抗體。某些實(shí)施方案中，抗體是能夠結(jié)合EGF受體家族成員的抗體。某些實(shí)施方案中，抗體選自C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.CIO、EGFR.Bll、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D1UHER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8 和 HER4.C7。在某些實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含附著了干擾素的抗HER2IgGl抗體。
[0015]發(fā)明還提供了藥物制劑。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，所述制劑包含的嵌合構(gòu)建體含有附著于導(dǎo)靶部分的干擾素。某些實(shí)施方案中，嵌合構(gòu)建體包含以上(和/或下文)描述的構(gòu)建體(例如抗CD20-干擾素和抗HER2-干擾素等)。在某些實(shí)施方案中，制劑是單位劑量的制劑。在某些實(shí)施方案中，制劑配制成用于非胃腸道給藥。某些實(shí)施方案中，制劑配制成經(jīng)由選自口服、靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、直接腫瘤給藥、吸入、直腸給藥、陰道給藥、透皮給藥以及皮下儲庫式給藥的途徑進(jìn)行給藥。
[0016]多項(xiàng)實(shí)施方案中提供了抑制癌細(xì)胞生長和/或增殖的方法。所述方法一般包括將癌細(xì)胞與本文描述的嵌合構(gòu)建體進(jìn)行接觸。某些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是轉(zhuǎn)移細(xì)胞，和/或細(xì)胞處于實(shí)體瘤中。某些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。某些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是B細(xì)胞淋巴瘤。某些實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞是由選自B細(xì)胞淋巴瘤、肺癌、支氣管癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、食道癌、宮頸癌、黑素瘤、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔癌或喉癌、肝癌、腎癌、膽管癌、小腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、胸腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、脂肪瘤、睪丸癌以及惡性纖維組織細(xì)胞瘤的癌癥產(chǎn)生的細(xì)胞。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，接觸包括將嵌合部分系統(tǒng)地給予哺乳動物。某些實(shí)施方案中，接觸包括將嵌合部分直接給予腫瘤部位。某些實(shí)施方案中，接觸包括靜脈內(nèi)給予嵌合部分。某些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是人或非人哺乳動物中的癌細(xì)胞。
[0017]某些實(shí)施方案中，提供了編碼本文描述的嵌合構(gòu)建體的核酸。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，核酸編碼的融合蛋白包含附著于抗EGFR家族成員抗體、抗HER2抗體、抗C6單鏈抗體或抗CD20單鏈抗體的干擾素。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，核酸所編碼的干擾素是I型干擾素。某些實(shí)施方案中，干擾素是IFN-α或干擾素-β。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，核酸編碼的抗體包含C6MH3-B1的VH和VLCDRs。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，核酸編碼將抗體附著到干擾素上的肽接頭(例如象本文描述的)。某些實(shí)施方案中，核酸編碼抗CD20 (利妥昔單抗)的CDRs和/或可變區(qū)。
[0018]發(fā)明還提供了包含以上描述的編碼嵌合構(gòu)建體的核酸的細(xì)胞。某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞表達(dá)嵌合構(gòu)建體。
[0019]在多項(xiàng)實(shí)施方案中，發(fā)明提供了本文描述的嵌合構(gòu)建體在制備用于抑制癌細(xì)胞生長和/或增殖的藥物中的用途。
[0020]某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和構(gòu)建體特別排除利用了美國專利申請公開2002/0193569A1中公開的抗體的構(gòu)建體。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和構(gòu)建體特別排除引入了抗CD20抗體的構(gòu)建體。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和構(gòu)建體特別排除引入了與任何以下靶分子結(jié)合的抗體的構(gòu)建體:CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、EGF-R、HMl.24、磷脂酰絲氨酸抗原、HER-2、TAG-72和/或MUC-1。某些實(shí)施方案中，本文描述的構(gòu)建體可以用于治療諸如多發(fā)性硬化癥、HCV介導(dǎo)的血管炎等的病變。
[0021]定義
[0022]術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換用于氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然氨基酸的人工化學(xué)類似物的那些氨基酸聚合物，也適用于天然的氨基酸聚合物。術(shù)語還包括將構(gòu)成多肽的氨基酸連接起來的常規(guī)肽接頭的變體。優(yōu)選的“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”是α碳通過肽鍵連接的氨基酸鏈。因此鏈的一端(氨基端)的末端氨基酸帶有游離的氨基，而鏈另一端(羰基端)的末端氨基酸帶有游離羰基。術(shù)語“氨基端”(縮寫為N端)用于本文是指肽氨基末端的氨基酸上的游離α-氨基基團(tuán)或者肽內(nèi)其他位置上的氨基酸的α-氨基基團(tuán)(參與肽鍵時(shí)是亞氨基基團(tuán))。類似地，術(shù)語"羰基端"是指肽的羰基端上的游離羰基基團(tuán)或者肽內(nèi)其他位置上的氨基酸的羰基基團(tuán)。肽還包括基本上任何多聚氨基酸，包括但不限于肽模擬物，比如通過醚鍵而不是酰胺鍵連接的氨基酸。
[0023]“抗體”用于本文是指基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼的一或多個(gè)多肽所構(gòu)成的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Y、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈劃分為K或λ。重鏈劃分為Υ、μ、α、δ或ε，它們又繼而分別定義了免疫球蛋白種類:IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
[0024]典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元已知包含四體。每個(gè)四體由兩對相同的多肽鏈構(gòu)成，每對含有一個(gè)“輕鏈”(約25kD)和一個(gè)“重鏈”(約50-70kD)。每個(gè)鏈的N端界定了主要負(fù)責(zé)抗原識別的有大約100到110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語可變輕鏈和可變重鏈(Vh)分別指輕鏈和重鏈的這些區(qū)域。
[0025]抗體的存在方式包括完整的免疫球蛋白，或者是通過用多種肽酶消化或者重新表達(dá)產(chǎn)生的許多已被很好定性的片段。因此，例如胰蛋白酶消化抗體鉸鏈區(qū)中的二硫鍵產(chǎn)生F(ab)’2，F(xiàn)ab 二聚體，其自身是通過二硫鍵與Vh-ChI連接的輕鏈。可以在溫和條件下還原F(ab)’2，將鉸鏈區(qū)中的二硫鍵打開從而將(Fab’)2 二聚體轉(zhuǎn)化為Fab’單體。Fab’單體基本上就是 Fab,和部分絞鏈區(qū)(參見 Fundamental Immunology, ff.E.Paul, ed., RavenPress, N.Y.(1993)中對其他抗體片段的更詳細(xì)描述)。雖然多種抗體片段是根據(jù)完整抗體的消化來定義的，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這類Fab’片段可以通過化學(xué)或者利用重組DNA方法重新合成。因此，術(shù)語抗體用于本文還包括通過對完整抗體進(jìn)行修飾或者利用重組DNA方法重新合成所產(chǎn)生的抗體片段包括，但不限于Fab’ 2、IgG、IgM、IgA、IgE、scFv、dAb、納米抗體、迷你抗體(unibodies)和二體(diabodies)。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，優(yōu)選的抗體包括,但不限于Fab’ 2、IgG、IgM、IgA、Ig`E和單鏈抗體,更優(yōu)選單鏈Fv(scFv)抗體,其中可變重鏈和可變輕鏈被(直接或經(jīng)由肽接頭)連接在一起形成連續(xù)的多肽。
[0026]某些實(shí)施方案中，用于構(gòu)建本發(fā)明的抗體和片段可以是雙特異性的。雙特異性抗體或片段可以是多種構(gòu)型的。例如，雙特異性抗體可能類似于單個(gè)抗體(或抗體片段)，但具有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，可以通過化學(xué)技術(shù)(Kranzet al.(1981) Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA, 78:5807)、“polydoma”技術(shù)(參見例如 U.S.Pat.N0.4，474，893)或者重組DNA技術(shù)生產(chǎn)雙特異性抗體。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體可以具有對至少兩種不同表位，其中至少一個(gè)是腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合特異性。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，抗體和片段還可以是異源抗體。異源抗體是連接在一起的兩個(gè)或多個(gè)抗體，或者抗體結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab)，每個(gè)抗體或片段具有不同的特異性。
[0027]“抗原結(jié)合位點(diǎn)”或“結(jié)合部位”是指免疫球蛋白分子中參與抗原結(jié)合的部分?？乖Y(jié)合位點(diǎn)是由重鏈(H)和輕鏈(L)的N末端可變區(qū)(V)的氨基酸殘基形成的。重鏈和輕鏈V區(qū)內(nèi)的三個(gè)高度分歧的片段稱為“高變區(qū)”，該區(qū)介于更保守的稱為“框架區(qū)”或“FRs”的旁側(cè)片段之間。因此，術(shù)語“FR”是指免疫球蛋白中天然存在于高變區(qū)之間和高變區(qū)鄰近的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的三個(gè)高變區(qū)和重鏈的三個(gè)高變區(qū)在三維空間中相對對方形成抗原結(jié)合“表面”。這個(gè)表面介導(dǎo)靶抗原的識別和結(jié)合。每個(gè)重鏈和輕鏈的三個(gè)高變區(qū)被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDRs”,并通過例如Kabat et al.Sequences of proteins ofimmunological interest, 4th ed.U.S.Dept.Health and Human Services, Public HealthServices, Bethesda, MD (1987)進(jìn)行表征。
[0028] 術(shù)語“干擾素”是指全長干擾素，或者基本保持全長野生型干擾素的生物活性(例如保持全長抗體至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、98%或99%)的干擾素片段(截短的干擾素)或干擾素突變體。干擾素包括I型干擾素(例如，干擾素-α和干擾素-β )和II型干擾素(例如，干擾素-Y)。所述干擾素(例如IFN-α)可以是來自幾乎任何哺乳動物物種。某些優(yōu)選實(shí)施方案中，干擾素來自選自人、馬類、牛類、嚙齒動物、豬類、兔類、貓類、犬類、鼠、山羊、羊類、非人靈長類等的物種。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，突變干擾素包含一或多個(gè)氨基酸取代、插入和/或缺失。
[0029]抗-HER2/neu抗體是特異或優(yōu)先結(jié)合HER2/neu受體的抗體。
[0030]術(shù)語“個(gè)體(subject) ”用于本文是指人或非人動物，包括但不限于貓、狗、馬、豬、牛、綿羊、山羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
[0031]術(shù)語“C6抗體”用于本文是指由C6.5衍生的抗體，其序列在例如美國專利6，512，097和5，977，322，以及PCT公開W097/00271中明確提供。C6抗體優(yōu)選對HER2/neu的結(jié)合親和力在大約1.6x10-8或以上。某些實(shí)施方案中，C6抗體來源于篩選噬菌體展示文庫(對c-erbB-2/HER2/neu親和力)，所述文庫中已知的C6可變重鏈(VH)與多個(gè)可變輕鏈(VL)聯(lián)合表達(dá)，或者反過來，已知的C6可變輕鏈與多個(gè)可變重鏈聯(lián)合表達(dá)。C6抗體還包括象例如美國專利6，512，097和5，977，322，以及PCT公開W097/00271中描述的，通過向可變重鏈或可變輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R1、⑶R2或⑶R3)中引入突變而產(chǎn)生的那些抗體。此外，C6抗體包括這些應(yīng)用于C6.5及其衍生物的修飾方法的任意組合所產(chǎn)生的那些抗體。
[0032]“抗-EGFR家族抗體”是指特異結(jié)合表皮生長因子受體家族成員的抗體(例如，結(jié)合ErbB-1 (又稱為表皮生長因子受體(EGFR)、ErbB_2 (在人中又稱為HER2，在嚙齒動物中稱為neu)、ErbB-3 (又稱為HER3)和/或ErbB_4 (又稱為HER4)的抗體)。示范性的抗-EGFR家族抗體包括，但不限于諸如 C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.HUHER3.H3、HER3.E12、HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.CI O, EGFR.BI K EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.Dll、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8以及HER4.C7等抗體(參見，例如美國專利申請公開US2006/0099205A1和US2004/0071696A1,這兩份f獻(xiàn)詢通i寸引用并入本f )。
[0033]單鏈Fv( “sFv”或“scFv”)多肽是共價(jià)連接的VH:八異二聚體，在某些實(shí)施方案中可以由包含直接或者通過肽編碼接頭連在一起的Vh-和 '-編碼序列的核酸表達(dá)產(chǎn)生。Huston, et al.Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 85:5879-5883 (1988)。有多種結(jié)構(gòu)能將天然地聚集在一起但化學(xué)結(jié)構(gòu)各自獨(dú)立的輕鏈和重鏈多肽由抗體V區(qū)轉(zhuǎn)化為sFv分子，它們能夠折疊成與抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)實(shí)質(zhì)上類似的三維結(jié)構(gòu)。參見例如美國專利5，091，513、5，132，405 和 4，956，778。
[0034]“⑶20”是成熟B細(xì)胞表面上的非糖基化的磷酸蛋白(參見例如Cragg etal.(2005) Curr.Dir.Autoimmun., 8:140-174) ?該蛋白還可見于B細(xì)胞淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、皮膚/黑素瘤癌癥干細(xì)胞等。
[0035]短語“抑制癌細(xì)胞的生長和/或增殖”指降低癌細(xì)胞的生長速度和/或增殖速度。某些實(shí)施方案中，這包括癌細(xì)胞的死亡(例如通過細(xì)胞凋亡)。某些實(shí)施方案中，該術(shù)語還指抑制實(shí)體瘤的生長和/或增殖，和/或誘發(fā)腫瘤體積下降或者消除腫瘤。
[0036]術(shù)語“癌癥標(biāo)記物”指這樣一些諸如蛋白、碳水化合物、糖蛋白等的生物分子，所述分子專門或者優(yōu)勢地或者有區(qū)別地在癌細(xì)胞上表達(dá)，和/或被發(fā)現(xiàn)與癌細(xì)胞相關(guān)，因此可以作為癌癥的優(yōu)選或特異的目標(biāo)。在多項(xiàng)實(shí)施方案中，優(yōu)勢表達(dá)可以是與生物體中其他細(xì)胞相比的優(yōu)勢表達(dá)，或者是生物體中特定區(qū)域內(nèi)的優(yōu)勢表達(dá)(例如，在特定器官或組織中)。
[0037]具體地，本發(fā)明涉及如下各項(xiàng):
[0038]1.嵌合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含附著了能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的導(dǎo)靶部分的干擾素，當(dāng)所述構(gòu)建體與腫瘤細(xì)胞接觸時(shí)，導(dǎo)致所述腫瘤細(xì)胞被殺死或者其生長或增殖受到抑制。
[0039]2.嵌合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含附著了能夠結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)記物或細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物的導(dǎo)靶部分的干擾素，其中所述導(dǎo)靶部分不是通過(Gly4Ser)3(SEQ ID N0:31)接頭附著于所述干擾素的。
[0040]3.如項(xiàng)1-2中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是I型干擾素。
[0041]4.如項(xiàng)1-2中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是2型干擾素。
[0042]5.如項(xiàng)3所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是干擾素α。
[0043]6.如項(xiàng)3所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是干擾素β。
[0044]7.如項(xiàng)1-6中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分是能夠結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的抗體。
[0045]8.如項(xiàng)1-7中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分與所述干擾素是化學(xué)偶聯(lián)的。
[0046]9.如項(xiàng)1-7中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分是借助肽接頭與干擾素連在一起的。
[0047]10.如項(xiàng)9所述的構(gòu)建體，其中所述肽接頭長度小于15個(gè)氨基酸。
[0048]11.如項(xiàng)9所述的構(gòu)建體,其中所述肽接頭不是(Gly4Ser) 3。
[0049]12.如項(xiàng)9所述的構(gòu)建體，其中所述肽接頭是Gly4Ser15
[0050]13.如項(xiàng)9-12中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是重組表達(dá)的融合蛋白。
[0051] 14.如項(xiàng)7所述的構(gòu)建體，其中所述抗體特異結(jié)合選自HER3、HER2/neu、MUC-1、G250、間皮素、gp 100、酪氨酸酶和MAGE的標(biāo)記物。
[0052]15.如項(xiàng)14所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分是能夠結(jié)合CD20的抗體。
[0053]16.如項(xiàng)15所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分是單鏈抗體，其包含抗CD20(利妥昔單抗)的可變區(qū)。
[0054]17.如項(xiàng)14所述的構(gòu)建體，其中所述導(dǎo)靶部分是能夠結(jié)合HER2的抗體。
[0055]18.如項(xiàng)17所述的構(gòu)建體，其中所述抗體是C6抗體。
[0056]19.如項(xiàng)17所述的構(gòu)建體，其中所述抗體包含C6MH3-B1的VH和VL CDRs。
[0057]20.如項(xiàng)17所述的構(gòu)建體，其中所述抗體包含C6MH3-B1的VH和VL結(jié)構(gòu)域。[0058]21.如項(xiàng)7所述的構(gòu)建體，其中所述抗體是選自單鏈Fv(scFv)、FAB、(Fab，)2、(ScFv) 2和全長IgG的抗體。
[0059]22.如項(xiàng)7所述的構(gòu)建體，其中所述抗體是選自Rituxan、IF5、B1、1H4、CD19、B4、B43、FVS191、hLL2、LL2、RFB4、M195、HuM195、AT13/5、赫賽汀、4D5、HuCC49、HUCC39 Δ CH2B72.3、12C10、IG5、H23、BM-2、BM-7、12H12、MAM-6、HMFG-1 的抗體。
[0060]23.如項(xiàng)7所述的構(gòu)建體，其中所述抗體是能夠結(jié)合EGF受體家族成員的抗體。
[0061]24.如項(xiàng)23所述的構(gòu)建體，其中所述抗體選自C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6_B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.CIO、EGFR.BI 1、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.Dll、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8 和 HER4.C7
[0062]25.藥物制劑，所述制劑在藥物可接受的賦形劑中包含如項(xiàng)1-21中任一項(xiàng)所述的
構(gòu)建體。
[0063]26.如項(xiàng)25所述的藥物制劑，其中所述制劑是單位劑量制劑。
[0064]27.如項(xiàng)25所述的藥物制劑，其中所述制劑被配制成腸胃外給藥的制劑。
[0065]28.如項(xiàng)25所述的藥物制劑，其中所述制劑被配制成用于通過選自口服、靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、直接腫瘤給藥、吸入、直腸給藥、陰道給藥、透皮給藥和皮下儲庫給藥的途徑進(jìn)行給藥的制劑。
[0066]29.抑制癌細(xì)胞生長和/或增殖的方法，其中所述方法包含將所述癌細(xì)胞與如項(xiàng)1-21中任一項(xiàng)所述的嵌合構(gòu)建體進(jìn)行接觸。
`[0067]30.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是轉(zhuǎn)移細(xì)胞。
[0068]31.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞在實(shí)體瘤中。
[0069]32.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。
[0070]33.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是B細(xì)胞淋巴瘤。
[0071]34.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是由選自B細(xì)胞淋巴瘤、肺癌、支氣管癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、食道癌、宮頸癌、黑素瘤、子宮或子宮內(nèi)膜癌、口腔癌或喉癌、肝癌、腎癌、膽管癌、小腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、胸腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、脂肪瘤、睪丸癌以及惡性纖維組織細(xì)胞瘤的癌癥產(chǎn)生的細(xì)胞。
[0072]35.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述接觸包括將所述嵌合部分系統(tǒng)地給予哺乳動物。
[0073]36.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述接觸包括將所述嵌合部分直接給藥到腫瘤部位。
[0074]37.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述接觸包括靜脈內(nèi)給予所述嵌合部分。
[0075]38.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是人體內(nèi)的癌細(xì)胞。
[0076]39.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是非人哺乳動物體內(nèi)的癌細(xì)胞。
[0077]40.編碼融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含附著于C6單鏈抗體或抗⑶20單鏈抗體的干擾素。
[0078]41.如項(xiàng)35所述的核酸，其中所述干擾素是I型干擾素。
[0079]42.如項(xiàng)35所述的核酸，其中所述干擾素是IFN- α。[0080]43.如項(xiàng)40-37中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述抗體包含C6MH3-B1的VH和VLCDRs。
[0081]44.如項(xiàng)43所述的核酸，其中所述抗體通過肽接頭附著于所述IFN-α。
[0082]45.如項(xiàng)38所述的核酸，其中所述抗體包含C6MH3-B1的VH和VL結(jié)構(gòu)域。
[0083]46.如項(xiàng)40-37中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述抗體包含抗⑶20 (利妥昔單抗)的
可變區(qū)。
[0084]47.如項(xiàng)46所述的核酸，其中所述抗體通過15個(gè)氨基酸或更短的肽接頭附著于所述 IFN- α。
[0085]48.如項(xiàng)46所述的核酸,其中所述抗體通過Gly4Ser肽接頭附著于所述IFN- α。
[0086]49.含有表達(dá)融合蛋白的核酸的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含如項(xiàng)40-48中任一項(xiàng)所述的核酸。
[0087]50.如項(xiàng)1-21中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體在制備用于抑制癌細(xì)胞生長和/或增殖的藥物中的用途。
[0088]附圖簡述
[0089]圖1A-圖10 顯示了本文描述的多種構(gòu)建體的核酸和氨基酸序列。圖1A顯示了抗-HER2/neu IgG3 重鏈-1FN- a (SEQ ID NO:1)和抗 _HER2/neu IgG3 輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID N0:2)。單下劃線的是接頭，雙下劃線的是鼠IFN-α，無下劃線的是抗-HER2/neu ;圖1B: aCD20 輕鏈，核酸(SEQ ID N0:3)，氨基酸序列(SEQ ID NO:4);圖1C: a CD20-1gG3-muIFNaGly4Ser 接頭，核酸(SEQ ID N0:5)，氨基酸序列(SEQ ID NO:6);圖1D: aCD20-1gG3-muIFNa α 螺旋接頭，核酸(SEQ ID N0:7)，氨基酸序列(SEQ IDNO:8);圖1E: aCD20-1gG3-huIFNaGly4Ser 接頭，核酸(SEQ ID N0:9)，氨基酸序列(SEQID NO: 10);圖1F: a CD20-1gG3_huIFNa α 螺旋接頭，核酸(SEQ ID N0:11)，氨基酸序列(SEQ ID NO: 12);圖 1G: a CD20-1gGl_muIFNa Gly4Ser 接頭，核酸(SEQ ID NO: 13)，氨基酸序列(SEQ ID NO: 14);圖 1H: a CD20-1gGl-muIFNa a 螺旋接頭，核酸(SEQ IDN0:15)，氨基酸序列(SEQ ID NO: 16);圖11: a CD20-1gGl_huIFN a Gly4Ser 接頭，核酸(SEQ ID NO: 17)，氨基酸序列(SEQ ID NO: 18);圖 1J: a CD20-1gGl_huIFNa a 螺旋接頭，核酸(SEQ ID NO: 19)，氨基酸序列(SEQ ID NO:20);圖1K: a Her2/neu 輕鏈核酸(SEQ IDN0:21)，氨基酸序列(SEQ ID NO:22);圖 1L: a Her2/neu-1gGl_muIFNa GlySer 接頭，核酸序列(SEQ ID N0:23)，氨基酸序列(SEQ ID NO:24);圖 1M: a Her2/neu-1gGl_muIFNa a螺旋接頭，核酸序列(SEQ ID NO:25)，氨基酸序列(SEQ ID NO:26);圖1N: a Her2/neu-1gGl-huIFNaGlySer 接頭，核酸序列(SEQ ID N0:27)，氨基酸序列(SEQ ID NO:28);圖 10: aHer2/neu-1gGl-huIFNa a 螺旋接頭，核酸序列(SEQ ID NO:29),氨基酸序列(SEQID N0:30)。應(yīng)當(dāng)理解，雖然本圖中顯示的構(gòu)建體帶有特定接頭，在某些實(shí)施方案中，可以用文中描述的其他接頭代替。
[0090]圖2A、圖2B、圖2C和圖2D圖示了抗_HER2/neu IgG3_IFN_a的構(gòu)建和表征。圖2A:抗-HER2/neu-1gG3_IFN-α的示意圖。實(shí)心區(qū)域代表抗_HER2/neu可變區(qū)?？招膮^(qū)域代表人IgG3和K恒定區(qū)。白色圓形區(qū)域代表鼠IFN-α。圖2B:純化的抗-HER2/neu_IgG3 (泳道 I 和 4)、IgG3-1FN- a (泳道 2 和 5)和抗-HER2/neu-1gG3_IFN- a (泳道 3 和 6)在非還原(泳道1- 3)或還原(泳道4 - 6)條件下的SDS-PAGE。分子量標(biāo)記蛋白示于每個(gè)凝膠的左側(cè)。圖 2C:抗-HER2/neu-1gG3 和抗-HER2/neu-1gG3-1FN-a 結(jié)合 HER2/neu。表達(dá)高水平人HER2/neu的鼠結(jié)腸細(xì)胞系CT26/HER2與帶有或不帶有肝素的抗-HER2/neu_IgG3、IgG3-1FN-a或抗-HER2/neu-1gG3_IFN-α反應(yīng)，然后與PE標(biāo)記的兔抗人IgG反應(yīng)。破折號線代表不加入重組蛋白時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生的信號。圖2D:1FN-α標(biāo)準(zhǔn)和不同IFN_a融合蛋白抗VSV 的保護(hù)活性。制備 100 μ IlU IFN-α 標(biāo)準(zhǔn)、0.2Ing(IOpM)抗-HER2/neu-1gG3_IFN-a、0.21ng (IOpM) IgG3_IFN_a，或 0.17ng (IOpM)抗-HER2/neu_IgG3 的稀釋液，并加給 L-929細(xì)胞。溫育24小時(shí)后，加入4000PFU的VSV。48小時(shí)后，用結(jié)晶紫染料將活細(xì)胞染色，經(jīng)甲醇溶解，用ELISA檢測儀于570nm檢測溶解的染料。
[0091]圖3A和圖3B顯示不同IFN-a融合蛋白和rIFN_a的體內(nèi)抗腫瘤活性。C3H/HeN小鼠用1x10338C13/HER2細(xì)胞s.c.(皮下)攻擊，在腫瘤攻擊后1、3和5天用2.5μ8(圖3Α)或Iyg(圖3Β)指定蛋白1.p.(靜脈)處置。測量每只小鼠的腫瘤體積。觀察小鼠，直至s.c.腫瘤直徑達(dá)到15mm。
[0092]圖4A和圖4B顯示IFN-a上融合IgG3提高了它的抗腫瘤活性并且提高了其體內(nèi)半衰期。圖4A:小鼠在腫瘤攻擊后I和3天用9600U的rIFN-a或9600υ(4μ8)的IgG3-1FN-a處置。跟蹤動物的存活情況，并在s.c.腫瘤直徑達(dá)到15mm時(shí)處死。圖4B:將三只一組的 C3H/HeN 小鼠 1.p.注射 66 μ Ci1251-標(biāo)記的 rIFN- a、IgG3_IFN- α 或抗-HER2/neu-1gG3-1FN-a。在注射1251-標(biāo)記的蛋白后的不同間隔用小鼠全身放射性計(jì)數(shù)器測量殘余放射性。結(jié)果代表三只小鼠的平均值。條帶，SD。
[0093]圖5A、圖5B、圖5C和圖顯示IFN-a融合蛋白抑制了細(xì)胞增殖并體外誘發(fā)38C13/HER2的細(xì)胞凋亡。IFN-a融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增殖。與不同劑量的不同融合蛋白溫育48小時(shí)后，利用MTS檢測來測量活的38C13/HER2(圖5A)或38C13(圖5B)細(xì)胞。這些試驗(yàn)一式三份進(jìn)行了三次；誤差條，測量值的SD。圖5C:1FN-a融合蛋白誘導(dǎo)38C13/HER2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。簡而言之，將1x10638C13/HER2細(xì)胞與InM指定蛋白溫育72h。然后將細(xì)胞清洗，用Alexa Fluor488、膜聯(lián)蛋白(annexin) V和PI染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。角落處顯示了位于每個(gè)象限中的細(xì)胞`的百分比。圖ro:1FN-a融合蛋白抑制了存活的38C13/HER2細(xì)胞的增殖。簡單來說，將1x10638C13/HER2細(xì)胞用2.5 μ M CFSE標(biāo)記，并立即固定(破折號線)，或者用PBS(細(xì)黑線)、或InM抗-HER2/neu IgG3 (細(xì)黑線、與PBS對照重疊)、IgG3-1FN- α (粗黑線)或抗-HER2/neu-1gG3-1FN- α (黑色區(qū)域)處理48h。然后將細(xì)胞清洗，通過流式細(xì)胞術(shù)分析。通過選通活細(xì)胞群獲得圖譜。
[0094]圖6A、6B和6C顯示IFN- α融合蛋白在38C13/HER2細(xì)胞中誘導(dǎo)了 STATl活化。簡單來說，1x10738C13/HER2 細(xì)胞用 1000U/ml 抗-HER2/neu-1gG3_IFN-α (圖 6Α)或IgG3-1FN-a (圖6B)處理指定的時(shí)間。細(xì)胞裂解物經(jīng)SDS-PAGE分離，并利用多克隆兔抗磷STATl通過Western印跡分析。為了證實(shí)蛋白樣品上樣量相同，用抗GAPDH的偶聯(lián)HRP的兔多克隆抗體檢測印跡。圖6C:對每個(gè)指定時(shí)間點(diǎn)，用抗GAPDH的強(qiáng)度將抗磷STATl的強(qiáng)度歸一化，得到的數(shù)值除以O(shè)時(shí)間點(diǎn)處的數(shù)值得到STATl的活化倍數(shù)。這些試驗(yàn)進(jìn)行了兩次；誤差條，測量值的SD。*，出現(xiàn)兩組差異p〈0.05的唯一點(diǎn)。
[0095]圖7IFN-a融合蛋白抑制了已建立的腫瘤的生長。將C3H/HeN小鼠s.c.注射1x10338C13/HER2細(xì)胞。12天后，連續(xù)三天用5 μ g指定蛋白將小鼠1.p.處理。測量每只小鼠的腫瘤體積。當(dāng)s.c.腫瘤直徑達(dá)到15mm，將動物處死。[0096]圖8顯示重組抗體與表達(dá)⑶20的人細(xì)胞發(fā)生結(jié)合。將Daudi細(xì)胞與重組IgG3或利妥昔單抗溫育，隨后與生物素化的大鼠抗人IgG和PE-標(biāo)記的鏈霉親和素溫育，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。A，僅與二抗溫育的細(xì)胞；B，與重組IgG3溫育的細(xì)胞；C，與利妥昔單抗溫育的細(xì)胞。
[0097]圖9顯示了抗體-1FN- α融合蛋白的重鏈的示意圖。特別是該圖顯示了將(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:31)縮短為 Gly4Ser (SEQ ID NO:32)接頭產(chǎn)生了全長a CD20-1gG3-mIFNa。
[0098]圖10顯示了從蛋白A Sepharose洗脫下來的級分的SDS-PAGE分析。表達(dá)帶有(Gly4Ser)3(SEQ ID N0:31)接頭的抗-CD_20-1gG3-1FNa的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清流過蛋白ASepharose,融合蛋白在洗脫前結(jié)合。A.蛋白未經(jīng)還原跑膠。泳道l，IgG3;泳道2_6，從蛋白A Sepharose洗脫下來的級分。B.蛋白在分析前被還原。泳道2，IgG3;泳道3_7，從蛋白A Sepharose洗脫下來的級分。
[0099]圖11顯示了通過在HEK293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)生的蛋白的SDS-PAGE分析。泳道 1，帶有延長的(Gly4Ser) 3 (SEQ ID N0:31)接頭的抗-CD20_IgG3-.泳道 2，帶有縮短的Gly4SeHSEQ ID NO:32)接頭的抗_CD20_IgG3 huIFNg;泳道3,帶有延長的(Gly4Ser) 3 (SEQ ID NO: 31)接頭的抗-CD20-1gG3-muIFNa ;泳道 4，帶有縮短的Gly4Ser (SEQ ID NO: 32)接頭的抗-CD20-1gG3-muIFNq ;泳道 5,抗 _CD20IgG3。
[0100]圖12顯示了利用流式細(xì)胞術(shù)對與Daudi細(xì)胞結(jié)合的蛋白進(jìn)行的分析。IxlO6Daudi細(xì)胞用Iug含有人IFN-α或Rituxan的融合蛋白染色。
[0101]圖13顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)對與38C13/⑶20結(jié)合的蛋白進(jìn)行的分析。
[0102]圖14.Daudi細(xì)胞與不同濃度的IFN-a、抗體或融合蛋白溫育72小時(shí)。利用CellTiter96AQueous細(xì)胞增殖分析法評價(jià)細(xì)胞的生長抑制情況。
[0103]圖15.Daudi細(xì)胞用IOpM指定蛋白處理72小時(shí)。用膜聯(lián)蛋白V和PI染色，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，確定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。
[0104]圖16.38C13/⑶20細(xì)胞用IOpM指定蛋白處理48小時(shí)。用膜聯(lián)蛋白V和PI染色，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，確定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。
[0105]圖17.用各種濃度的不同蛋白處理后細(xì)胞增殖的抑制情況。38C13-⑶20細(xì)胞用各種濃度的指定蛋白處理48小時(shí)。處理后，利用MTS分析法監(jiān)測增殖程度。
[0106]圖18.38C13/⑶20細(xì)胞用不同濃度的指定蛋白處理48小時(shí)。用膜聯(lián)蛋白V和PI染色，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，確定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。
[0107]圖19.Daudi細(xì)胞與不同濃度的融合蛋白溫育72小時(shí)。用膜聯(lián)蛋白V和PI染色，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，確定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。
[0108]圖20.Daudi細(xì)胞用各種濃度的融合蛋白處理72小時(shí)。加入MTS溶液定量細(xì)胞活力。
[0109]圖21.Daudi 細(xì)胞與 IpM 帶有 Gly4Ser 接頭(32) (Gly-Ser 接頭)的抗-Q)20-1gG3-hIFNα 或者 IpM 帶有 α 螺旋接頭(Alpha helix Linker)的抗-⑶20-1gG3-hIFNa溫育72小時(shí)。 用膜聯(lián)蛋白V和PI染色，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，確定細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。[0110]圖22顯示了接種5000個(gè)38C13-CD20細(xì)胞，并在第1、2和3天用HBSS或者指定量的抗-⑶20-1FN- α融合蛋白處理過的小鼠的存活情況。
[0111]圖23顯示了接種5000個(gè)38C13-CD20細(xì)胞，并在第5、6和6天用10 μ g抗-CD20-1gGl、抗-CD20-1gG3、利妥昔單抗或抗-CD20-1gG3_mIFNα處理過的小鼠的存活情況。
[0112]圖24.接種 5000 個(gè) 38C13-CD20 細(xì)胞，并在第 5、6 和 6 天用 IOyg 抗-CD20-1gG3、抗-CD20-1gG3+IFNa、抗-DNS-1gG3或抗-CD20-1gG3_mIFFN a處理過的小鼠的存活情況。
[0113]圖25.8只一組的小鼠在第O天注射5000個(gè)38C13-⑶20細(xì)胞。第8、9和10天，它們用HBSS或100 μ g抗-⑶20-1gG3-mIFN a處理。持續(xù)監(jiān)測腫瘤生長情況。
[0114]圖26.8只一組的小鼠在第O天注射5000個(gè)38C13-⑶20細(xì)胞。第8、9和10天，它們用HBSS或100 μ g抗-⑶20-1gG3-mIFN a處理。持續(xù)監(jiān)測存活情況。
[0115]發(fā)明詳述
[0116]干擾素a (IFN-a)是啟動先天性免疫反應(yīng)的一種重要細(xì)胞因子，它還表現(xiàn)出廣泛的抗腫瘤活性。但是干擾素(例如IFN-a)在臨床上作為抗癌藥物的應(yīng)用卻受到嚴(yán)重影響其治療效果的較短的半衰期所限制。某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，即通過將干擾素附著于能夠特異/優(yōu)先結(jié)合靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)上或者與靶細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物的導(dǎo)靶部分可以提高干擾素的治療指數(shù)。這使得可以向靶位點(diǎn)遞送更高劑量的干擾素，而系統(tǒng)并發(fā)癥更少。這一點(diǎn)在一個(gè)實(shí)施方案中通過由抗_HER2/neu IgG3和IFN-a (抗-HER2/neu-1gG3-1FN-a)構(gòu)成的融合蛋白的構(gòu)建和使用，在另一個(gè)實(shí)施方案中由抗-⑶20-1FN-a融合蛋白的構(gòu)建和使用予以展示。
[0117]HER2/neu-1gG3-1FN-a構(gòu)建體的效力在用人HER2/neu轉(zhuǎn)導(dǎo)的鼠B-細(xì)胞淋巴瘤38C13上進(jìn)行了測試?？?HER2/neu-1gG3-1F`N-a融合蛋白表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制38C13/HER2體內(nèi)腫瘤生長的效果，甚至在腫瘤攻擊后，僅給予I μ g抗_HER2/neu IgG3_IFN_ a即導(dǎo)致88%的長期存活。
[0118]不同尋常的是，抗_HER2/neu IgG3_IFN_a顯示出強(qiáng)大的抗已建立的38C13/HER2腫瘤的活性，在88%處理小鼠中觀察到腫瘤完全消失。這樣巨大的抗腫瘤活性是由IFN-a誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的，通過抗_HER2/neu IgG3抗體將IFN- a導(dǎo)靶到38C13/HER2腫瘤細(xì)胞對增強(qiáng)這些效果是關(guān)鍵的。
[0119]抗-⑶20-1gG3-1FN_a構(gòu)建體(參見實(shí)施例2)中觀察到了類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明干擾素(例如，IFN-a)附著(例如融合)于導(dǎo)靶部分(例如附著于腫瘤特異性抗體)產(chǎn)生了可用于抑制靶細(xì)胞的生長和/或增殖甚至將其殺死的有效治療劑。因此，例如本文描述的示例性構(gòu)建體可以方便地用于臨床上治療B細(xì)胞淋巴瘤和其他癌癥。
[0120]因此，某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的構(gòu)建體(例如嵌合部分)，所述構(gòu)建體包含附著于導(dǎo)靶部分(例如附著于特異結(jié)合癌細(xì)胞上的癌癥特異標(biāo)記物的抗體)的干擾素(例如IFN-a)。這類構(gòu)建體包括化學(xué)偶聯(lián)體和融合蛋白。還提供了編碼融合蛋白的核酸，和轉(zhuǎn)染了所述核酸從而表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞。還提供了抑制癌細(xì)胞生長和增殖的方法，以及用于治療各種癌癥的包含例如本文描述的嵌合部分的試劑盒。
[0121]1.包含附著了干擾素的導(dǎo)靶部分的嵌合構(gòu)建體。
[0122]我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，包含附著了導(dǎo)靶部分的天然(野生型)或修飾的IFN(例如IFN-α)的嵌合構(gòu)建體可以有效地用于抑制靶癌細(xì)胞生長和/或增殖，所述癌細(xì)胞表達(dá)導(dǎo)靶部分所針對的標(biāo)記物或者與所述標(biāo)記物相關(guān)。某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分與干擾素化學(xué)偶聯(lián)，而在其他實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分與IFN-α表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)以融合蛋白產(chǎn)生時(shí)，導(dǎo)靶部分(例如抗體)成分與IFN-a可以是直接融合或者借助肽接頭(例如，(Gly4Ser)3(SEQID NO:31)接頭、GlyGlyGlyGlySer(SEQ ID NO:32)接頭、AEAAAKEAAAKA(SEQ ID N0:33)等)附著。
[0123]A)導(dǎo)革巴部分(targetting moieties)。
[0124]在多項(xiàng)實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是這樣的分子，其與靶細(xì)胞所表達(dá)的(例如表達(dá)在靶細(xì)胞表面的)標(biāo)記物或者和靶細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物特異地或優(yōu)先地結(jié)合。雖然靶細(xì)胞幾乎可以是任何細(xì)胞，某些優(yōu)選的細(xì)胞包括那些與特征在于細(xì)胞過度增殖的病態(tài)(即過度增殖病)相關(guān)的細(xì)胞。示范性的過度增殖病包括，但不限于銀屑病、中性白細(xì)胞增多癥、紅細(xì)胞增多癥、血小板增多癥和癌癥。
[0125]定性為癌癥的過度增殖病包括，但不限于實(shí)體瘤，諸如發(fā)生在乳腺、呼吸道、腦、生殖器官、消化道、尿道、眼、肝臟、皮膚、頭頸、甲狀腺、甲狀旁腺的癌癥，以及它們的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。這類疾病還包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。乳腺癌的實(shí)例包括，但不限于浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉癌、乳腺導(dǎo)管原位癌和乳腺小葉原位癌。呼吸道癌癥的實(shí)例包括，但不限于肺小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌，以及支氣管腺瘤和胸膜肺母細(xì)胞瘤。腦癌的實(shí)例包括，但不限于腦干和下丘腦角質(zhì)瘤、小腦和大腦星狀細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤，以及神經(jīng)外胚層和松果體腫瘤。男性生殖器腫瘤包括，但不限于前列腺和睪丸癌。女性生殖器腫瘤包括，但不限于子宮內(nèi)膜、宮頸、卵巢、陰道和外陰癌，以及子宮瘤。消化道腫瘤包括，但不限于肛門、結(jié)腸、結(jié)腸直腸、食管、膽囊、胃、胰腺、直腸、小腸和唾液腺癌。尿道腫瘤包括，但不限于膀胱、陰莖、腎、腎盂、 輸尿管和尿道癌。眼癌包括，但不限于眼球內(nèi)黑素瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。肝癌的實(shí)例包括，但不限于肝細(xì)胞癌(有或沒有纖維板層變異的肝細(xì)胞瘤)、膽管癌(肝內(nèi)膽管癌)和混合型肝細(xì)胞膽管細(xì)胞癌。皮膚癌包括，但不限于鱗狀細(xì)胞癌、卡波西(Kaposi’s)肉瘤、惡性黑素瘤、默克(Merkel)細(xì)胞皮膚癌和非黑素瘤型皮膚癌。頭頸癌包括，但不限于喉/下咽/鼻咽/ 口咽癌，和嘴唇和口腔癌。淋巴癌包括，但不限于AIDS相關(guān)的淋巴癌、非霍奇金(Hodgkin’s)淋巴癌、皮膚T-細(xì)胞淋巴癌、霍奇金氏病，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴癌。肉瘤包括，但不限于軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤。白血病包括，但不限于急性髓樣白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病和毛細(xì)胞白血病。
[0126]這些疾病在人類中已有成熟的研究，但它們也以類似的病原學(xué)存在于其他哺乳動物中，可以通過給予本發(fā)明的藥物組合物來治療。
[0127]某些實(shí)施方案中，導(dǎo)靶部分是能夠結(jié)合癌癥標(biāo)記物(例如，腫瘤相關(guān)抗原)的部分。有大量癌癥標(biāo)記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些標(biāo)記物不需要是癌細(xì)胞特有的，但在以下情況中也是有效的，即標(biāo)記物在癌細(xì)胞中的表達(dá)提高(相比正常的健康細(xì)胞)或者周邊組織不存在可比水平的標(biāo)記物(特別是當(dāng)嵌合部分用于局部遞送)。
[0128]示范性的癌癥標(biāo)記物包括，例如ND4單克隆抗體識別的腫瘤標(biāo)記物。該標(biāo)記物可見于低分化的結(jié)腸直腸癌，以及胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(參見例如Tobi et al.(1998)CancerDetection and Prevention, 22 (2): 147-152)。其他重要的癌癥免疫療法目標(biāo)是膜結(jié)合補(bǔ)體調(diào)控糖蛋白:⑶46、⑶55和⑶59，這些蛋白已被發(fā)現(xiàn)體內(nèi)和體外在多數(shù)腫瘤細(xì)胞上都有表達(dá)。人粘蛋白(例如MUC1)與在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的gplOO、酪氨酸酶和MAGE都是已知的腫瘤標(biāo)記物。野生型Wilms’瘤基因WTl不僅在多數(shù)急性髓細(xì)胞、急性淋巴細(xì)胞和慢性髓細(xì)胞白血病中，而且在包括肺癌的多種類型的實(shí)體瘤中高水平表達(dá)。
[0129]急性淋巴細(xì)胞白血病已通過TAAs HLA-Dr、⑶1、⑶2、⑶5、⑶7、⑶19和⑶20表征。急性髓細(xì)胞白血病已通過TAAs HLA-Dr、⑶7、⑶13、⑶14、⑶15、⑶33和⑶34表征。乳腺癌已通過標(biāo)記物EGFR、HER2、MUCl和Tag-72表征。多種癌通過標(biāo)記物MUC1、TAG-72和CEA進(jìn)行了表征。慢性淋巴細(xì)胞白血病已通過標(biāo)記物⑶3、⑶19、⑶20、⑶21、⑶25和HLA-DR進(jìn)行了表征。毛細(xì)胞白血病通過標(biāo)記物⑶19、⑶20、⑶21、⑶25進(jìn)行了表征?；羝娼鸢Y已通過Leu-Ml標(biāo)記物進(jìn)行了表征。多種黑素瘤已通過HMB45標(biāo)記物進(jìn)行了表征。非霍奇金淋巴瘤通過⑶20、⑶19和Ia標(biāo)記物進(jìn)行了表征。多種前列腺癌已通過PSMA和SElO標(biāo)記物進(jìn)行了表征。
[0130]此外，許多類型的腫瘤細(xì)胞展示罕見的抗原，這些抗原或者是對于該細(xì)胞類型和/或其環(huán)境不相宜的，或者正常情況下只在生物體發(fā)育過程中出現(xiàn)(例如胚胎抗原)。這類抗原的實(shí)例包括鞘糖脂⑶2，這種雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂通常只在神經(jīng)元細(xì)胞的外表面膜上有顯著水平的表達(dá)，其與免疫系統(tǒng)的接觸受到血腦屏障的限制。GD2在包括成神經(jīng)細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、黑素瘤、肺小細(xì)胞癌、骨肉瘤和其他軟組織肉瘤的許多種腫瘤細(xì)胞表面都有表達(dá)。因此GD2是免疫療法的一個(gè)方便的腫瘤特異性目。
[0131]其他類型的腫瘤細(xì)胞展示一些是健康細(xì)胞表面罕見或者不存在的細(xì)胞表面受體，這些受體負(fù)責(zé)細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑的激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不受控制的生長和分裂。實(shí)例包括(ErbB2).HER2/neu,這種組成性活化細(xì)胞表面受體在乳腺癌腫瘤細(xì)胞表面上異常高水平地產(chǎn)生。
[0132]其他有用的目標(biāo)包括，但不限于⑶20、⑶52、⑶33、表皮生長因子受體等。
[0133]表1中提供了合適的腫瘤標(biāo)記`物的說明性而非限制性列表。這些以及其他癌癥標(biāo)記物的抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以購買到或者利用例如噬菌體展示技術(shù)很容易地制備。
[0134]表1.說明性的癌癥標(biāo)記物和相關(guān)的參考文獻(xiàn)，為了便于確認(rèn)提及的腫瘤標(biāo)記物，這些文獻(xiàn)全部通過引用并入本文。
[0135]
【權(quán)利要求】
1.嵌合構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含附著了能夠結(jié)合CD20的完整抗體的干擾素，其中所述抗體是通過肽接頭附著于所述干擾素的，其中所述接頭的氨基酸序列是SGGGGS，且其中當(dāng)所述構(gòu)建體與腫瘤細(xì)胞接觸時(shí)，導(dǎo)致所述腫瘤細(xì)胞被殺死或者其生長或增殖受到抑制。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是干擾素α。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是干擾素β。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是I型干擾素。
5.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述干擾素是2型干擾素。
6.如權(quán)利要求1一 5之一所述的構(gòu)建體,其中所述抗體是Rituxan。
7.如權(quán)利要求1一 6之一所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體與游離干擾素相比，顯示抗腫瘤活性增強(qiáng)和/或體內(nèi)半衰期延長。
8.藥物制劑，所述制劑在藥物可接受的賦形劑中包含如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體。
9.如權(quán)利要求8所述的藥物制劑，其中所述制劑是單位劑量制劑。
10.如權(quán)利要求8所述的藥物制劑，其中所述制劑被配制成腸胃外給藥的制劑。
11.如權(quán)利要求8所述的藥物制劑，其中所述制劑被配制成用于通過選自口服、靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、直接腫瘤給藥、吸入、直腸給藥、陰道給藥、透皮給藥和皮下儲庫給藥的途徑進(jìn)行給藥的制劑。
12.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體或權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)所述的藥物制劑在制備抑制淋巴癌細(xì)胞生長和/或增殖的藥物中的用途。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述淋巴癌細(xì)胞是轉(zhuǎn)移細(xì)胞。
【文檔編號】A61P35/02GK103880965SQ201410160383
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2008年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2007年9月21日
【發(fā)明者】謝里.L.默里森, 黃子軒, 旋采云 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會