專利名稱：新型腫瘤凋亡素2配體基因、其表達(dá)的腫瘤凋亡素及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是從中國人外周血單個(gè)核細(xì)胞中獲得的一種新型的腫瘤凋亡素2配體基因，并利用該基因制備人可溶性腫瘤凋亡蛋白——腫瘤凋亡素的方法。
本發(fā)明用Apo-2L I基因來制備人可溶性腫瘤凋亡素。以Apo-2L I基因?yàn)槟０澹ㄟ^PCR擴(kuò)增，從編碼序列5’端第297-801位核苷酸得到人可溶性腫瘤凋亡素基因，其編碼的氨基酸相當(dāng)于Apo-2L I蛋白N-端第100～267位氨基酸，故稱其為Apo-2L I100基因，其與Apo-2L114基因一樣，由504個(gè)核苷酸組成。其編碼的蛋白與Apo-2L I114相同，也由168個(gè)氨基酸組成，稱之為Apo-2L I100或腫瘤凋亡素。
制備Apo-2L I100所使用的表達(dá)載體為pBV220。pBV220由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供，該載體是溫控型的原核表達(dá)載體，其表達(dá)量較高。本發(fā)明通過合成寡聚核苷酸，置換原pBV220載體Bg1II與Xmn I之間的序列，所構(gòu)建的表達(dá)載體命名為pBV-Apo-2L I100，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，所得的工程菌能直接表達(dá)具有生物學(xué)活性的Apo-2L I100。使Apo-2L I100表達(dá)量占工程菌總蛋白的40％以上，占破碎后工程菌上清總蛋白的10％以上，大大提高了腫瘤凋亡素Apo-2L I100的產(chǎn)量和質(zhì)量，且制備方法簡便。
本發(fā)明Apo-2L I基因的克隆，Apo-2L I100的制備，具體包括如下步驟一、構(gòu)建cDNA文庫，制備Apo-2L I基因1.制備人外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA(1)按常規(guī)方法從中國人外周血中分離淋巴細(xì)胞，進(jìn)而用貼壁法獲得單個(gè)核細(xì)胞；(2)用細(xì)菌內(nèi)毒素激活單個(gè)核細(xì)胞以刺激細(xì)胞提高RNA的豐度，再用RNA抽提試劑盒(Qiagen公司)抽提總RNA。
2.篩選Apo-2L I基因(1)構(gòu)建cDNA文庫從上述總RNA中用Oligo-dT柱(Qiagen公司)純化出總mRNA，以總mRNA為模板，用cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Clontech公司)建成cDNA文庫。
(2)篩選出Apo-2L I基因按常規(guī)用隨機(jī)引物法制備基因探針，雜交篩選上述cDNA文庫，篩選出克隆。這些克隆的插入部分亞克隆到pSPORT1的Not I位點(diǎn)。經(jīng)序列分析，其中一個(gè)克隆的基因其DNA序列由1727bp組成，含87bp的5’非翻譯區(qū)，801bp的開放閱讀框(編碼267個(gè)氨基酸，即全長Apo-2L I蛋白)，3’非翻譯區(qū)(含多聚腺苷酸化信號(hào)或稱polyA尾)。該基因命名為Apo-2L I基因，其核苷酸序列見表1，其編碼的氨基酸序列見表2。該質(zhì)粒命名為pSPORT1-Apo-2L I。含此質(zhì)粒的菌株Escherichia coli K802(基因型supE hard gal metB)已于2000年11月17日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號(hào)CCTCCNo.200037；武漢大學(xué))。
二、構(gòu)建Apo-2L I100的原核表達(dá)工程菌株1.制備Apo-2L I100基因設(shè)計(jì)并合成引物，以Apo-2L I基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增出編碼序列Apo-2L I100基因。
2.構(gòu)建原核表達(dá)載體pBV-Apo-2L I100設(shè)計(jì)并合成兩條寡聚核苷酸雙鏈，置換pBV220載體的Bgl II與Xmn I之間的序列，置換的序列是(1)將pBV220原啟動(dòng)子λPL置換為λPLPR串聯(lián)啟動(dòng)子；(2)引入序列為5’-AGGAATTCACAATG-3’的SD序列。然后與Apo-2L I100基因和外源基因下游調(diào)控序列相連。這樣所構(gòu)建成的pBV-Apo-2L I100載體，其核糖體結(jié)合序列與蛋白翻譯起始密碼子之間的距離為7個(gè)核苷酸，以利于Apo-2L I100在細(xì)菌中的表達(dá)。
3.建立Apo-2L I100表達(dá)工程菌將上述pBV-Apo-2L I100轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選得到含重組質(zhì)粒的克隆即為Apo-2L I100的工程菌。
三、制備Apo-2L I1001.發(fā)酵培養(yǎng)工程菌，使其表達(dá)Apo-2L I100；
2.超聲破碎所得菌體，上清行金屬親和層析、凝膠過濾進(jìn)一步純化，即得Apo-2L I100。
2.建立cDNA文庫，篩選Apo-2L I基因按常規(guī)將上述所得的總RNA，用Oligo-dT柱(Qiagen公司)純化得總mRNA，以總mRNA為模板，用cDNA合成試劑盒(Clontch公司)進(jìn)行cDNA第一鏈和第二鏈的合成，加上EcoRI接頭后連接到λgt10載體中，并用λ噬菌體包裝試劑盒(Clontech公司)包裝成λ噬菌體文庫，建成λgt10 cDNA文庫，文庫的滴度為6×106。
用隨機(jī)引物法制備基因探針，雜交篩選此λgt10 cDNA文庫(詳見《分子克隆》第396～601頁)。得到12個(gè)陽性噬菌斑。抽提其DNA，得12個(gè)純化的λDNA，用Not I消化，1％瓊脂糖凝膠電泳，Southern印跡確認(rèn)與探針雜交。挑選雜交強(qiáng)度大的克隆，抽提其DNA，再把該DNA的插入部分亞克隆到pSPORTl(GIBCO公司)的Not I位點(diǎn)。測定質(zhì)粒中插入部分的DNA序列。其中一個(gè)序列由1727bp組成，包含87bp的5’非翻譯區(qū)，801bp開放閱讀框和3’非翻譯區(qū)(含多聚腺苷酸化信號(hào)或稱polyA尾)，此片段即Apo-2L I基因，核苷酸序列如表1。含此基因的質(zhì)粒即pSPORT1-Apo-2L I，含該質(zhì)粒的菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號(hào)CCTCC No.200037，中國武漢大學(xué))。根據(jù)Kozak定義的翻譯起始位點(diǎn)要求，第88-90位核苷酸(ATG，編碼蛋氨酸)為翻譯起始位點(diǎn)，由此得到的最大開放閱讀框所編碼的267個(gè)氨基酸序列如表2。二、構(gòu)建Apo-2L I100原核表達(dá)載體以pBV220質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建可溶性腫瘤凋亡素Apo-2L I100的原核表達(dá)載體pBV-Apo-2L I100。具體步驟如下1.設(shè)計(jì)并合成引物P1、P2和寡聚核苷酸雙鏈P3、P4 P1、P2為擴(kuò)增編碼Apo-2L I100基因的引物。P1引入蛋白合成起始密碼子ATG及EcoR I酶切位點(diǎn)GAATTC；P2引入BamH I酶切位點(diǎn)GGATCC。
合成寡聚核苷酸雙鏈P3、P4 P3、P4為置換原始pBV220載體Bg1 II與Xmn I之間的外源基因上游調(diào)控序列及下游序列。P3的斜體部分為λPLPR串聯(lián)啟動(dòng)子，陰影部分為cI抑制蛋白結(jié)合位點(diǎn)，黑體部分為核糖體結(jié)合序列，5’端引入Bg1 II酶切位點(diǎn)AGATCT，3’端引入EcoR I酶切位點(diǎn)GGATTC；P4的5’端引入了BamH I酶切位點(diǎn)GGATCC，3’端引入Xmn I酶切位點(diǎn)GAANNNNTTC。
2.構(gòu)建表達(dá)載體pBV-Apo-2L I100構(gòu)建表達(dá)載體pBV-Apo-2L I100的流程如

圖1，具體步驟如下以P1、P2為引物，以質(zhì)粒pSPORT1-Apo-2L I為模板，PCR擴(kuò)增Apo-2L I100基因編碼序列，產(chǎn)物以EcoR I和BamH I酶切(NEB公司)。以Bg1 II和EcoR I酶切P3，BamH I和Xmn I酶切P4。以Bg1 II和Xmn I雙酶切pBV220質(zhì)粒。各酶切片段瓊脂糖凝膠回收相應(yīng)大小的片段，用T4 DNA連接酶連接各片段，所得到的重組質(zhì)粒即腫瘤凋亡素Apo-2L I100的表達(dá)載體pBV-Apo-2L I100。三、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，建立工程菌按常規(guī)將pBV-Apo-2L I100轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21[基因型hsdS gal(λcIts857indl Sam7 nin5lacUV5-T7)]，從氨芐抗性菌落中分離質(zhì)粒，酶切鑒定，測序確認(rèn)為pBV-Apo-2L I100。所得的細(xì)菌即為本發(fā)明的工程菌。四、制備Apo-2L I100挑取一個(gè)工程菌菌落，接入含有氨芐青霉素(100μg/ml)的5ml LB培養(yǎng)液的試管中于32℃培養(yǎng)過夜。LB培養(yǎng)基配方(g/L)為蛋白胨∶酵母粉∶NaCl＝10∶5∶5。
把過夜培養(yǎng)的細(xì)菌按1∶100接入含有氨芐青霉素(100μg/ml)的2×YT培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6小時(shí)。2×YT培養(yǎng)基配方(g/L)為蛋白胨∶酵母粉∶NaCl＝16∶10∶5。
再把培養(yǎng)的細(xì)菌按1∶40接入含有氨芐青霉素(100μg/ml)的半合成培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。32C培養(yǎng)5-7小時(shí)；升溫至42℃培養(yǎng)4-5小時(shí)。用恒流泵以0.2ml/min/L培養(yǎng)基添加補(bǔ)料，溶解氧控制在30～50％之間。得到約20-30克/升發(fā)酵液的濕菌體。半合成發(fā)酵培養(yǎng)基中配方(g/L)為蛋白胨∶酵母粉∶KH2PO4∶K2HPO4∶Na2HPO4·12H2O∶(NH4)2SO4∶NH4Cl＝5∶5∶2∶4∶7∶1.2∶0.2；發(fā)酵補(bǔ)料配方(g/L)為葡萄糖∶酵母粉∶蛋白胨∶MgSO4·7H2O＝200∶70∶70∶5.7。
超聲破碎發(fā)酵菌體，上清用0.22μm的濾膜過濾；再用3×20cm的TALON Metal AffinityRsins(Clontech公司)柱行金屬親合層析，10mmol/L咪唑，pH7.0，洗5個(gè)床體積以洗脫雜蛋白，再以100mmol/L咪唑，pH7.0，洗5個(gè)床體積以洗脫Apo-2L I100；Sephacryl S-200進(jìn)一步純化Apo-2L I100，即可得到高純度Apo-2L I100。
表1.Apo-2L I基因核苷酸序列表1 CCT CAC TGA CTA TAA AAG AAT AGA GAA GGA AGG GCT TCA GTG ACC GGC TGC CTG GCT GAC 6061 TTA CAG CAG TCA GAC TCT GAC AGG ATC ATG GCT ATG ATG GAG GTC CAG GGG GGA CCC AGC 120121 CTG GGA CAG ACC TGC GTG CTG ATC GTG ATC TTC ACA GTG CTC CTG CAG TCT CTC TGT GTG 180181 GCT GTA ACT TAC GTG TAC TTT ACC AAC GAG CTG AAG CAG ATG CAG GAC AAG TAC TCC AAA 240241 AGT GGC ATT GCT TGT TTC TTA AAA GAA GAT GAC AGT TAT TGG GAC CCC AAT GAC GAA GAG 300301 AGT ATG AAC AGC CCC TGC TGG CAA GTC AAG TGG CAA CTC CGT CAG CTC GTT AGA AAG GAA 360361 AAG CAA CAA AAT ATT TCT CCC CTA GTG AGA GAA AGA GGT CCT CAG AGA GTA GCA GCT CAC 420421 ATA ACT GGG ACC AGA GGA AGA AGC AAC ACA TTG TCT TCT CCA AAC TCC AAG AAT GAA AAG 480481 GCT CTG GGC CGC AAA ATA AAC TCC TGG GAA TCA TCA AGG AGT GGG CAT TCA TTC CTG AGC 540541 AAC TTG CAC TTG AGG AAT GGT GAA CTG GTC ATC CAT GAA AAA GGG TTT TAC TAC ATC TAT 600601 TCC CAA ACA TAC TTT CGA TTT CAG GAG GAA ATA AAA GAA AAC ACA AAG AAC GAC AAA CAA 660661 ATG GTC CAA TAT ATT TAC AAA TAC ACA AGT TAT CCT GAC CCT ATA TTG TTG ATG AAA AGT 720721 GCT AGA AAT AGT TGT TGG TCT AAA GAT GCA GAA TAT GGA CTC TAT TCC ATC TAT CAA GGG 780781 GGA ATA TTT GAG CTT AAG GAA AAT GAC AGA ATT TTT GTT TCT GTA ACA AAT GAG CAC TTG 840841 ATA GAC ATG GAC CAT GAA GCC AGT TTT TTT GGG GCC TTT TTA GTT GGC TAA CTG ACC TGG 900901 AAA GAA AAA GCA ATA ACC TCA AAG TGA CTA TTC AGT TTT CAG GAT GAT ACA CTA TGA AGA 960961 TGT TTC AAA AAA TCT GAC CAA AAC AAA CAA ACA GAA AAC AGA AAA CAA AAA AAC CTC TAT 10201021 GCA ATC TGA GTA GAG CAG CCA CAA CCA AAA AAT TCT ACA ACA CAC ACT GTT CTG AAA GTG 10801081 ACT CAC TTA TCC CAA GAA AAT GAA ATT GCT GAA AGA TCT TTC AGG ACT CTA CCT CAT ATC 11401141 AGT TTG CTA GCA GAA ATC TAG AAG ACT GTC AGC TTC CAA ACA TTA ATG CAA TGG TTA ACA 12001201 TCT TCT GTC TTT ATA ATC TAC TCC TTG TAA AGA CTG TAG AAG AAA GCG CAA CAA TCC ATC 12601261 TCT CAA GTA GTG TAT CAC AGT AGT AGC CTC CAG GTT TCC TTA AGG GAC AAC ATC CTT AAG 13201321 TCA AAA GAG AGA AGA GGC ACC ACT AAA AGA TCG CAG TTT GCC TGG TGC AGT GGC TCA CAC 13801381 CTG TAA TCC CAA CAT TTT GGG AAC CCA AGG TGG GTA GAT CAC GAG ATC AAG AGA TCA AGA 14401441 CCA TAG TGA CCA ACA TAG TGA AAC CCC ATC TCT ACT GAA AGT GCA AAA ATT AGC TGG GTG 15001501 TGT TGG CAC ATG CCT GTA GTC CCA GCT ACT TGA GAG GCT GAG GCA GGA GAA TCG TTT GAA 15601561 CCC GGG AGG CAG AGG TTG CAG TGT GGT GAG ATC ATG CCA CTA CAC TCC AGC CTG GCG ACA 16201621 GAG CGA GAC TTG GTT TCA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAC TTC AGT AAG TAC GTG TTA TTT 16801681 TTT TCA ATA AAA TTC TAT TAC AGT ATG TCA AAA AAA AAA AAA AAA AA 1727表2.Apo-2LI氨基酸序列表1 MAMMEVQGGP SLGQTCVLIV IFTVLLQSLC VAVTYVYFTN ELKQMQDKYS KSGIACFLKE DDSYWDPNDE 7071 ESMNSPCWQV KWQLRQLVRK EKQQNISPLV RERGPQRVAA HITGTRGRSN TLSSPNSKNE KALGRKINSW 140141 ESSRSGHSFL SNLHLRNGEL VIHEKGFYYI YSQTYFRFQE EIKENTKNDK QMVQYIYKYT SYPDPILLMK 210211 SARNSCWSKD AEYGLYSIYQ GGIFELKEND RIFVSVTNEH LIDMDHEASF FGAFLVG 26權(quán)利要求
1.一種腫瘤凋亡素2配體全基因即Apo-2L I基因，其特征在于編碼序列由801個(gè)核苷酸組成，與編碼281個(gè)氨基酸的腫瘤凋亡素2配體基因即Apo-2L基因序列相比，少了位于后者編碼序列5’端第271-313位的42個(gè)核苷酸。
2.權(quán)利要求1所述的Apo-2L I基因編碼的腫瘤凋亡素2配體Apo-2L I，其特征是由267個(gè)氨基酸組成，與281個(gè)氨基酸組成的腫瘤凋亡素2配體Apo-2L相比，少了位于后者N端第91-104位的14個(gè)氨基酸。
3.權(quán)利要求1所述Apo-2L I基因用以制備腫瘤凋亡素Apo-2L I100的方法，其特征在于以Apo-2L I基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增得Apo-2L I100基因，再以pBV220構(gòu)建pBV-Apo-2L I100表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化，建立工程菌，所表達(dá)的Apo-2L I100直接有生物學(xué)活性。
4.權(quán)利要求2、3所述腫瘤凋亡素2配體Apo-2L I或腫瘤凋亡素Apo-2L I100用于制備殺傷腫瘤細(xì)胞藥物或制劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域,是從中國人外周血單個(gè)核細(xì)胞獲得的一種新型腫瘤凋亡素2配體全基因,即Apo－2L I基因;并利用該基因制備人可溶性腫瘤凋亡素蛋白,即腫瘤凋亡素或稱Apo－2L I
文檔編號(hào)C12N15/12GK1367248SQ02110880
公開日2002年9月4日 申請日期2002年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月22日
發(fā)明者王梁華, 焦炳華 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)