一種治療腫瘤的藥物及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗腫瘤藥物及含有這種藥物的藥物組合物和試劑盒，同時(shí)也公開(kāi)了制備這種抗腫瘤藥物的方法。本發(fā)明中的抗腫瘤藥物具有體內(nèi)代謝的穩(wěn)定性，可用于治療腫瘤或制備抗腫瘤藥物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種治療腫瘤的藥物及其應(yīng)用
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年I月19日，申請(qǐng)?zhí)枮?00780010122.7，發(fā)明名稱(chēng)為“一種治療腫瘤的藥物及其應(yīng)用”的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種具有生物活性和代謝穩(wěn)定性的含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物和緩釋制劑以及它的制備方法。本發(fā)明還提供含有這種血管內(nèi)皮抑制素復(fù)合物和緩釋制劑的藥物組合物以及含有這種血管內(nèi)皮抑制素復(fù)合物的試劑盒。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明中的血管內(nèi)皮抑制素復(fù)合物、緩釋制劑、藥物組合和試劑盒來(lái)預(yù)防、診斷、治療腫瘤，及制備抗腫瘤藥物的方法。

【背景技術(shù)】
[0003]新生血管形成是指新的毛細(xì)血管在原有的血管上的生成。腫瘤的生長(zhǎng)和遷移依賴(lài)于新生血管的生成，將腫瘤中的微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為癌癥治療的靶點(diǎn)為治療腫瘤提供了一種治療方式(Folkman J.N Engl J Medl971; 285:1182-1186)。
[0004]血管內(nèi)皮抑制素(Endostatin)是膠原X VDI羧基端的一段分子量大小為20kDa的酶切產(chǎn)物。1997年美國(guó)哈佛大學(xué)Judah Folkman教授等人在血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)此蛋白，它具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，和體內(nèi)血管生成的活性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組血管內(nèi)皮抑制素可以抑制老鼠體內(nèi)多種腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，甚至能完全治愈腫瘤，而且不產(chǎn)生耐藥性。其發(fā)揮活性的機(jī)理在于它通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制了腫瘤組織附近的新生血管的生成，使得腫瘤組織得不到生長(zhǎng)所必需的大量營(yíng)養(yǎng)和氧氣，最后停止生長(zhǎng)或壞死(Folkman J.et al.Cel 11997; 88:277-285; Folkman J.etal.Naturel997;390:404-407)。通過(guò)基因工程制備的重組人血管內(nèi)皮抑制素可以作為腫瘤治療藥物，其臨床試驗(yàn)表明它可以有效的抑制腫瘤生長(zhǎng)。在中國(guó)，以非小細(xì)胞肺癌為主要適應(yīng)癥的臨床試驗(yàn)表明它對(duì)于腫瘤的治療效果比較突出。
[0005]多肽和蛋白質(zhì)類(lèi)藥物相比于化學(xué)藥具有毒副作用小，不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。為了達(dá)到最高的體內(nèi)活性，提高生物利用度，減少藥物體內(nèi)降解，通常蛋白藥物采用靜脈給藥方式。但是對(duì)于分子量小的蛋白來(lái)說(shuō)，通常靜脈給藥以后的體內(nèi)半衰期很短。除了體內(nèi)的蛋白降解過(guò)程以外，一個(gè)重要的方面是小分子蛋白能夠通過(guò)腎過(guò)濾的途徑從體內(nèi)很快的被消除。在血液中，水力半徑超過(guò)白蛋白或是分子量大于約66，000道爾頓(66kDa)的蛋白通常可以穩(wěn)定的保留在循環(huán)系統(tǒng)中。但是小分子卻會(huì)通過(guò)腎小球過(guò)濾被很快的從血液中消除。所以，為了維持小分子量蛋白在血液中的有效治療濃度，需要進(jìn)行頻繁的注射或點(diǎn)滴。這種治療方式雖然能達(dá)到治療的目的，但是卻給病人帶來(lái)了嚴(yán)重的不便與痛苦，提高了用藥成本，對(duì)某些藥物長(zhǎng)期的使用還有可能產(chǎn)生一些副作用，例如免疫反應(yīng)。
[0006]作為蛋白藥物的血管內(nèi)皮抑制素同樣存在半衰期短，體內(nèi)清除率高的缺點(diǎn)。目前的臨床用藥手段主要為頻繁的靜脈注射或點(diǎn)滴，通常為每天給藥，而且需要長(zhǎng)期用藥，這使得病人的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)都比較大。本發(fā)明的目的就在于改善該蛋白的體內(nèi)代謝特征，使其具有更高的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，甚至具有更高療效，從而達(dá)到可以減少用藥頻率，降低用藥成本，減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的目的。
[0007]用高分子聚合物對(duì)蛋白進(jìn)行修飾，它是改變和控制藥物的動(dòng)力學(xué)特性如半衰期、免疫學(xué)特征、毒理特性的常用方法。用來(lái)修飾蛋白的高分子聚合物具有水溶性好、生物相容性好、無(wú)或弱免疫原性等特征。其中聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是應(yīng)用最為普遍的一種蛋白修飾分子。聚乙二醇分子具有兩親性，既可以溶解于水，又可以溶解于大多數(shù)的有機(jī)溶劑，具有無(wú)毒、無(wú)免疫原性、在水溶液中有高溶解性等性質(zhì)，是被包括美國(guó)FDA、中國(guó)SFDA在內(nèi)的很多國(guó)家的藥品管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的可用于藥物制備的高分子。將蛋白質(zhì)與親水性的高分子如聚乙二醇偶聯(lián)，可增加蛋白穩(wěn)定性、減少非特異性吸附和抗原性。當(dāng)偶聯(lián)物達(dá)到一定分子量時(shí)，可大大降低腎臟的排除效率，是延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)半衰期的有效方法(Frokjaer S.et al.Nat.Rev.Drug Discov.2005Apr4 (4): 298-306;Harris JM.et al.Nat.Rev.Drug Discov.2003Mar2 (3):214-21)。最初的聚乙二醇修飾都是以氨基作為反應(yīng)位點(diǎn)，主要包括蛋白的N端α -氨基和賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基。這一類(lèi)反應(yīng)的產(chǎn)物是一個(gè)蛋白分子與一個(gè)或多個(gè)PEG分子偶聯(lián)。對(duì)于賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈氨基上的修飾也往往因?yàn)榉磻?yīng)位點(diǎn)不特異而產(chǎn)生修飾后的同分異構(gòu)體。目前，針對(duì)蛋白N端α-氨基和賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈氨基的等電點(diǎn)差異，又新開(kāi)發(fā)出了只針對(duì)蛋白N端修飾的聚乙二醇修飾試劑，使得修飾位點(diǎn)一致，修飾產(chǎn)物組成均一。另一種可用于聚乙二醇修飾的蛋白位點(diǎn)是半胱氨酸的巰基。由于巰基在蛋白中的數(shù)目通常少于氨基，所以這類(lèi)修飾的位點(diǎn)更加特異。利用基因工程技術(shù)，現(xiàn)在可以在蛋白任何部位引入半胱氨酸作為特異的修飾位點(diǎn)。但是此類(lèi)引入半胱氨酸作為修飾位點(diǎn)也是有一定的局限性，因?yàn)閷?duì)某些本身帶有半胱氨酸的蛋白可能會(huì)造成二硫鍵的錯(cuò)配或無(wú)法復(fù)性。另外蛋白的羧基也是一種常用的修飾位點(diǎn)(Veronese FM et al.Drug Discov.Today.2005Novl; 10 (21): 1451-8.)。聚乙二醇修飾技術(shù)已經(jīng)成功地運(yùn)用在許多蛋白類(lèi)藥物上，比較成功的包括:PEG-天冬酰胺酶(PEG-asparaginase) (Gra ham ML Adv.Drug Deliv.Rev.55, 1293 - 1302Avramis Vassil1s1.et al.W09939732and US6689762)、PEG-腺酐脫氨酶(PEG-adenosine deaminase) (Levy Yet al.J.Pediatr.113, 312 - 317; Davis S et al.ClinExp.Tmmunol.46:649-652; HershfieldMS et al.N Engl J Med316: 589-596)和 PEG-干擾素(PEG-1nterferon a 2a、PEG-1nterferon a 2b 等)(Bailon P et al.C.B1conjug.Chem.12, 195 - 202, Wang YS etal.Adv.Drug Deliv.Rev.54, 547 - 570,Meng Xiantai et al.W02005077421, Van VlasselaerPeter et al.W02004076474, Ballon Pascal Sebastian et al.US2004030101, KarasiewiczRobert et al.EP0593868)等等。
[0008]其他代表性的高分子修飾劑有葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、乙二酸和丙二酸的共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚1，3_乙二醇次甲基醚、乙烯和順丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、環(huán)糊精等。
[0009]將血液蛋白或其片段作為載體，與藥用蛋白偶聯(lián)或融合表達(dá)，從而起到增加蛋白分子量的目的，是另一種延長(zhǎng)藥用半衰期的方法。例如用免疫球蛋白的Fe片段和目的蛋白偶聯(lián)以延長(zhǎng)其半衰期，例如將此方法用在Notch I受體蛋白(Kitajewsky Jan etal.TO2005111072)、促紅細(xì)胞生成素(EPO) (Gillies Stephen D et al.W02005063808)、人生長(zhǎng)激素(Kim Young Min et al.W02005047337)等蛋白上。血漿白蛋白也是一種常用的偶聯(lián)載體，可以運(yùn)用在抗生素類(lèi)，消炎類(lèi)，抗氧化物等蛋白上(Ezrin Alan M etal.WOOl 17568, Otagiri Masaki et al.EP1571212)。
[0010]對(duì)于某些血液載體蛋白除了在體外將其與藥物蛋白偶聯(lián)在一起外，還可以先將蛋白藥物在體外進(jìn)行修飾，使之具有化學(xué)反應(yīng)的活性或是對(duì)體內(nèi)其他分子具有較高的親和力，能夠在進(jìn)入體內(nèi)以后和血液某些成分進(jìn)行反應(yīng)，形成半衰期較長(zhǎng)的大分子或是復(fù)合物。一個(gè)實(shí)例是將此技術(shù)運(yùn)用在抗病毒的小肽分子ant1-RSV上，將其修飾上帶有馬來(lái)酰亞胺的活性基團(tuán)，它可以和血液蛋白或是細(xì)胞表面蛋白中的巰基反應(yīng)(Bridon Dominique P etal.W00069902)。另一個(gè)實(shí)例是利用?；磻?yīng)，在蛋白表面的氨基酸殘基上引入脂肪酸，增加蛋白對(duì)體內(nèi)白蛋白的親和力，使得蛋白進(jìn)入血液后可以和白蛋白形成較大的復(fù)合物，從而達(dá)到延長(zhǎng)半衰期的目的，這一方法曾用于長(zhǎng)效胰島素上(Kurtzhals P et al.B1chem.J.(1995)312, 725-731;Frokjaer Set al.Nat Rev Drug Discov.2005Apr;4(4):298-306)。
[0011]另一種延長(zhǎng)蛋白體內(nèi)半衰期的方法是將蛋白做成緩釋劑型。將蛋白藥物放入一種藥用載體中，使得蛋白從載體中緩慢釋放，在體內(nèi)維持一種穩(wěn)定的藥物濃度。常用的方法有水凝膠、微膠囊、微球、微型滲透泵、脂質(zhì)體等(P印pas NA etal.Eur.J.Pharm.B1pharm.50, 27 - 46(2000) ；Packhaeuser CB et al.Eur.J.Pharm.B1pharm.58, 445 - 455 (2004) ；Metselaar JM et al.Mini Rev.Med.Chem.4, 319 -329(2002))。脂質(zhì)體是一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)的空球形態(tài)的超顯微粒子。該雙層膜由兩親分子多為磷脂構(gòu)成并有水性的內(nèi)腔。將親水性的蛋白藥物包裹在脂質(zhì)體的內(nèi)腔中，在體內(nèi)緩慢釋放，可以維持蛋白的血藥濃度，達(dá)到增加半衰期的作用。一些實(shí)例包括用在神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Hou Xinpu et al.CN1616087)、血紅蛋白(Farmer Martha C et al.US4911929)等。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明提供一種修飾物與血管內(nèi)皮抑制素形成的復(fù)合物，其中所述修飾物能夠延長(zhǎng)血管內(nèi)皮抑制素的體內(nèi)半衰期。用于本發(fā)明的修飾物可與血管內(nèi)皮抑制素通過(guò)共價(jià)鍵連接。這些修飾物可選自高分子聚合物、蛋白質(zhì)分子或其片段、肽鏈、小分子或其他化學(xué)物質(zhì)?？捎糜诒景l(fā)明的高分子聚合物例如為聚乙二醇，所述聚乙二醇分子的平均分子量位于
I,000到100，000道爾頓之間，優(yōu)選5，000到40，000道爾頓之間。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，所述復(fù)合物的特征為一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子和一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)。
[0015]在本發(fā)明的由聚乙二醇與血管內(nèi)皮抑制素形成的復(fù)合物中，偶聯(lián)的位點(diǎn)是血管內(nèi)皮抑制素的N端α-氨基、賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈的ε-氨基、半胱氨酸殘基側(cè)鏈的巰基、天冬氨酸殘基側(cè)鏈的羧基、谷氨酸殘基側(cè)鏈的羧基中的一種或是他們的組合。優(yōu)選地，所述偶聯(lián)位點(diǎn)為血管內(nèi)皮抑制素N端的α-氨基。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物的一個(gè)實(shí)施方式，血管內(nèi)皮抑制素分子與一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)的位點(diǎn)是血管內(nèi)皮抑制素N端α-氨基或野生型人血管內(nèi)皮抑制素75、95、106、117、183位的賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈上的ε -氨基或其組合。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物的一個(gè)實(shí)施方式，血管內(nèi)皮抑制素分子與一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)方法為在血管內(nèi)皮抑制素分子內(nèi)部或其N(xiāo)末端或C末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽鏈，使得偶聯(lián)位點(diǎn)為附加的半胱氨酸殘基側(cè)鏈上的巰基。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物的一個(gè)實(shí)施方式，血管內(nèi)皮抑制素分子與一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)的位點(diǎn)是血管內(nèi)皮抑制素天冬氨酸或谷氨酸殘基側(cè)鏈上的羧基。
[0019]用于本發(fā)明的復(fù)合物的蛋白選自白蛋白、免疫球蛋白、甲狀腺結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原或它們的片段。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，所述復(fù)合物是白蛋白偶聯(lián)的血管內(nèi)皮抑制素，其特征為一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子和一個(gè)或多個(gè)白蛋白偶聯(lián)，該偶聯(lián)物可以是通過(guò)化學(xué)修飾得到的，或是通過(guò)融合表達(dá)得到的，或是通過(guò)其他方法得到的，其中的白蛋白優(yōu)選人血清白蛋白或其片段。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，所述復(fù)合物是免疫球蛋白Fe片段偶聯(lián)的血管內(nèi)皮抑制素，其特征為一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子和一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白Fe片段偶聯(lián)，該偶聯(lián)物可以是通過(guò)化學(xué)修飾得到的，或是通過(guò)融合表達(dá)得到的，或是通過(guò)其他方法得到的，其中的Fe片段優(yōu)選人免疫球蛋白IgG中的Fe區(qū)域的片段。
[0021]本發(fā)明的復(fù)合物還包括小分子或是小肽或是其他化合物修飾的血管內(nèi)皮抑制素，其特征是該復(fù)合物具有同體內(nèi)其他分子或成分反應(yīng)或結(jié)合的活性，使得該聚合物可以在體內(nèi)和其他成分形成更大的復(fù)合物。所述具有反應(yīng)活性的基團(tuán)可以和血液成分的氨基、羥基、巰基反應(yīng)形成共價(jià)鍵。這些具有反應(yīng)活性的基團(tuán)例如是是馬來(lái)酰亞胺，它可以和血液成分，例如白蛋白中的巰基反應(yīng)。這樣，本發(fā)明的復(fù)合物將與血液某些成分，例如白蛋白、免疫球蛋白有較強(qiáng)的親和力，能相互形成更大的復(fù)合物。
[0022]本發(fā)明的復(fù)合物還包括其他分子或是小肽修飾的血管內(nèi)皮抑制素，例如血管內(nèi)皮抑制素被糖基化、磷酸化或?；漠a(chǎn)物，其中修飾的位點(diǎn)是原來(lái)蛋白序列中存在的氨基酸殘基，或是通過(guò)突變產(chǎn)生的氨基酸殘基。
[0023]本發(fā)明的修飾物與血管內(nèi)皮抑制素形成的復(fù)合物還可以是修飾物與血管內(nèi)皮抑制素通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用形成的復(fù)合物，其中的修飾物可以是蛋白、小分子或其他化學(xué)物質(zhì)。
[0024]本發(fā)明的復(fù)合物可與生物相容性載體形成緩釋制劑。所述緩釋制劑的形式可選自微膠囊、水凝膠、微球、微型滲透泵或脂質(zhì)體。
[0025]用于本發(fā)明的復(fù)合物或緩釋制劑的血管內(nèi)皮抑制素可來(lái)源于人、鼠、或其他哺乳動(dòng)物。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】，復(fù)合物或緩釋制劑中含有的血管內(nèi)皮抑制素是野生型的人血管內(nèi)皮抑制素，其天然形式具有SEQ ID N0.1所示的序列。本發(fā)明的復(fù)合物或緩釋制劑中含有的血管內(nèi)皮抑制素當(dāng)由大腸肝菌表達(dá)時(shí)，其野生型的重組人血管內(nèi)皮抑制素具有SEQ ID N0.2的序列，其中N末端的Met在大腸肝菌表達(dá)時(shí)有時(shí)會(huì)被部分刪除，因此相應(yīng)的重組人血管內(nèi)皮抑制素具有SEQ ID N0.1的序列。
[0027]在本發(fā)明的復(fù)合物或緩釋制劑中，血管內(nèi)皮抑制素可以是血管內(nèi)皮抑制素的具有活性的片段、突變體、衍生物、異構(gòu)體或是它們的組合。優(yōu)選地，在本發(fā)明的復(fù)合物或緩釋制劑中，血管內(nèi)皮抑制素片段是具有SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、或SEQ ID N0.5序列的肽鏈。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述復(fù)合物或緩釋制劑中的血管內(nèi)皮抑制素衍生物是在野生型血管內(nèi)皮抑制素的N端或C端附加一段長(zhǎng)度為1-15個(gè)氨基酸的肽鏈形成的。例如，在本發(fā)明的復(fù)合物或緩釋制劑中，血管內(nèi)皮抑制素衍生物是在野生型人血管內(nèi)皮抑制素的N端附加一段9個(gè)氨基酸組成的含有His-tag的肽鏈MGGSHHHHH，該衍生物具有SEQ ID N0.6的序列，當(dāng)由大腸桿菌表達(dá)時(shí)其N(xiāo)末端的Met有時(shí)會(huì)被部分刪除，因此相應(yīng)的衍生物具有SEQID N0.7的序列。
[0028]本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含本發(fā)明的復(fù)合物或緩釋制劑和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還包括試劑盒，其含有本發(fā)明的復(fù)合物、組合物或緩釋制劑和使用說(shuō)明。
[0029]本發(fā)明還提供制備權(quán)利要求上述復(fù)合物的方法，其特征是用活化的聚乙二醇與血管內(nèi)皮抑制素混合，在適當(dāng)?shù)娜芤?、溫度、pH、摩爾比下反應(yīng)。優(yōu)選地，該方法中所用的pH為PH3-10。在上述方法中，可將偶聯(lián)產(chǎn)物例如用陽(yáng)離子柱純化或者用分子篩純化。
[0030]本發(fā)明也包括上述復(fù)合物、緩釋制劑、藥物組合物或試劑盒在預(yù)防、診斷或治療腫瘤中的用途，以及其在預(yù)防、診斷或治療其他疾病中的用途，所述疾病的特征為新生血管異常生成而導(dǎo)致人的組織或器官病變。
[0031]本發(fā)明還提供延長(zhǎng)血管內(nèi)皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含將能夠延長(zhǎng)血管內(nèi)皮抑制素的體內(nèi)半衰期的修飾物與血管內(nèi)皮抑制素形成復(fù)合物的步驟或者包含將血管內(nèi)皮抑制素或含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物與生物相容的物質(zhì)形成緩釋制劑的步驟。
[0032]以下結(jié)合附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，無(wú)論是前面的一般性描述還是隨后的詳細(xì)描述以及具體的實(shí)施例，均僅用于示例和解釋本發(fā)明，而無(wú)意于對(duì)要求保護(hù)的發(fā)明進(jìn)行限制。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
:
[0033]圖1:顯示野生型人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列SEQ ID N0.1。
[0034]圖2:顯示一種大腸桿菌表達(dá)的野生型重組人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列SEQID N0.2。這里N末端的Met在表達(dá)后有時(shí)會(huì)被部分刪除。若此情況發(fā)生，N末端的Met刪除后的重組人血管內(nèi)皮抑制素將具有SEQ ID N0.1的序列。
[0035]圖3:顯示一種具有活性的血管內(nèi)皮抑制素片段的序列SEQ ID N0.3。
[0036]圖4:顯示一種具有活性的血管內(nèi)皮抑制素片段的序列SEQ ID N0.4。
[0037]圖5:顯不一種具有活性的血管內(nèi)皮抑制素片段的序列SEQ ID N0.5。
[0038]圖6:顯示一種具有活性的N端附加氨基酸的重組人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列SEQ ID N0.6 (圖6A)。這里N末端的Met在表達(dá)后有時(shí)會(huì)被部分刪除。若此情況發(fā)生，N末端的Met刪除后的重組人血管內(nèi)皮抑制素將具有SEQ ID N0.7的序列(圖6B)。
[0039]圖7:20kDa聚乙二醇與具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素的N端的偶聯(lián)。反應(yīng)前后溶液用SDS-PAGE檢測(cè)，泳道1:20kDa聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素；泳道2:未修飾的血管內(nèi)皮抑制素；泳道3:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0040]圖8:20kDa聚乙二醇與具有SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素的N端的偶聯(lián)。修飾前后溶液用SDS-PAGE檢測(cè)，泳道1:未修飾血管內(nèi)皮抑制素；泳道2:20kDa聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素；泳道3:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0041]圖9:20kDa聚乙二醇修飾具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素的N端后用陽(yáng)離子柱SP純化。使用陽(yáng)離子柱SP吸附蛋白，再用氯化鈉梯度溶液洗脫，最后用還原SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。泳道1:純化前；泳道2:上樣穿透的溶液；泳道3~10:分布收集的洗脫液。
[0042]圖10:20kDa聚乙二醇修飾具有SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素的N端后用陽(yáng)離子柱SP純化。使用陽(yáng)離子柱SP吸附蛋白，再用氯化鈉梯度溶液洗脫，最后用還原SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。泳道1:純化前；泳道2:上樣穿透的溶液；泳道3~8:分布收集的洗脫液。
[0043]圖11:40kDa聚乙二醇修飾具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素的N端后用陽(yáng)離子柱SP純化。使用陽(yáng)離子柱SP吸附蛋白，再用氯化鈉梯度溶液洗脫，最后用還原SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。泳道1:純化前；泳道2:上樣穿透的溶液；泳道3~10:分布收集的洗脫液。
[0044]圖12:20kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性。SEQ2:具有SEQ ID N0.2的血管內(nèi)皮抑制素；PEG_SEQ2:20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID N0.2的血管內(nèi)皮抑制素；SEQ6:具有SEQ ID N0.6的血管內(nèi)皮抑制素；PEG-SEQ6:20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID N0.6的血管內(nèi)皮抑制素。
[0045]圖13:20kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制小鼠S180肉瘤的活性。SEQ2:具有SEQ ID N0.2的血管內(nèi)皮抑制素每天給藥；PEG_SEQ2_1:20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID N0.2序列的血管內(nèi)皮抑制素每天給藥；PEG-SEQ2-2:20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID N0.2序列的血管內(nèi)皮抑制素每?jī)商旖o藥；PEG-SEQ2-3:20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID N0.2序列的血管內(nèi)皮抑制素每三天給藥；SEQ6:具有SEQ ID N0.6的血管內(nèi)皮抑制素每天給藥；PEG-SEQ6-1:20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID N0.6序列的血管內(nèi)皮抑制素每天給藥；PEG-SEQ6-2:20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID N0.6序列的血管內(nèi)皮抑制素每?jī)商旖o藥；PEG-SEQ6-3:20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID N0.6序列的血管內(nèi)皮抑制素每三天給藥。
[0046]圖14:20kDa聚乙二醇修飾具有SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈的ε -氨基后用分子篩純化。泳道1:上樣；泳道2~10:分布收集的洗脫液。
[0047]圖15:20kDa聚乙二醇修飾具有SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈的ε-氨基后用陽(yáng)離子柱CM純化。泳道1:上樣；泳道2:穿透；泳道3~8:分布收集的洗脫液。
[0048]發(fā)明詳述
[0049]本發(fā)明提供一種具有較長(zhǎng)半衰期的血管內(nèi)皮抑制素產(chǎn)品，其在保持抑制血管生成的活性的同時(shí)，比未修飾的血管內(nèi)皮抑制素在代謝上具有更高的穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明中的血管內(nèi)皮抑制素優(yōu)選人血管內(nèi)皮抑制素。
[0050]本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及一種修飾物與血管內(nèi)皮抑制素形成的復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)“復(fù)合物”在本發(fā)明中是指修飾的血管內(nèi)皮抑制素。血管內(nèi)皮抑制素與修飾物通過(guò)共價(jià)鍵相連，或是通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物。因此，術(shù)語(yǔ)“修飾”既可以是共價(jià)鍵方式的連接，也可以是非共價(jià)鍵方式的連接。修飾物可以是通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)的方法連接到血管內(nèi)皮抑制素上的，也可以是通過(guò)融合表達(dá)的方式和血管內(nèi)皮抑制素連接到一起的。優(yōu)選的方案中這種修飾是位點(diǎn)特異性的，不會(huì)影響血管內(nèi)皮抑制素的生物活性，例如與受體的結(jié)合。該修飾產(chǎn)物具有抗新生血管生成的活性但相比于未修飾的血管內(nèi)皮抑制素在代謝上更穩(wěn)定，具有更長(zhǎng)的血液半衰期，可以作為抗新生血管生成或抗腫瘤的藥物。用于修飾的分子可以是一種或多種生物相容，能增加血管內(nèi)皮抑制素的血液半衰期的高分子聚合物、蛋白質(zhì)分子或其片段、肽鏈、或者是其他化學(xué)物質(zhì)。
[0051]這里的高分子聚合物，可以有它自己的生物活性，也可以沒(méi)有生物活性。合適的聚合物包括，但不僅限于聚烯醇類(lèi)化合物、聚醚類(lèi)化合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、二乙烯基醚與馬來(lái)酸酐的共聚物、N-(2-輕丙基-甲基丙烯酰胺(N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamide)、多聚糖類(lèi)、聚氧乙基多醇(polyoxyethylated polyol)、肝素或肝素片段、聚烴基乙二醇及其衍生物、聚烴基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羥乙基天冬酸胺(a, P-Poly ((2-hydroxyethyl)-DL-aspartamide))、聚羧酸脂(polycarboxylates)、氧化乙烯和甲醒的共聚物(poly oxyethylene-oxymethylenes)、聚丙烯酰嗎啉(polyacryloyl morpholines)、氨基化合物與氧化烯烴的共聚物、聚透明質(zhì)酸、聚環(huán)氧化物(polyoxiranes)、乙二酸與丙二酸的共聚物、聚1，3_乙二醇次甲基醚、乙烯/順丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、環(huán)糊精等。
[0052]上述的聚烯醇類(lèi)化合物包括，但不僅限于聚乙二醇(包括單甲基聚乙二醇、單羥基聚乙二醇等)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇等以及它們的衍生物。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，修飾物是聚乙二醇。一個(gè)更優(yōu)選的方案中，聚乙二醇選用單甲基聚乙二醇。
[0053]上述的聚醚類(lèi)化合物包括，但不僅限于聚烷撐二醇(HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)2O)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)等以及它們的衍生物。
[0054]上述的聚氨基酸包括，但不僅限于同種氨基酸的聚合物，兩種或兩種以上的氨基酸的共聚物，例如:聚丙氨酸。
[0055]上述的多聚糖類(lèi)包括，但不僅限于葡聚糖及葡聚糖衍生物如硫酸葡聚糖、纖維素及纖維素的衍生物(包括甲基纖維素和羧甲基纖維素)、淀粉及淀粉衍生物、聚蔗糖等。
[0056]這里適合用作修飾載體的蛋白分子優(yōu)選天然存在的蛋白或是其片段，包括但不僅限于甲狀腺結(jié)合蛋白 (thyroxine-binding protein)、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白(transthyretin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)、纖維蛋白原、免疫球蛋白、白蛋白等以及它們的片段。上述的載體蛋白優(yōu)選為人源的。上述蛋白的片段是指任何比該蛋白小但是保持了載體功能的部分。
[0057]血管內(nèi)皮抑制素與上述修飾物直接或間接共價(jià)相連，直接連接指的是血管內(nèi)皮抑制素的某一個(gè)氨基酸和載體蛋白的某一氨基酸直接相連，可以通過(guò)肽鍵或二硫鍵。間接相連指的血管內(nèi)皮抑制素和載體蛋白通過(guò)一定的化學(xué)基團(tuán)或幾個(gè)基團(tuán)的組合連接。
[0058]對(duì)于血管內(nèi)皮抑制素曾有文章公開(kāi)了使用聚乙二醇修飾的方案。牟國(guó)營(yíng)等(2005)和楊勝林等(2005)提到采用平均分子量為6或1kDa的PEG分子修飾血管內(nèi)皮抑制素，其修飾物是偶聯(lián)在血管內(nèi)皮抑制素賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈ε -氨基上的，并且為多個(gè)位點(diǎn)修飾的混合產(chǎn)物。在使用中雖然可以通過(guò)分子篩或是離子交換柱純化得到某一分子量范圍的產(chǎn)物但是產(chǎn)物也存在修飾位點(diǎn)不均一，蛋白構(gòu)象不均一的缺點(diǎn)，這是由這類(lèi)修飾試劑的反應(yīng)特性所決定的。而且這種對(duì)蛋白的多點(diǎn)修飾，會(huì)使得某些內(nèi)部氨基酸的構(gòu)像發(fā)生變化，造成蛋白活性的降低。對(duì)于生物制品藥物來(lái)說(shuō)，產(chǎn)物的均一性對(duì)于藥物毒性，免疫原型的降低都是十分重要的，而且在質(zhì)量控制上，混合物很難保證藥物每批生產(chǎn)質(zhì)量均一，藥效穩(wěn)定。因此保證藥物成分固定，構(gòu)像均一，活性穩(wěn)定，是在設(shè)計(jì)和生產(chǎn)藥物是需要重要考慮和亟待解決的問(wèn)題。
[0059]本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素，其特征為一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子和一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)。偶聯(lián)的位點(diǎn)是蛋白的N端α-氨基、賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈的ε -氨基、半胱氨酸的巰基、天冬氨酸殘基側(cè)鏈的羧基、谷氨酸殘基側(cè)鏈的羧基中的一種或是他們的組合。所有用于偶聯(lián)的聚乙二醇分子可以是線(xiàn)性的，也可以是分叉的，分子量位于1，OOO到100，000道爾頓之間，優(yōu)選5，000到40，000道爾頓。本發(fā)明中所述的聚乙二醇的分子量是指大約的平均的分子量。
[0060]聚乙二醇修飾雖然改變藥物代謝特性的優(yōu)勢(shì)，但是通常這種修飾也會(huì)使得大分子藥物的生物活性降低，主要原因是在于不同的修飾位點(diǎn)對(duì)藥物本身的結(jié)構(gòu)的改變和對(duì)活性部位的屏蔽[Veronese F., et al.Drug Discovery Today, 10, 21, 2005]。例如用不同的 PEG化修飾試劑對(duì)干擾素β -1b進(jìn)行修飾后，不同修飾手段均導(dǎo)致修飾后的干擾素的活性的降低，最優(yōu)的方案也僅僅達(dá)到原蛋白活性的71%，有些修飾方式甚至使得蛋白幾乎沒(méi)有活性(Filpula D., et al.B1conjugate Chem.2006, 17, 618-630)。所以雖然修飾改變了藥代學(xué)特征，但是對(duì)藥物本身的活性保持卻不利，所以通常在選擇修飾方法和修飾試劑時(shí)，都需要綜合考慮這兩方面的因素，使得藥物在體內(nèi)的綜合效果最好。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，使用蛋白N端特異的聚乙二醇修飾試劑(mPEG-ButyrALD, Nektar)來(lái)修飾重組人血管內(nèi)皮抑制素。其產(chǎn)物為一個(gè)聚乙二醇與一個(gè)重組人血管內(nèi)皮抑制素相連，連接位點(diǎn)為蛋白的N端α -氨基。在文獻(xiàn)(Filpula D., et al.B1conjugate Chem.2006, 17, 618-630沖,使用相同的該試劑，得到的N端修飾的聚乙二醇干擾素β -1b的體外活性只有原始蛋白活性的70%左右。在本發(fā)明中，我們驚奇的發(fā)現(xiàn)N端修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素其產(chǎn)物在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移的抑制率是未修飾蛋白的2倍或以上，既蛋白的生物活性有了很大的提高，這種體外活性明顯增加的現(xiàn)象尚未見(jiàn)報(bào)道。而牟國(guó)營(yíng)等(2005)得到的多修飾的內(nèi)皮抑制素的體外活性明顯的隨著修飾反應(yīng)的進(jìn)行而逐漸降低。這說(shuō)明利用本發(fā)明涉及到反應(yīng)和純化方法所的得到的產(chǎn)物比相關(guān)報(bào)道有更好的體外活性。而另一方面，通過(guò)對(duì)人血管內(nèi)皮抑制素進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析人們發(fā)現(xiàn)，在人血管內(nèi)皮抑制素的N末端有一個(gè)鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)，由野生型人血管內(nèi)皮抑制素中的第1，3，11，76位的氨基酸組成，據(jù)文獻(xiàn)(Ding，Y.H.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.95，10443-10448 ；Hohenester, E.，EMBO J.17，1656-1664 ；Boehm, T., B1chem.B1 phys.Res.Commun.252, 190-194 ；Ricard-Blum, S., J.B1l.Chem.279，2927-2936 ；Tjin Tham Sjin, R.M.，Cancer Res.65(9): 3656-63。)報(bào)道，該結(jié)合位點(diǎn)對(duì)人血管內(nèi)皮抑制素的穩(wěn)定性和活性至關(guān)重要，甚至是人血管內(nèi)皮抑制素發(fā)揮活性時(shí)與受體相結(jié)合的部位。由于PEG是一個(gè)分子量很大的分子，空間位阻很大，通常認(rèn)為對(duì)蛋白的化學(xué)修飾不宜在蛋白的活性位點(diǎn)進(jìn)行，因?yàn)檫@樣對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的破壞作用很大，進(jìn)而對(duì)蛋白的活性會(huì)有很大的影響。但是本發(fā)明的這個(gè)產(chǎn)物不但沒(méi)有活性的喪失，反而出乎意料的顯示出更高的活性，這在現(xiàn)有的知識(shí)背景下很難預(yù)測(cè)。
[0061]本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及血管內(nèi)皮抑制素和蛋白或肽鏈的偶聯(lián)，其特征為血管內(nèi)皮抑制素與一個(gè)或多個(gè)蛋白或肽鏈直接或間接相連，當(dāng)與多個(gè)載體蛋白相連時(shí)，所選的載體蛋白之間可以相同也可以是不同的。其中的載體蛋白優(yōu)選天然存在的蛋白或是其片段。一個(gè)優(yōu)選的方案中用于修飾的載體蛋白為人血清白蛋白或其片段。在另一個(gè)優(yōu)選的方案中的載體蛋白為人免疫球蛋白IgG的Fe片段。
[0062]本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中的修飾物為小分子或是小肽或是其他化合物，其特征為能使含有內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物具有和血液某些成分反應(yīng)的能力或是和血液某些成分有較強(qiáng)的親和力。一種具體化的產(chǎn)物是它具有一個(gè)反應(yīng)活性的基團(tuán)，可以和血液成分的氨基、羥基、巰基反應(yīng)形成共價(jià)鍵。另一個(gè)具體化產(chǎn)物的活性基團(tuán)是一個(gè)馬來(lái)酰亞胺，它可以和血液蛋白，例如白蛋白中的巰基反應(yīng)。另一個(gè)具體化產(chǎn)物是具有和血液某些成分，例如白蛋白、免疫球蛋白等有較強(qiáng)的親和力，可以與之形成一種更大的復(fù)合體。
[0063]本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中的復(fù)合物，是其他小分子或是小肽修飾的血管內(nèi)皮抑制素，可以是血管內(nèi)皮抑制素被糖基化、磷酸化、?；群蟮漠a(chǎn)物。其中修飾的位點(diǎn)可以是原來(lái)蛋白序列中存在的氨基酸，也可以是通過(guò)突變產(chǎn)生的氨基酸殘基。該復(fù)合物雖然沒(méi)有很大的分子量，但是因?yàn)樾揎椄淖兞搜軆?nèi)皮抑制素的性質(zhì)從而延長(zhǎng)了其半衰期。
[0064]本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方案涉及一種含有內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物，它是由血管內(nèi)皮抑制素和其他分子通過(guò)非共價(jià)鍵形成的具有特定組成的復(fù)合物分子，其中的修飾物可以是蛋白，小分子等。該復(fù)合物具有抑制血管生成的活性，并且在體內(nèi)有比血管內(nèi)皮抑制素更長(zhǎng)的半衰期。
[0065]本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方案涉及一種含有血管內(nèi)皮抑制素的緩釋制劑，它是由血管內(nèi)皮抑制素或上述的任一復(fù)合物和生物相容的物質(zhì)形成的。該組合物中的血管內(nèi)皮抑制素仍然具有生物活性，但是卻可以依靠該載體改變藥物代謝特征達(dá)到延長(zhǎng)體內(nèi)保留時(shí)間的目的。所述的緩釋制劑為但不僅限于微膠囊、水凝膠、微球、微型滲透泵、脂質(zhì)體等。
[0066]本發(fā)明還提供一種上述含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物或緩釋制劑與藥學(xué)上可接受的載體形成的藥物組合物。本發(fā)明還提供一種上述含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物或緩釋制劑和使用說(shuō)明組成的試劑盒。
[0067]本文使用的藥學(xué)上可接受的載體包括對(duì)于以所用劑量和濃度與其接觸的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物無(wú)毒的藥用上可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑。通常生理學(xué)上可接受的載體是含水的PH緩沖溶液。生理學(xué)上可接受的載體的例子包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有機(jī)酸在內(nèi)的緩沖液；包括抗壞血酸在內(nèi)的抗氧化劑；低分子量(不超過(guò)10個(gè)殘基)多肽；諸如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白等蛋白質(zhì)；諸如聚乙烯吡咯烷酮等親水性多聚體；諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴(lài)氨酸等氨基酸；單糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖、或糊精等其他糖類(lèi)；諸如EDTA等螯合劑；諸如甘露醇或山梨醇等糖醇；諸如鈉等成鹽反離子；
和/或諸如TWEEN?、聚乙二醇(PEG)、和PLURONICS?等非離子表面活性劑。賦形劑優(yōu)選是無(wú)菌的且一般不含不良物質(zhì)。這些組合物可通過(guò)常規(guī)的熟知滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。
[0068]本發(fā)明還涉及到制備上述血管內(nèi)皮抑制素產(chǎn)品的方法。特別的，制備聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素的方法，即將活化的聚乙二醇與血管內(nèi)皮抑制素混合，在適當(dāng)?shù)娜芤?、溫度、pH、摩爾比下反應(yīng)，并用陽(yáng)離子柱或是分子篩純化偶聯(lián)產(chǎn)物。其中反應(yīng)的pH優(yōu)選PH3-10 之間。
[0069]本發(fā)明還提供一種上述含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物、緩釋制劑、藥物組合物或試劑盒在預(yù)防、診斷或治療腫瘤中的用途。本方法適合的癌癥包括但不僅限于肺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、結(jié)腸癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宮頸癌、肉瘤、腎癌、膽癌、惡性黑色素腫瘤等。
[0070]本發(fā)明還提供一種上述含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物、藥物組合物或緩釋制劑在制備抗腫瘤藥物中的用途。
[0071]本發(fā)明還提供一種上述含有血管內(nèi)皮抑制素的復(fù)合物、緩釋制劑、藥物組合物或試劑盒在預(yù)防、診斷或治療其他疾病和制備治療這些疾病的藥物中的用途，所述疾病的特征為但不限于新生血管異常生成而導(dǎo)致人的組織或器官病變。
[0072]在上述的治療腫瘤或其他疾病的用途中，其中的給藥方式選自靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、透皮吸收、皮下包埋、肝動(dòng)脈注射、口服、鼻粘膜給藥、口腔粘膜給藥、眼部給藥、直腸給藥、陰道給藥或其他臨床給藥方式。
[0073]本發(fā)明還提供一種延長(zhǎng)血管內(nèi)皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含將修飾物與血管內(nèi)皮抑制素形成復(fù)合物的步驟和制備含有血管內(nèi)皮抑制素的緩釋制劑的步驟。
[0074]實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明中的一個(gè)產(chǎn)品聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的復(fù)合物，具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小鼠腫瘤生長(zhǎng)的活性，與未修飾的人血管內(nèi)皮抑制素相比，活性明顯提高，并且體內(nèi)藥代學(xué)研究表明修飾產(chǎn)物能有效的減緩藥物在體內(nèi)的代謝，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期。
[0075]本發(fā)明中提到的血管內(nèi)皮抑制素，除了特別說(shuō)明以外，其來(lái)源可以是人，鼠，或其他哺乳動(dòng)物，其中的優(yōu)選方案是人血管內(nèi)皮抑制素。發(fā)明中提到的血管內(nèi)皮抑制素，除特殊說(shuō)明以外，包括野生型的血管內(nèi)皮抑制素，即體內(nèi)自然存在的形式，或是其具有活性的突變體、片段、異構(gòu)體、衍生物等或是它們的組合。血管內(nèi)皮抑制素的來(lái)源可以是但不僅限于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的，也可以是從酵母或大腸肝菌中發(fā)酵純化而來(lái)的。其中來(lái)源于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的野生型的人血管內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；來(lái)源于酵母表達(dá)的重組人血管抑制素具有SEQ ID N0.1的序列，或是在此序列的N端有10個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)的增加或缺失；來(lái)源于大腸肝菌表達(dá)的重組人血管內(nèi)皮抑制素具有SEQ ID N0.2的序列，但其N(xiāo)末端的Met在表達(dá)后有時(shí)會(huì)被部分刪除。若此情況發(fā)生，N末端的Met刪除后的重組人血管內(nèi)皮抑制素將具有SEQ ID N0.1的序列。
[0076]血管內(nèi)皮抑制素的突變體指的是通過(guò)氨基酸的取代、缺失、增加而得到的血管內(nèi)皮抑制素分子。血管內(nèi)皮抑制素的片段是指序列屬于SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2的任何更小的部分，可以是但不限于通過(guò)酶切得到的，或是基因工程表達(dá)的，或是通過(guò)多肽合成的方法得到的。例如具有SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.5序列的片段曾被報(bào)道具有抑制小鼠實(shí)體瘤的活性(Cattaneo MG et al.Experimental Cell Research283 (2003) 230 - 236 ；Tjin Tham Sjin RM et al.Cancer Research (2005) 65 (9) 3656-3663)。血管內(nèi)皮抑制素的異構(gòu)體是指具有和野生型血管內(nèi)皮抑制素相同的氨基酸序列或分子式，但是卻有不一樣的構(gòu)象，包括蛋白二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的不同或是局部氨基酸旋光性的改變，異構(gòu)體的來(lái)源可以是天然存在的突變或是通過(guò)人為設(shè)計(jì)而得到的。血管內(nèi)皮抑制素的衍生物是指在野生型血管內(nèi)皮抑制素的基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾的產(chǎn)物，其中的修飾是指在蛋白上共價(jià)連接一個(gè)或多個(gè)其他小分子，例如磷酸分子、糖分子等，或是20個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)的小肽鏈，連接位點(diǎn)可以是蛋白內(nèi)的任意一個(gè)氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，可以是N端附加一段9個(gè)氨基酸組成的含有His-tag的肽鏈MGGSHHHHH的人血管內(nèi)皮抑制素，其具有SEQ ID N0.6的序列(LuoYongzhang et al.US2004110671)，當(dāng)由大腸桿菌表達(dá)時(shí)其N(xiāo)末端的Met在表達(dá)后有時(shí)會(huì)被部分刪除。若此情況發(fā)生，N末端的Met刪除后的重組人血管內(nèi)皮抑制素衍生物將具有SEQID N0.7的序列。血管內(nèi)皮抑制素具有活性的突變體、片段、異構(gòu)體、衍生物的組合是指同時(shí)具有兩種或兩種以上上述特征的變化的產(chǎn)物，例如但不僅限于片段的突變體、突變體的修飾產(chǎn)物等。
實(shí)施例
[0077]實(shí)施例l、20kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端的偶聯(lián)
[0078]本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。具體為將重組人血管內(nèi)皮抑制素(北京普羅吉生物科技發(fā)展有限公司)透析到pH5.5的30mM醋酸鈉溶液中。用紫外分光光度計(jì)(Agilent Technologies)在280nm波長(zhǎng)下測(cè)量蛋白濃度，然后將濃度調(diào)節(jié)到2mg/ml。與20kDa的特異修飾蛋白N端的聚乙二醇(mPEG_ButyrALD20kDa, Nektar)偶聯(lián)時(shí)，取20ml上述蛋白溶液(含蛋白40mg),加入20kDa聚乙二醇固體80mg，并室溫?cái)嚢?，直到完全溶解，使得聚乙二醇與血管內(nèi)皮抑制素的摩爾比為2:1。加入還原劑CH3BNNa (Sigma),濃度為20mM，并最后調(diào)節(jié)溶液的pH值為5。室溫靜置10小時(shí)以后大于80%的血管內(nèi)皮抑制素被單一聚乙二醇修飾，即一個(gè)聚乙二醇與一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子偶聯(lián)，并且偶聯(lián)的位點(diǎn)是血管內(nèi)皮抑制素N端的α -氨基，少量血管內(nèi)皮抑制素會(huì)被非特異性的多位點(diǎn)修飾。這時(shí)反應(yīng)液可直接用于上柱純化。反應(yīng)前后溶液電泳結(jié)果如附圖7和8所示。
[0079]實(shí)施例2、20kDa聚乙二醇修飾重組人血管內(nèi)皮抑制素N端后用陽(yáng)離子柱SP純化
[0080]本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素?！揪唧w實(shí)施方式】為將20kDa聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素用SP層析柱(Amersham)純化。將反應(yīng)后的混合液調(diào)節(jié)pH為6。層析柱用含有1mM磷酸鹽，pH值為6.0的平衡緩沖液平衡后上樣。上樣后再用含有1mM磷酸鹽，IM氯化鈉，pH6.0的洗脫緩沖液梯度洗脫，未反應(yīng)的聚乙二醇由于帶電荷極少，所以在穿透和沖洗的過(guò)程中出現(xiàn)，洗脫出峰的順序?yàn)槎嘈揎椀难軆?nèi)皮抑制素、單修飾的血管內(nèi)皮抑制素、未修飾的血管內(nèi)皮抑制素。根據(jù)280nm的紫外檢測(cè)可以收集不同的分離組分。純化結(jié)果如附圖9和10所
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[0081]實(shí)施例3、40kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端的偶聯(lián)
[0082]本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素?！揪唧w實(shí)施方式】為將重組人血管內(nèi)皮抑制素透析到pH5.5的30mM醋酸鈉溶液中。用紫外分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)下測(cè)量蛋白濃度，然后將濃度調(diào)節(jié)到 2.5mg/ml。與 40kDa 的特異修飾蛋白 N 端的聚乙二醇(mPEG_ButyrALD40kDa，Nektar)偶聯(lián)時(shí)，取20ml上述蛋白溶液(含蛋白40mg),加入40kDa聚乙二醇固體160mg,并室溫?cái)嚢瑁钡酵耆芙?，使得聚乙二醇與血管內(nèi)皮抑制素的摩爾比為2:1。加入還原劑CH3BNNa(Sigma),濃度為20mM，并最后調(diào)節(jié)溶液的pH值為5。室溫靜置10小時(shí)以后大于80%的血管內(nèi)皮抑制素被單一聚乙二醇修飾，即一個(gè)聚乙二醇與一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子偶聯(lián)，并且偶聯(lián)的位點(diǎn)是蛋白N端的α -氨基，少量血管內(nèi)皮抑制素會(huì)被非特異性的多位點(diǎn)修飾。這時(shí)反應(yīng)液可直接用于上柱純化。
[0083]實(shí)施例4、40kDa聚乙二醇修飾重組人血管內(nèi)皮抑制素N端后用陽(yáng)離子柱SP純化
[0084]本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。【具體實(shí)施方式】為將40kDa聚乙二醇血管內(nèi)皮抑制素偶聯(lián)物用SP層析柱(Amersham)純化。將反應(yīng)后的混合液調(diào)節(jié)pH為6。層析柱用含有1mM磷酸鹽，pH值為6.0的平衡緩沖液平衡后上樣。上樣后再用含有1mM磷酸鹽，IM氯化鈉，pH6.0的洗脫緩沖液梯度洗脫，未反應(yīng)的聚乙二醇由于帶電荷極少，所以在穿透和沖洗的過(guò)程中出現(xiàn)，洗脫出峰的順序?yàn)槎嘈揎椀难軆?nèi)皮抑制素、單修飾的血管內(nèi)皮抑制素、未修飾的血管內(nèi)皮抑制素。根據(jù)280nm的紫外檢測(cè)可以收集不同的分離組分。具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素純化結(jié)果如附圖11所示，具有SEQ ID N0.6序列的純化結(jié)果與SEQ IDN0.2序列的純化結(jié)果類(lèi)似，在此省略。
[0085]實(shí)施例5、20kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物在血液中的長(zhǎng)效效應(yīng)
[0086]本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。測(cè)量聚乙二醇修飾和未修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素在小鼠體內(nèi)的半衰期來(lái)檢驗(yàn)聚乙二醇修飾后的長(zhǎng)效效益。選用6只25g左右體重的健康昆明種小鼠(維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，分為兩組，每組3只，分別尾靜脈注射未修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素(北京普羅吉生物科技發(fā)展有限公司)和20kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物，劑量為15mg/kg體重。按照2、10、30分鐘、1、2、4、8、16、24、36、48、72小時(shí)的時(shí)間間隔尾靜脈取血。收集血漿，用夾心法ELISA分別測(cè)血管內(nèi)皮抑制素和聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素的濃度。體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)顯示20kD聚乙二醇修飾后，具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素在小鼠體內(nèi)的半衰期從平均4.8小時(shí)增加到平均16小時(shí)。具有SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素經(jīng)修飾以后在小鼠體內(nèi)的半衰期從平均7.5小時(shí)增加到平均16小時(shí)這表明偶聯(lián)高分子量的聚乙二醇能有效的增加重組人血管內(nèi)皮抑制素的體內(nèi)代謝的半衰期，達(dá)到長(zhǎng)效的目的。
[0087]實(shí)施例6、20kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性
[0088]本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。具體實(shí)施方案為將人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)在含10%血清的DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后饑餓細(xì)胞12小時(shí)。將細(xì)胞用胰酶(Sigma)消化以后，加入測(cè)細(xì)胞遷移的皿中，每孔細(xì)胞數(shù)10000個(gè)。遷移條件為DMEM培養(yǎng)基、1%血清、10ng/ml bFGF (Sigma)和雙抗(鏈霉素和氨節(jié)青霉素各自10 μ g/ml, Sigma)。對(duì)于加藥組分別加入血管內(nèi)皮抑制素和修飾后的血管內(nèi)皮抑制素，濃度為30 μ g/mL.37°C培養(yǎng)8小時(shí)以后，取出小皿，用1%戊二醛固定細(xì)胞，刮掉膜上層的未遷移細(xì)胞，用蘇木精對(duì)下層細(xì)胞染色。最后在顯微鏡(Olympus)下，取相同大小視野數(shù)細(xì)胞數(shù)。同一塊皿中選取三個(gè)不同視野，最后算出抑制率。結(jié)果顯示具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)細(xì)胞遷移的抑制率為42%，修飾后對(duì)細(xì)胞遷移的抑制率達(dá)到90%。具有SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)細(xì)胞遷移的抑制率為45%，修飾后對(duì)細(xì)胞遷移的抑制率達(dá)到88%。以上結(jié)果表明經(jīng)過(guò)聚乙二醇修飾后的血管內(nèi)皮抑制素不僅保持而且還大大增強(qiáng)了生物活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示。
[0089]實(shí)施例7、20kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物在小鼠腫瘤模型治療中的活性
[0090] 本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。實(shí)驗(yàn)觀察了 20kDa聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素對(duì)小鼠S180腫瘤的體內(nèi)抑制活性。實(shí)驗(yàn)材料選用20g體重的昆明小鼠，分別腋下接入S180肉瘤細(xì)胞(中國(guó)細(xì)胞庫(kù)QK10952)，每只接入細(xì)胞數(shù)2 X 16個(gè)。第二天隨機(jī)分組，每組8只，分別設(shè)定陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(血管內(nèi)皮抑制素1.5mg/kg體重，每天給藥)、三組給藥組(聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素1.5mg/kg體重，分別為每天，每?jī)商?，每三天給藥)。分組后開(kāi)始給藥，給藥方式為尾靜脈注射。給藥周期為10天，第11天處死小鼠，稱(chēng)瘤重，以抑瘤率來(lái)評(píng)價(jià)藥效，計(jì)算方法為:抑瘤率=(陰性對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/陰性對(duì)照組瘤重X 100%。對(duì)于具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率為34%，給藥組每天，每?jī)商?，每三天給藥的抑瘤率分別為:47%，53%，40%。對(duì)于具有SEQ ID N0.6序列的N端附加氨基酸的重組人血管內(nèi)皮抑制素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率為40%，給藥組每天，每?jī)商?，每三天給藥的抑瘤率分別為:45%，57%，50%。表明修飾后的重組人血管內(nèi)皮抑制素具有體內(nèi)的抑瘤活性，而且由于其體內(nèi)代謝速度減慢，使得藥效優(yōu)于未修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素，并且在延長(zhǎng)給藥間隔的情況下仍能保持藥效優(yōu)于未修飾的重組人血管內(nèi)皮抑制素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示。
[0091]實(shí)施例8、20kDa聚乙二醇修飾重組人血管內(nèi)皮抑制素賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈的ε -氨基
[0092]本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。【具體實(shí)施方式】為將重組人血管內(nèi)皮抑制素透析到ΡΗ7.8的30mM磷酸緩沖液中。用紫外分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)下測(cè)量蛋白濃度，然后將濃度調(diào)節(jié)到2mg/ml ο加入20kDa的修飾賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈ε-氨基的聚乙二醇(mPEG_SPA20kDa，Nektar)分子，使得聚乙二醇分子與蛋白的摩爾比分別為8:1。室溫放置。重組人血管內(nèi)皮抑制素能被較快的修飾，30分鐘以后80%的血管內(nèi)皮抑制劑能被修飾，隨著反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)，修飾物產(chǎn)量增多，但反應(yīng)速度在I小時(shí)以后減慢。反應(yīng)產(chǎn)物主要有單分子聚乙二醇修飾和多分子聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素。這時(shí)反應(yīng)液可直接用于上柱純化。
[0093]實(shí)施例9、20kDa聚乙二醇修飾重組人血管內(nèi)皮抑制素賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈的ε -氨基后用分子篩純化
[0094]本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素?！揪唧w實(shí)施方式】為將20kDa聚乙二醇血管內(nèi)皮抑制素偶聯(lián)物用分子篩純化。將反應(yīng)后的混合液調(diào)節(jié)pH為7.4。層析柱用含有20mM磷酸鹽，10mM氯化鈉，PH值為7.4的平衡緩沖液平衡后上樣。根據(jù)280nm的紫外檢測(cè)可以收集不同的分離組分。具有SEQ ID N0.6序列的血管內(nèi)皮抑制素的修飾產(chǎn)物的純化結(jié)果如附圖14所示。
[0095]實(shí)施例10、20kDa聚乙二醇修飾重組人血管內(nèi)皮抑制素賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈的ε-氨基后用離子柱純化
[0096]本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素?！揪唧w實(shí)施方式】為將20kDa聚乙二醇血管內(nèi)皮抑制素偶聯(lián)物用CM層析柱純化。將反應(yīng)后的混合液調(diào)節(jié)pH為6.5。層析柱用含有1mM磷酸鹽，pH值為6.5的平衡緩沖液平衡后上樣。上樣后再用含有1mM磷酸鹽，IM氯化鈉，pH6.5的洗脫緩沖液梯度洗脫。未反應(yīng)的聚乙二醇由于帶電荷極少，所以在穿透和沖洗的過(guò)程中出現(xiàn)，洗脫出峰的順序?yàn)槎嘈揎椀难軆?nèi)皮抑制素，單修飾的血管內(nèi)皮抑制素，未修飾的血管內(nèi)皮抑制素。根據(jù)280nm的紫外檢測(cè)可以收集不同的分離組分。具有SEQ ID N0.6序列的血管內(nèi)皮抑制素的修飾產(chǎn)物的純化結(jié)果如附圖15所示。
[0097]實(shí)施例ll、20kDa聚乙二醇與重組人血管內(nèi)皮抑制素N端偶聯(lián)的產(chǎn)物在小鼠腫瘤模型治療中的活性
[0098]本實(shí)施例涉及的重組人血管內(nèi)皮抑制素具有SEQ ID N0.6序列的重組人血管內(nèi)皮抑制素。實(shí)驗(yàn)觀察了 20kDa聚乙二醇(mPEG-ButyrALD20kDa，Nektar)修飾的血管內(nèi)皮抑制素增加給藥間隔時(shí)間的條件下對(duì)小鼠S180腫瘤的體內(nèi)抑制活性。實(shí)驗(yàn)材料選用20g體重的昆明小鼠，分別腋下接入S180肉瘤細(xì)胞，每只接入細(xì)胞數(shù)2 X 16個(gè)。第二天隨機(jī)分組，每組8只，分別設(shè)定陰性對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(血管內(nèi)皮抑制素1.5mg/kg體重，每5天給藥)、四組給藥組(聚乙二醇修飾的血管內(nèi)皮抑制素1.5mg/kg體重，分別為每5天，每7天，每10天，每14天給藥)。接瘤后次日開(kāi)始給藥，給藥方式為尾靜脈注射。給藥周期為14天，第15天處死小鼠，稱(chēng)瘤重，以抑瘤率來(lái)評(píng)價(jià)藥效，計(jì)算方法為:抑瘤率=(陰性對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/陰性對(duì)照組瘤重X 100%。對(duì)于具有SEQ ID N0.6序列的N端附加氨基酸的重組人血管內(nèi)皮抑制素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率為34%，給藥組每5天，每7天，每10天，每14天給藥的抑瘤率分別為:56.4%, 37.1%，31.8%，0%。表明修飾后的重組人血管內(nèi)皮抑制素在該劑量下延長(zhǎng)時(shí)間到每10天給藥仍然具有一定的體內(nèi)抑瘤活性。
【權(quán)利要求】
1.一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素分子與一個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)形成的復(fù)合物，其中聚乙二醇分子通過(guò)血管內(nèi)皮抑制素N端的α-氨基或附加的半胱氨酸殘基上的巰基與血管內(nèi)皮抑制素偶聯(lián)，所述的聚乙二醇的平均分子量為IkDa至10kDa,優(yōu)選為5_40kDa。
2.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中聚乙二醇分子的平均分子量為20kDa或40kDa。
3.權(quán)利要求2的復(fù)合物，所述聚乙二醇為平均分子量是20kDa的線(xiàn)性單甲基聚乙二醇。
4.權(quán)利要求2的復(fù)合物，所述聚乙二醇為平均分子量是40kDa的分叉聚乙二醇。
5.權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述附加的半胱氨酸殘基是連接于血管內(nèi)皮抑制素分子內(nèi)部或其N(xiāo)末端或C末端的半胱氨酸殘基，或是位于連接于血管內(nèi)皮抑制素分子內(nèi)部或其N(xiāo)末端或C末端的含有半胱氨酸的肽鏈上的半胱氨酸殘基。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中血管內(nèi)皮抑制素是哺乳動(dòng)物來(lái)源的，特別是人或鼠來(lái)源的。
7.權(quán)利要求6的復(fù)合物，其中血管內(nèi)皮抑制素具有SEQID N0.1或者SEQ ID N0.2所示的序列。
8.權(quán)利要求6的復(fù)合物，其中血管內(nèi)皮抑制素是血管內(nèi)皮抑制素的具有生物學(xué)活性的片段、突變體、衍生物、異構(gòu)體或是它們的組合。
9.權(quán)利要求8的復(fù)合物，其中血管內(nèi)皮抑制素片段具有SEQID N0.3、SEQ ID N0.4、或SEQ ID N0.5 的序列 。
10.權(quán)利要求8的復(fù)合物，其中血管內(nèi)皮抑制素衍生物是在SEQID N0.1的N端或C端附加一段長(zhǎng)度為1-15個(gè)氨基酸的肽鏈形成的。
11.權(quán)利要求10的復(fù)合物，其中血管內(nèi)皮抑制素衍生物具有SEQID N0.6或者SEQ IDN0.7的序列ο
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的復(fù)合物和生物學(xué)相容的物質(zhì)形成的緩釋制劑，所述的緩釋制劑的形式選自微膠囊、水凝膠、微球、微型滲透泵或脂質(zhì)體。
13.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的復(fù)合物或權(quán)利要求12的緩釋制劑、以及藥學(xué)上可接受的載體。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中的藥學(xué)上可接受的載體為含水的pH緩沖溶液，包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、或其他有機(jī)酸的緩沖液、抗壞血酸或其他抗氧化劑、低分子量(不超過(guò)10個(gè)殘基)多肽、血清白蛋白、明膠、免疫球蛋白或其他蛋白質(zhì)、聚乙烯吡咯烷酮或其他親水性多聚體、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、賴(lài)氨酸或其他氨基酸、單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖、糊精或其他糖類(lèi)、EDTA或其他螯合劑、甘露醇、山梨醇或其他糖醇、鈉離子或其他成鹽反離子、TWEEN?、聚乙二醇(PEG)、PLURONICS?或其他非離子表面活性劑。
15.一種預(yù)防或治療腫瘤的方法，包括給個(gè)體施用權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的復(fù)合物、權(quán)利要求12的緩釋制劑、或權(quán)利要求13或14的藥物組合物。
16.權(quán)利要求15的方法，所述腫瘤選自肺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、結(jié)腸癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宮頸癌、肉瘤、腎癌、膽癌、惡性黑色素腫瘤或其他腫瘤。
17.一種預(yù)防或治療新生血管異常生成而導(dǎo)致人的組織或器官病變的方法，包括給個(gè)體施用權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的復(fù)合物、權(quán)利要求12的緩釋制劑、或權(quán)利要求13或14的藥物組合物。
18.權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述施用選自靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝動(dòng)脈注射、口服、鼻粘膜給藥、口腔粘膜給藥、眼部給藥、直腸給藥、或陰道給藥。
19.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的復(fù)合物、權(quán)利要求12的緩釋制劑、或權(quán)利要求13或14的藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
20.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的復(fù)合物、權(quán)利要求12的緩釋制劑、或權(quán)利要求13或14的藥物組合物在制備治療新生血管異常生成而導(dǎo)致人的組織或器官病變的疾病的藥物中的用途。
21.一種延長(zhǎng)血管內(nèi)皮抑制素體內(nèi)代謝半衰期和提高其抗腫瘤療效的方法，其包括將一個(gè)血管內(nèi)皮抑制素與一個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)形成復(fù)合物，其偶聯(lián)位點(diǎn)為血管內(nèi)皮抑制素N端的α-氨基或是附加的 半胱氨酸殘基的巰基。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK104043107SQ201410160386
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日:2006年1月20日
【發(fā)明者】羅永章, 韓慶, 雷清新, 常國(guó)棟, 付彥 申請(qǐng)人:清華大學(xué), 北京普羅吉生物科技發(fā)展有限公司