馬里苷在防治丙酮醛引起的認知功能障礙中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及馬里苷在保護PC12細胞免于丙酮醛損傷，尤其是在丙酮醛引起的認知功能障礙防治中的應(yīng)用，實驗研究證明，本發(fā)明提供的馬里苷防治神經(jīng)認知功能障礙如糖尿病腦病、阿爾茨海默病等，藥效好，作用強，毒性小，預(yù)示著其良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】馬里苷在防治丙酮醛引起的認知功能障礙中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及馬里苷在保護PC12細胞免于丙酮醛損傷，尤其是在丙酮醛引起的認知功能障礙防治中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]丙酮醛是一種羰基醛，在機體中丙酮醛是一些代謝途徑的副產(chǎn)物。它的形成可能來自于蘇氨酸分解代謝的中間體3-氨基丙酮或者脂質(zhì)過氧化。而最重要的來源是糖酵解。丙酮醛來自糖酵解中間產(chǎn)物3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮的去磷酸化，而這種去磷酸化是非磷酸酶依賴性的。由于丙酮醛具有高反應(yīng)性，其糖基化活性比葡萄糖高10000-50000倍，可定向修飾蛋白質(zhì)的精氨酸殘基并與蛋白質(zhì)不可逆地結(jié)合，形成糖化蛋白(glycationprotein)而產(chǎn)生細胞毒性，因此體內(nèi)發(fā)展了多種解毒機制，其中一種就是乙二醛酶系統(tǒng)。丙酮醛(MG)大都會被機體內(nèi)普遍存在的乙二醛酶系統(tǒng)所分解代謝，而這種乙二醛酶系統(tǒng)主要是由特定的乙二醛酶I和乙二醛酶II這兩種酶構(gòu)成，通過使用一定量具有催化作用的還原型谷胱甘肽(GSH)進一步轉(zhuǎn)化成D-乳酸來達到上述分解代謝的作用。Glo-1可及時清除MG等α-羰基醛，，降低活性氧和二羰基糖化蛋白質(zhì)組標(biāo)志物的生成，以及降低氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。
[0003]丙酮醛會在糖尿病人體內(nèi)大量積累，進而誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥，在腦中即表現(xiàn)為糖尿病腦病。糖尿病腦病(diabetic encephalopathy, DE)是指糖尿病(diabetesmellitus,DM)久病患者漸進發(fā)生的以智能減退和大腦神經(jīng)生理及結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹饕卣鞯木窆δ芪蓙y性疾病。2006年，專門術(shù)語糖尿病認知功能障礙(diabetes-associatedcognitive decline, DA⑶)的提出，進一步增強了人們對這種功能紊亂的認識，并成為糖尿病腦病研究的焦點。廣泛的流行病學(xué)調(diào)查及其前瞻性研究表明，糖尿病是與年齡相關(guān)的認知功能下降和癡呆的一個危險因素，相對于非糖尿病患者，認知功能下降的速度在糖尿病患者中增加了 1.5-2.0倍。而且研究顯示,在阿爾茨海默病(Alzheimers disease, AD)腦脊髓中含有高濃度的丙酮醒(Vander Jagt&Hunsaker, 2003),表明丙酮醒可能是AD的誘發(fā)因子之一。因此丙酮醛誘導(dǎo)的細胞凋亡在各種神經(jīng)認知功能障礙疾病中起著至關(guān)重要的作用[Beisswenger PJ, Drummond KS, Nelson RG, Howell SK, Szwergold BS, MauerM(2005), SusceptibiIity to diabetic nephropathy is related to dicarbonyl andoxidative stress.Diabetes54:3274 - 3281] ； [Berlanga J, Cibrian D, Guillen I, FreyreF, Alba JS, Lopez-Saura P, Merino N, Aldama A, Quintela AM, Triana ME, MontequinJF, Ajamieh H, Urquiza D, Ahmed N, Thornalley PJ (2005), Methylglyoxal administrationinduces diabetes-like microvascular changes and perturbs the healing process ofcutaneous wounds.Clin Sci (Lond) 109:83 - 95]。丙酮醒通常用于 PC12 細胞，作為糖尿病引起的認知能力下降的細胞模型。
[0004]馬里苷(marein)是一種查爾酮4’位的0_糖苷，也是一種多酹類化合物，分子式為C21H22O11,相對分子量為450.392780g/molo馬里苷存在于菊科植物兩色金雞菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)的頭狀花序中(是兩色金雞菊的主要活性成分之一)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，兩色金雞菊具有抗氧化、降血糖、降血壓、降血脂等作用。馬里苷的藥理活性國內(nèi)外鮮有報道。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中尚未見有馬里苷保護PC12細胞免受丙酮醛損傷作用的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0005]本發(fā)明的目的在于研究提供馬里苷新的藥理作用，即馬里苷對神經(jīng)認知功能障礙如糖尿病腦病、阿爾茨海默病等的防治作用及其可能的作用機制。
[0006]本發(fā)明的主要技術(shù)方案包括:
[0007]1、四噻唑藍(MTT)法測定丙酮醛對PC12細胞存活率的影響；
[0008]2、MTT法測定馬里苷對丙酮醛刺激PC12細胞的保護作用；
[0009]3、Hochest33342染色檢測馬里苷對丙酮醛誘導(dǎo)增殖細胞凋亡的影響；
[0010]4、利用葡萄糖氧化酶法測定細胞糖消耗；
[0011]5、細胞中ATP含量的測定；
[0012]6、細胞中乳酸含量的測定；
[0013]7、細胞中ROS含量測定；
[0014]8、細胞中鈣離子濃度的測定；
[0015]9、細胞中還原型GSH的檢測；
[0016]10, Western Blot檢測馬里苷對丙酮醛刺激PC12細胞相關(guān)蛋白表達的影響。
[0017]研究結(jié)果表明:
[0018]經(jīng)四噻唑藍(MTT)法檢測，馬里苷對大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12細胞)無毒副作用，且能抑制丙酮醛導(dǎo)致的神經(jīng)細胞損傷，具有神經(jīng)細胞保護作用；
[0019]在Hochess33342染色中發(fā)現(xiàn)，馬里苷能夠有效地預(yù)防丙酮醛引起的PC12細胞的
凋亡；
[0020]丙酮醛能刺激PC12細胞對葡萄糖的消耗及ATP的產(chǎn)生，因細胞在丙酮醛損傷下處于凋亡或者瀕死狀態(tài)需要消耗更多的能量，而馬里苷能通過抑制細胞的凋亡或死亡從而避免細胞葡萄糖的過度消耗；
[0021]馬里苷能夠通過抑制TRPAl的活性，減少丙酮醛引起的細胞外鈣離子的內(nèi)流，降低丙酮醛引起的細胞毒性；
[0022]馬里苷能抑制丙酮醛引起的ROS升高，進而增加還原型谷胱甘肽(GSH)的量，增強乙二醛酶I (GL0-1)的功能，顯示馬里苷增強機體抗氧化系統(tǒng)的功能；
[0023]馬里苷能影響琥珀酸脫氫酶(SDHA)、丙酮酸脫氫酶(I3DHAl)、TRPAl (Thetransient receptor potential ankyrinl,瞬時受體電位錨蛋白I)的表達，顯示其能通過影響機體三羧酸循環(huán)達到預(yù)防糖尿病腦病的作用；
[0024]綜上所述，本發(fā)明提供的馬里苷防治神經(jīng)認知功能障礙如糖尿病腦病、阿爾茨海默病等藥理效果好，作用強，毒性小，預(yù)示著其良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0025]圖1—四噻唑藍(MTT)法測定丙酮醛對PC12細胞的損傷作用[0026]其中:圓點線-.6h，方框線_.12h，三角線_.24h
[0027]圖2—四噻唑藍(MTT)法測定馬里苷對丙酮醛損傷的PC12細胞的保護作用
[0028]其中: '與對照組相比P (0.01,**-.與模型組相比P〈0.01。
[0029]圖3—Hochess33343法測定馬里苷對丙酮醛損傷的PC12細胞的保護作用
[0030]其中:A_.control 白光；B_.control 突光；C_.model 白光；D_.model 突光；E-.10 μ mol/L馬里苷白光；F.-10 μ mol/L馬里苷熒光；
[0031]圖4—馬里苷對丙酮醛損傷的PC12細胞對葡萄糖消耗的影響
[0032]其中: '與對照組相比P (0.01,**-.與模型組相比P〈0.01。
[0033]圖5—馬里苷對丙酮醛損傷的PC12細胞中ATP水平的影響
[0034]其中: '與對照組相比P (0.01,**-.與模型組相比P〈0.01。
[0035]圖6—馬里苷對丙酮醛損傷的PC12細胞中乳酸水平的影響
[0036]其中:##-.與對照組相比P (0.01,*-.與模型組相比P〈0.05。
[0037]圖7—馬里苷對丙酮醛損傷的PC12細胞中ROS水平的影響 [0038]其中: '與對照組相比P (0.01,*-.與模型組相比P (0.05ο
[0039]圖8—馬里苷對丙酮醛損傷的PC12細胞內(nèi)鈣離子的影響
[0040]其中:Β-Ε圖，淺灰色線(圓點線)_.對照，黑色線(方形線)_.模型(丙酮醛ImmoI/L),深灰色線(三角形線)_.馬里苷(20，10或5 μ mol/L)疋圖，圓點線線-.馬里苷2(^11101/1，方形線-.馬里苷10 μ mol/L，三角形線5 μ mol/L。圖9—馬里苷對丙酮醛損傷的PC12細胞中GSH水平的影響
[0041]其中: '與對照組相比P (0.01,**-.與模型組相比P〈0.01。
[0042]圖10—WesternBlot檢測馬里苷對丙酮醛刺激的PC12細胞相關(guān)蛋白表達的影響〃
[0043]其中:PDHA1_.丙酮酸脫氫酶；SDHA_.琥珀酸脫氫酶；TRPA1_.瞬時受體電位錨蛋白 I ;GL01' 乙二醒酶 I ; β-actin' 內(nèi)參。
【具體實施方式】:
[0044]以下實施例僅為本領(lǐng)域進一步說明本發(fā)明，但不以此限制本發(fā)明。
[0045]本發(fā)明實施例所用試劑、儀器為:
[0046]PC12細胞:大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞，購于上海細胞庫。
[0047]藥品及主要試劑:馬里苷(購自美國ChromaDex, Inc.);丙酮醒、葡萄糖(美國SIGMA公司)；MTT (南京建成生物工程研究所)；葡萄糖檢測試劑盒普利來公司)；乳酸試劑盒(南京建成生物工程研究所);Hochess33342、R0S試劑盒、Fura_2AM鈣離子探針、GSH試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；鼠抗β-actin (康為世紀)；兔抗GL01、SDHA、TOHAl (美國加利福尼亞EPIT0MICS公司);TRPA1 (英國Abeam)。
[0048]《實施例1》四噻唑藍(MTT)法測定PC12細胞的存活率
[0049]實驗方法:PC12細胞培養(yǎng):PC12細胞用含10 %胎牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37°C 5% C02和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。每2-3天更換培養(yǎng)液一次，細胞達約70% — 80%融合時，傳代或用于實驗。
[0050]實驗處理:用0.25%的胰酶將貼壁的PC12細胞消化，1000rpm離心5min，除去胰酶。將細胞均勻排在96孔板中，種密度為I X IO4Cell/孔，在含有10%胎牛血清100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37°C 5% CO2和95%濕度下進行貼壁培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)過夜，換新鮮DMEM培養(yǎng)液，對照組不加丙酮醛，實驗組分別為0.25,0.5、1.0、
2.0,4.0mM濃度的丙酮醛，分別刺激6h、12h、24h，各組設(shè)5個復(fù)孔。
[0051]結(jié)果測定:取出待測的96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) IOpl，繼續(xù)孵育4小時后，小心去掉上清，每孔加入150 μ I 二甲基亞礬，小心混勻，用酶標(biāo)儀在波長570nm處測定吸光度值。
[0052] 實驗結(jié)果:從圖1中可見，隨著時間的延長和濃度的增加，細胞存活率逐漸下降，說明丙酮醛對PC12細胞的損傷具有濃度和時間的依賴性。從圖(I)中可以看出，加入
0.5mmol/L丙酮醛12h后，細胞狀態(tài)明顯變差，細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離
坐寸ο
[0053]《實施例2》MTT法測定馬里苷對丙酮醛刺激PC12細胞的保護作用.[0054]PC12細胞培養(yǎng)同實施例1.[0055]實驗處理:初步細胞處理同實施例1，實驗分組，馬里苷濃度分別為40 μ mol/L、20 μ mol/L、10 μ mol/L、5 μ mol/L,處理細胞24h后，用丙酮醛lmmol/L損傷細胞24h，對照組不加損傷。
[0056]結(jié)果測定:同實施例1.[0057]實驗結(jié)果:從圖⑵中可以看出，馬里苷濃度40 μ mol/L、20 μ mol/L、10 μ mol/L、5 μ mol/L預(yù)處理細胞后，再加入丙酮醛損傷，細胞存活率與模型相比顯著升高，且具有明顯的劑量依賴性。表明馬里苷能顯著減輕丙酮醛對PC12細胞的損傷，利用SPSS17.0軟件進行方差分析(ANOVA)，顯示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.01)。
[0058]《實施例3》Hochest33342染色檢測馬里苷對丙酮醛誘導(dǎo)增殖的細胞凋亡的影響
[0059]細胞培養(yǎng):同實施例1。
[0060]實驗處理及結(jié)果測定:細胞消化制備為混懸液接種至24孔細胞培養(yǎng)板，每孔500 μ 1，孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24h細胞貼壁后棄培養(yǎng)液，加入馬里苷10 μ mol/L24h后，丙酮醛lmmol/L刺激24h，常溫固定30min，PBS清洗3次，加入Hoechst33342染液，終濃度為10 μ g/ml，室溫染20min。用PBS液漂洗3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。
[0061]實驗結(jié)果:丙酮醛刺激PC12細胞引起胞內(nèi)凋亡小體增加，細胞內(nèi)容物外溢，細胞狀態(tài)明顯變差。而用?ο μ mol/L的馬里苷預(yù)處理細胞后，發(fā)現(xiàn)丙酮醛對PC12細胞的損傷明顯減輕(圖3)。
[0062]《實施例4》利用葡萄糖氧化酶法測定細胞糖消耗
[0063]細胞培養(yǎng):同實施例1.[0064]實驗處理:初步細胞處理同實施例1.實驗分組馬里苷濃度分別為20 μ mol/L、10 μ mol/L處理細胞24h后，用丙酮醛lmmol/L損傷細胞24h，對照組不加損傷。
[0065]結(jié)果測定:每孔取5μ 1，利用葡萄糖試劑盒檢測培養(yǎng)液上清液中的葡萄糖含量。
【權(quán)利要求】
1.馬里苷在制備防治丙酮醛引起的認知功能障礙藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，包含以馬里苷為活性成分與藥學(xué)上可接受的一種或多種載體組成的藥物組合物的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，包含用常規(guī)方法制備的各種藥物制劑的應(yīng)用，如口服給藥制劑、注射給藥制劑或局部給藥制劑，其中:口服給藥制劑有片劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿齊?、溶液劑、乳劑；注射給藥制劑有無菌注射水溶液、無菌注射水包油微乳液、注射用無菌粉末等；局部給藥制劑有貼劑、栓劑、霜劑、膏劑、凝膠劑、溶液、混懸液或靶向制劑。
【文檔編號】A61K31/7034GK103989691SQ201410245310
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】姜保平, 許利嘉, 肖培根, 胡克平, 彭勇 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所