八肽膽囊收縮素在制藥中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及八肽膽囊收縮素在制藥領(lǐng)域中的新用途。該產(chǎn)品具有顯著改善長期使用METH引起的行為變化，有利于預(yù)防和治療METH長期使用所致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展；還可以顯著減少M(fèi)ETH引起的神經(jīng)細(xì)胞的死亡，預(yù)防長期使用METH引起的神經(jīng)損傷；還可抑制METH引起的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的生成，表明CCK-8發(fā)揮中樞抗炎作用，對改善長期使用METH引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥具有重要意義。
【專利說明】八肽膽囊收縮素在制藥中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及八肽膽囊收縮素(CCK-8)的用途，具體的說是八肽膽囊收縮素在制藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK, PZ)，又稱縮膽囊素，是從豬小腸提取物中分離出來的、由33個(gè)氨基酸組成的多肽，于1928年、1943年被證明并提純。CCK廣泛存在于胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其通過與靶細(xì)胞膜上的特異性受體CCKR (cholecystokininreceptor，膽囊收縮素受體)結(jié)合而發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。CCKR是細(xì)胞膜上的一類糖蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)超家族。不同結(jié)構(gòu)類型的CCKR組織分布不同，介導(dǎo)不同的細(xì)胞效應(yīng)。1980 年 Sankaran 等在膜腺腺泡中發(fā)現(xiàn)了 CCKlR (cholecystokinin I receptor,膽囊收縮素I受體)，同年在腦中又發(fā)現(xiàn)了一種藥理學(xué)性質(zhì)完全不同的CCK2R (cholecystokinin 2receptor,膽囊收縮素2受體)。CCKlR主要分布在外周組織，但也有部分在中樞神經(jīng)組織分布；CCK2R主要存在于中樞神經(jīng)組織，但也有部分在外周組織分布。
[0003]CCK與其受體結(jié)合后發(fā)揮多種生理功能。CCK在胃腸道的主要生理作用是刺激胰酶分泌與合成，增強(qiáng)胰碳酸氫鹽分泌和胃排空，刺激膽囊收縮與奧狄氏括約肌松弛，還可增加肝膽汁分泌，調(diào)節(jié)小腸、結(jié)腸運(yùn)動等多方面功能；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)的作用，參與了痛覺感受、食欲調(diào)節(jié)、記憶等生理過程，亦有調(diào)節(jié)垂體激素釋放的作用，與驚恐、焦慮、癲癇等病理表現(xiàn)有關(guān)，同時(shí)，CCK還具有控制中樞呼吸節(jié)律及調(diào)節(jié)心血管緊張的作用。
[0004]用胰蛋白酶消化33肽的CCK，可使其羧基端8個(gè)氨基酸解裂出來，稱為八肽膽囊收縮素(CCK-8)，CCK-8具有整個(gè)CCK分子的全部活性，是膽囊收縮素-促胰酶素分子的最小活性片段。在CCK分子羧基端第7位的酪氨酸是硫酸鹽化的，其上的硫酸酯基團(tuán)的存在為發(fā)揮其生物活性所必需。CCK-8的氨基酸序列為H-Asp-Tyr (SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2，分子式為C49H62NltlO16S3，分子量為1143.27。已知可以用作膽囊收縮診斷試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供八肽膽囊收縮素的新用途，即在制藥中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明提供了八肽膽囊收縮素在制備治療或改善長期使用甲基苯丙胺引起的行為異常藥中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供了八肽膽囊收縮素在制備治療或預(yù)防甲基苯丙胺引起神經(jīng)損傷藥中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明提供了八肽膽囊收縮素在制備治療或預(yù)防甲基苯丙胺引起的中樞炎癥損傷藥中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明通過如下藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了八肽膽囊收縮素在制藥領(lǐng)域中所具有的上述新用途。[0010]制備CCK-8注射液:從美國Sigma公司購買硫酸化的CCK-8，用生理鹽水將33.7μ L、25%~28%氨水稀釋至10 mL,得0.05 mo I/L氨水(現(xiàn)用現(xiàn)配)。將5 mg CCK-8與0.05 mol/L氨水5 mL充分振蕩混勻，即得I mg/mL CCK-8溶液，50 μ L/管分裝，冰浴操作，_80°C保存，有效期半年。用前用生理鹽水稀釋至I mg/L濃度，避免反復(fù)凍融。
[0011]UCCK-8抑制甲基苯丙胺(METH)引起的C57BL/6J小鼠行為敏化 試驗(yàn)動物的準(zhǔn)備:
①試驗(yàn)動物:C57BL/6J小鼠(SPF級)，體重18~22g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。
[0012]②飼養(yǎng)條件:小鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，6只/籠,室溫22±1°C,濕度50%±10%，光照時(shí)間7:00-19:00，食水不限。
[0013]③40mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，將其固定在小鼠腦立體定位儀上，進(jìn)行側(cè)腦室埋管手術(shù)。手術(shù)后適應(yīng)性飼養(yǎng)(單籠飼養(yǎng))I周，然后隨機(jī)分組，每組12只。所有小鼠在實(shí)驗(yàn)開始前先預(yù)適應(yīng)3d，并觀察記錄30min內(nèi)自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)，以作為基礎(chǔ)值以及篩除離群個(gè)體的依據(jù)。
[0014]1.1、建立行為敏化模型
行為敏化模型的建立過程分為3個(gè)階段:行為敏化誘導(dǎo)期、行為敏化戒斷期與行為敏化檢測期。
[0015]取準(zhǔn)備好的試驗(yàn)動物72只，隨機(jī)分為6組，每組12只，第I組為對照組，第2飛組為實(shí)驗(yàn)組，具體如下:
第I組:生理鹽水組(Saline組)；
第 2 組:METH (lmg/kg)組；
第 3 組:METH (2mg/kg)組；
第 4 組:CCK-8 (0.1yg)組;
第 5 組:CCK-8 (0.01yg)組；
第 6 組:CCK-8 (0.0Olyg)組。
[0016]其中，第廣3組小鼠采用腹腔注射(ip)方式給藥，每天早上同一時(shí)間測體重，實(shí)驗(yàn)中按10mL/kg給藥體積計(jì)算給藥量；第4飛組小鼠采用微量加樣器側(cè)腦室給藥，給藥體積為2 μ L/只。
[0017]1.1.1行為敏化誘導(dǎo)期(dl-d7):
第I組小鼠按I次/d腹腔注射給予生理鹽水，dl、d3、d5天給予生理鹽水后，立即將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)。
[0018]第2組小鼠按lmg/kg、I次/d腹腔注射給予METH，dl、d3、d5天給予METH后，立即將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)。
[0019]第3組小鼠按2mg/kg、l次/d腹腔注射給予METH，dl、d3、d5天給予METH后，立即將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)。
[0020]第4、5、6 組小鼠分別按 0.1 μ g/2 μ L、0.01 μ g/2 μ L、0.001 μ g/2 μ L 的量側(cè)腦室注射給予CCK-8，dl、d3、d5天給予CCK-8后15min將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)。
[0021] 1.1.2行為敏化戒斷期(d8_dl3):第I飛組小鼠正常條件下飼養(yǎng)6天，不進(jìn)行任何處理。
[0022]1.1.3行為敏化檢測期(dl4):
第I組小鼠按I次/d腹腔注射給予生理鹽水，給予生理鹽水后立即將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)。
[0023]第2組小鼠按lmg/kg、I次/d腹腔注射給予METH，給予METH后立即將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)。
[0024]第3組小鼠按2mg/kg、I次/d腹腔注射給予METH，給予METH后立即將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)。
[0025]第4、5、6 組小鼠分別按 0.1 μ g/2 μ L、0.01 μ g/2 μ L、0.001 μ g/2 μ L 的量側(cè)腦室注射CCK-8，注射CCK-8后15min后將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)。
[0026]對小鼠的自發(fā)行為活動進(jìn)行記錄的數(shù)據(jù)包括:總距離、活動速度、活動范圍。
[0027]對第f 3組小鼠自發(fā)行為活動的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，dl4天給予METH后，第2組、第3組小鼠的自發(fā)活動距離明顯增高，另外通過比較第2組與第3組數(shù)據(jù)可以知道，METH時(shí)間、劑量依賴性的增高動物的活動距離，綜合以上分析，行為敏化模型制備成功。
[0028]對第1、4、5組小鼠自發(fā)行為活動的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，CCK-8側(cè)腦室給藥對動物自發(fā)活動無顯著影響，CCK-8本身不能誘導(dǎo)動物形成行為敏化。
[0029]1.2、METH (lmg/kg組)誘導(dǎo)的行為敏化模型建立過程中，CCK-8不同時(shí)期與METH伴隨給藥對長期使用METH動物行為變化的影響。
[0030]1.2.1、CCK-8誘導(dǎo)期給藥抑制METH誘導(dǎo)的行為敏化的形成:
1.2.1.1、行為敏化誘導(dǎo)期(dl-d7):
取準(zhǔn)備好的試驗(yàn)動物48只，隨機(jī)分為4組，每組12只，第I組為對照組，第2~4組為實(shí)驗(yàn)組，具體如下:
第I組:METH (lmg/kg) +生理鹽水組；
第 2 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.1 μ g)組;
第 3 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.01 μ g)組；
第 4 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.001 μ g)組。
[0031]以上各組，METH采用腹腔注射方式給藥，每天早上同一時(shí)間測體重，實(shí)驗(yàn)中按10mL/kg計(jì)算給藥體積及給藥濃度；生理鹽水及CCK-8采用微量加樣器側(cè)腦室給藥，給藥體積為2 μ L/只。
[0032]各組每天同一時(shí)間分別給藥(第I組:生理鹽水2 μ L ;第2組:CCK_8 0.1 μ g ;第3組:CCK-8 0.01 μ g ;第4組:CCK-8 0.001 μ g)，給予生理鹽水(或給予CCK-8) 15 min后，各組小鼠按lmg/kg、l次/d腹腔注射給予METH，dl、d3、d5天給予METH后，立即將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30min內(nèi)小鼠的行為活動數(shù)據(jù)。 [0033]1.2.1.2、行為敏化戒斷期(d8-dl3):
第1~4組小鼠正常條件下飼養(yǎng)6天，不進(jìn)行任何處理。
[0034]1.2.1.3、行為敏化檢測期(dl4):各組小鼠給予按lmg/kg、I次/d腹腔注射給予METH，給予METH后立即將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30 min小鼠的自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)。
[0035]對f 4組小鼠自發(fā)行為活動的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，CCK-8 (0.1 μ g、0.01 μ g、0.0Olyg)誘導(dǎo)期與METH伴隨給藥，可以明顯抑制檢測期當(dāng)天動物行為敏化的表達(dá)。
[0036]結(jié)論:CCK_8伴隨給藥可以降低動物對METH的敏感性，改善長期使用METH引起的行為異常。
[0037]1.2.2、CCK-8檢測期給藥抑制METH引起的行為敏化的表達(dá):
1.2.2.1、行為敏化誘導(dǎo)期(dl-d7):
取準(zhǔn)備好的試驗(yàn)動物48只，所有小鼠每天同一時(shí)間采用腹腔注射給予METH(lmg/kg、l次/d)，dl、d3、d5天給藥后立即將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄小鼠在30min內(nèi)的自發(fā)行為活動。d7天給藥之后，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，第I組為對照組，第2~4組為實(shí)驗(yàn)組。
[0038]1.2.2.2、行為敏化戒斷期(d8_dl3):
第1~4組小鼠正常條件下飼養(yǎng)6天，不進(jìn)行任何處理。
[0039]1.2.2.3、行為敏化檢測期(dl4):
第I組:METH (lmg/kg) +生理鹽水組；
第 2 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.1 μ g)組;
第 3 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.01 μ g)組；
第 4 組:METH (lmg/kg) +CCK-8 (0.001 μ g)組。
[0040]以上各組，METH采用腹腔注射方式給藥，每天早上同一時(shí)間測體重，實(shí)驗(yàn)中按10mL/kg計(jì)算給藥體積及給藥濃度；生理鹽水及CCK-8采用微量加樣器側(cè)腦室給藥，給藥體積為2 μ L/只。
[0041]各組分別給藥(第I組:生理鹽水2yL ;第2組:CCK-8 0.1 μ g ;第3組:CCK-8
0.01 μ g ;第4組:CCK-8 0.001 μ g)，給予生理鹽水(或給予CCK-8) 15 min后，各組小鼠按lmg/kg、I次/d腹腔注射給予METH，給予METH后立即將小鼠放入自發(fā)活動箱中，記錄30 min內(nèi)小鼠自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)。
[0042]對f 4組小鼠的自發(fā)行為活動數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，CCK-8 (0.1 μ g、0.01 μ g、0.001 μ g)檢測期當(dāng)天給藥,可以明顯抑制METH lmg/kg引起的動物行為敏化。
[0043]結(jié)論:CCK_8改善長期使用METH引起的行為異常，具有保護(hù)功能。
[0044]2、CCK-8對甲基苯丙胺引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
PC-12細(xì)胞來源于褐家鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，具神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。
[0045]取對數(shù)生長期的PC-12細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為IO5/ml，以IO4/100 μ L/孔接種于96孔板。
[0046]實(shí)驗(yàn)分對照組及METH (0.1,0.5、1.0,2.0,4.0mmoI/L)組、CCK-8 (0.1,0.5、
1.0 μ mol/L)組。CCK-8 和 METH 共處理細(xì)胞組；實(shí)驗(yàn)分組為 METH 2 mmol/L 組；METH 2 mmol/L+CCK-8 (0.1、0.5、1.0 μ mol/L) ; METH I mmol/L 組;METH I mmol/L+ CCK-8 (0.1、0.5、1.0μ mol/L)組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)只加培養(yǎng)基的空白孔為調(diào)零孔。待細(xì)胞生長至80%融合后加藥。24 h后加MTT 20 μ I/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加DMSO 150 μ I/孔，置于搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解后，置酶標(biāo)儀λ =490處測各孔吸光度。細(xì)胞存活率按公式計(jì)算:細(xì)胞存活率=D490 (處理組一空白)/D490 (對照組一空白)X 100%。
[0047]結(jié)果:如圖5~8所示。由圖5可以看出，]\^1'!1(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0臟01/1)劑量依賴性的降低PC12細(xì)胞的存活率，表現(xiàn)為對神經(jīng)細(xì)胞的直接損傷作用。由圖6可以看出，CCK-8 (0.1,0.5、1.0 μ mol/L)單獨(dú)處理細(xì)胞對PC12細(xì)胞存活率沒有影響，表明CCK-8本身對神經(jīng)細(xì)胞沒有損傷作用。由圖7、8可以看出，CCK-8(0.1、0.5、1.0 μ mol/L)與METH(lmmol/L、2 mmol/L)共處理細(xì)胞，可以明顯減輕METH對細(xì)胞的損傷，具有保護(hù)功能。
[0048]結(jié)論:CCK_8本身對神經(jīng)細(xì)胞無損害，但可以明顯減輕METH對細(xì)胞的損傷。
[0049]3、CCK_8對甲基苯丙胺引起的促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1 β、IL-6和MCPl)的抑制作用
大量研究表明長期使用METH引起神經(jīng)損傷的原因之一，是激活小膠質(zhì)細(xì)胞，使其分泌的促炎因子水平升高。Ν9細(xì)胞為小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系，具備小膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)功能。
[0050]取對數(shù)生長期的Ν9細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為105/ml，然后接種至6孔板，每孔2mL，待細(xì)胞生長至80%融合，撤血清，放置6h，加藥處理細(xì)胞。
[0051]實(shí)驗(yàn)劑量分對照組、METH(0.1,0.5、1.0,2.0mmol/L)組和 LPS (I μ g/mL)組，處理時(shí)間3h。實(shí)驗(yàn)時(shí)間分為METH ImM處理lh、3h、6h、12h組。之后加CCK-8和METH共處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為METH 2 mmol/L組、METH 2 mmol/L+CCK-8 (0.01,0.1、1.0 μ mol/L)組、CCK_8(1.0μ mol/L)組;METH I mmol/L 組、METH I mmol/L+CCK-8 (0.1、0.5、1.0 μ mol/L), CCK-8 (1.0μ mol/L)組,處理時(shí)間3h。
[0052]收取各孔細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR。結(jié)果以GAPDH作為內(nèi)參基因，AACt法分析基因的相對表達(dá)。將對照組看作100%，其余各組均與之比較，將各組與對照組的比值作為統(tǒng)計(jì)值。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。
[0053]結(jié)果:如圖9~20所示。從圖9~12可以看出ImM METH處理N9細(xì)胞3h會引起促炎癥因子TNF-a、IL-1 β、IL-6和MCPl表達(dá)明顯升高。從圖13~16可以看出ImM METH處理N9細(xì)胞l~12h會引起促炎因子TNF-a、IL-1 β , IL-6和MCPl表達(dá)明顯升高。從圖17~20可以看出，CCK-8與METH共處理細(xì)胞，可以明顯抑制METH引起的促炎癥因子表達(dá)升高，而CCK-8單獨(dú)處理細(xì)胞對促炎癥因子表達(dá)無明顯作用。
[0054]結(jié)論:CCK_8本身對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)無影響，可以明顯抑制METH引起的促炎癥因子表達(dá)升高。
[0055]從以上結(jié)果，可以得出本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
1、八肽膽囊收縮素(CCK-8)具有顯著改善長期使用METH引起的行為變化，有利于預(yù)防和治療METH長期使用所致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。
[00562、CCK-8可以顯著減少M(fèi)ETH引起的神經(jīng)細(xì)胞的死亡，預(yù)防長期使用METH引起的神經(jīng)損傷。
[0057]3、CCK_8可抑制METH引起的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的生成，表明CCK-8發(fā)揮中樞抗炎作用，對改善長期使用METH引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥具有重要意義?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0058]圖1為METH lmg/kg、2mg/kg能夠誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠行為敏化的形成(Mean土 SD，n=12)。*表示與對照組比較，/X0.05 ；**表示與對照組比較，/X0.01 ；***表示與對照組比較，P<Q.001。
[0059]圖2為CCK-8 0.1,0.01,0.001 μ g不能誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠形成行為敏化(Mean土SD, η=12)。
[0060]圖3為CCK-8 0.1,0.01,0.001 μ g誘導(dǎo)期給藥，能夠抑制C57BL/6J小鼠行為敏化的形成和表達(dá)(Mean土SD，n=12) Z表示與對照組比較/X0.05廣表示與對照組比較/X0.01 ；***表示與對照組比較/X0.001。
[0061]圖4為CCK-8 0.1,0.01,0.001 μ g檢測期給藥，能夠抑制C57BL/6J小鼠行為敏化的表達(dá)(Mean土SD，n=12)。*表示與對照組比較/X0.05 ；***表示與對照組比較/X0.001。
[0062]圖5為METH 0.1,0.5、L 0,2.0,4.0 mM劑量依賴性抑制PC12細(xì)胞存活率(Mean土SD，n=3)。_表示與對照組比較/X0.001。
[0063]圖6 為 CCK-8 0.1,0.5,1.0 μ M 對 PC12 細(xì)胞存活率沒有影響(Mean土SD，n=3)。
[0064]圖7為CCK-8 0.5、1.0 μ M能夠改善METH ImM引起的PC12細(xì)胞存活率的降低(Mean土SD，n=3)。*** 表示與對照組比較/X0.001，### 表示與 METH ImM 組比較7X0.001。 [0065]圖8為CCK-8 0.5、1.0 μ M能夠改善METH 2mM引起的PC12細(xì)胞存活率的降低(Mean土SD，n=3)。_表示與對照組比較/X0.001 ；##表示與METH 2 mM組比較/X0.01，表示與METH 2 mM組比較7X0.001。
[0066]圖9為METH不同劑量2.0、1.0,0.5,0.1 mM處理細(xì)胞3h引起的TNF-α分泌水平變化廣表示與對照組比較/X0.01 ；***表示與對照組比較/X0.001。LPS組為陽性對照藥物組，可以明顯引起細(xì)胞炎癥因子分泌增高。
[0067]圖10為METH不同劑量2.0、1.0、0.5、0.1mM處理細(xì)胞3h引起的IL-1 β分泌水平變化，***表示與對照組比較/X0.001。LPS組為陽性對照藥物組，可以明顯引起細(xì)胞炎癥因子分泌增高。
[0068]圖11為METH不同劑量2.0,1.0,0.5,0.1 mM處理細(xì)胞3h引起的IL-6分泌水平變化，*表示與對照組比較/X0.05 ；***表示與對照組比較/X0.001。LPS組為陽性對照藥物組，可以明顯引起細(xì)胞炎癥因子分泌增高。
[0069]圖12為METH不同劑量2.0、1.0、0.5、0.1 mM處理細(xì)胞3h引起的MCP-1分泌水平變化，***表示與對照組比較/X0.001。LPS組為陽性對照藥物組，可以明顯引起細(xì)胞炎癥因子分泌增高。
[0070]圖13為分泌水平變化廣*表示與對照組比較/X0.001。
[0071]圖14為METH I mM處理lh、3h、6h、12h引起的IL-1 β分泌水平變化，*表示與對照組比較/X0.05 ；**表示與對照組比較/X0.01 ；***表示與對照組比較/X0.001。
[0072]圖15為METH I mM處理lh、3h、6h、12h引起的IL-6分泌水平變化，***表示與對照組比較/X0.001。
[0073]圖16為METH I mM處理lh、3h、6h、12h引起的MCP-1分泌水平變化，***表示與對照組比較/X0.001。[0074]圖 17 為 CCK-8 (0.01,0.1、1.0 μ Μ)對 I mM METH 處理 3h 引起的 TNF-α 分泌水平變化的影響(Mean土 SD，n=3)，*表示與對照組比較/X0.05 ；#表示與METH組比較7X0.05。
[0075]圖 18 為 CCK-8(0.01、0.1、1.0 μ M)對 I mM METH 處理 3h 引起的 IL-1 β 分泌水平變化的影響(Mean土SD，n=3)，_表示與對照組比較/X0.001 表示與METH組比較7X0.05 ；表示與METH組比較7X0.001。
[0076]圖19 為 CCK-8(0.01,0.1、1.0 μ Μ)對 I mM METH 處理 3h 引起的 IL-6 分泌水平變化的影響(Mean土SD，n=3)，***表示與對照組比較/X0.001 ；##表示與METH組比較/X0.01 ；漏表示與METH組比較P < 0.001。
[0077]圖20 為 CCK-8 (0.01、0.1、1.0 μ M)對 I mM METH 處理 3h 引起的 MCP-1 分泌水平變化的影響(Mean土SD，n=3)，**表示與對照組比較/X0.01 ；##表示與METH組比較/X0.01 ；表示與METH組比較7X0.001。
【具體實(shí)施方式】
[0078]下面將描述本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。
[0079]實(shí)施例1:配制CCK-8注射液
從美國Sigma公司購買硫酸化的CCK-8 ;用生理鹽水將33.7 μ L 25%~28%氨水稀釋至10 mL,得0.05 mol/L氨水(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
[0080]將5 mg CCK-8與0.05 mol/L氨水5 mL充分振蕩混勻，即得I mg/mL CCK-8溶液，50 μ L/管分裝，冰浴操作，_80°C保存，有效期半年。用前用生理鹽水稀釋至I mg/L濃度，避免反復(fù)凍融。
[0081]細(xì)胞給藥按摩爾濃度計(jì)算好濃度，進(jìn)行稀釋。加入到無血清無雙抗細(xì)胞培養(yǎng)基中。
[0082]實(shí)施例2:動物側(cè)腦室給藥方法
I mg/mL CCK-8溶液用無菌注射用水稀釋20倍至0.05 μ g/ μ L，再10倍稀釋至0.005、
0.0005 μ g/ μ L,給藥體積 2 μ L。
[0083]注射時(shí)將套管針芯拔出，插入內(nèi)注射管(外徑0.67 mm，內(nèi)徑0.3 mm),連接PE管和微量注射器進(jìn)行注射。側(cè)腦室的注射套管定位數(shù)據(jù):前因后0.22 mm,前因旁0.94 mm ;顱骨外表面下2.20 mm，(AP，-0.22 ； ML, ±0.94 ； DV, -2.20)，內(nèi)注射管定位前囟后0.22 _，前囟旁 0.94 mm ;顱骨外表面下 2.40 mm (AP，-0.22 ； ML, ± 0.94 ; DV, -2.40)。側(cè)腦室注射體積2 μ 1，注射速度I μ 1/min，注射完后留針5 min。
[0084]CCK-8屬于多肽類藥物，多肽和蛋白質(zhì)類藥物穩(wěn)定性差，在胃腸道中易被水解，且存在能否被吸收的問題，故多使用注射劑，使用方法為靜脈給藥。
[0085]但是由于此類藥物的生物半衰期短，臨床應(yīng)用時(shí)常常需要重復(fù)注射給藥，給患者帶來痛苦和負(fù)擔(dān)。為了減少給藥次數(shù)，減少事故發(fā)生率和重復(fù)注射引起的副反應(yīng)，近年來多肽類藥物的注射用緩釋或控釋給藥系統(tǒng)，CCK-8可按現(xiàn)有常規(guī)方法制備成緩釋劑，也可以制成微粒給藥系統(tǒng)，還可以制成可注射的凝膠劑，也能起到緩釋作用。
[0086]療程根據(jù)一般藥物治療周期，7天為一個(gè)周期。但具體治療時(shí)間長短，應(yīng)根據(jù)患者腦損傷程度以及患者濫用METH用藥量進(jìn)行確定。
[0087]可能存在的禁忌癥及注意事項(xiàng):CCK_8在外周具有收縮膽囊的功能，可能會引起消化功能異常等副作用。因此，在使用本藥物的同時(shí)，應(yīng)注意監(jiān)測膽囊收縮功能及消化功能。
【權(quán)利要求】
1.八肽膽囊收縮素在制備治療或改善長期使用甲基苯丙胺引起的行為異常藥中的應(yīng)用。
2.八肽膽囊收縮素在制備治療或預(yù)防甲基苯丙胺引起神經(jīng)損傷藥中的應(yīng)用。
3.八肽膽囊收縮素在制備治療或預(yù)防甲基苯丙胺引起的中樞炎癥損傷藥中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K38/08GK103990106SQ201410257237
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】叢斌, 馬春玲, 文迪, 茍紅艷, 安美玲 申請人:河北醫(yī)科大學(xué)