一種利用具有中和FLT3生物學活性的McAb應用于腫瘤的靶向治療的新方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用具有中和FLT3生物學活性的McAb應用于腫瘤的靶向治療的新方法。主要內(nèi)容是采用建立一株特異性強，穩(wěn)定高效分泌具有抗FLT3生物學活性的雜交瘤細胞株，使用其分泌的FLT3單克隆抗體應用于抑制急性淋巴瘤的形成從而可用于惡性腫瘤的治療。具體方法是用基因重組的FLT3表達蛋白，免疫BALB/C小鼠；經(jīng)PEG4000將免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合；反復進行ELISA及WB進行篩選，建立特異穩(wěn)定表達抗FLT3的雜交瘤細胞株；大量擴增，接種小鼠腹腔，制備腹水；收集腹水，進行ELISA效價檢測、WB檢測及抑制白血病細胞形成腫瘤的生物學活性檢測。
【專利說明】—種利用具有中和FLT3生物學活性的McAb應用于腫瘤的靶向治療的新方法

【技術領域】
[0001]該發(fā)明屬生物技術及生物制藥領域，具體涉及一種利用具有中和FLT3生物學活性的McAb應用于腫瘤的靶向治療的新方法。

【背景技術】
[0002]FLT3蛋白屬于第三類受體絡氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK),結構上與血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, F1DGF),菌落刺激因子(colonystimulating factor 1，CSF1)KIT配基相關。RTK蛋白一般含有5個胞外免疫球蛋白相似區(qū)和一個由特殊的親水性內(nèi)源插入片段分隔開得胞內(nèi)絡氨酸激酶區(qū)。人類的FLT3蛋白免疫共沉定實驗顯示有兩條位于130KD及155-160KD處的條帶，其中高分子量的條帶對應的是N端糖基化的成熟蛋白類型，而低分子量的則對應含有高含量甘露糖的非成熟型蛋白。
[0003]FLT3全基因包含24個外顯子，一共96，982個堿基對。FLT3蛋白包含993個氨基酸，分子質量為112.804KD。FLT3蛋白被認為多在在骨髓CD34-陽性細胞(對應多能性骨髓及B淋巴祖細胞)及單核細胞中中表達，在具有CD34高表達的胎肝細胞中也能夠表達。另外FLT3也在來于蛋白急性非淋巴細胞白血病及B淋巴白血病的胚細胞中表達。
[0004]FLT3是FL細胞因子的受體，具有絡氨酸蛋白激酶活性的受體功能。FL是一個早期的功能調控因子，它確保原始造血祖細胞的存活、增殖及分化。FLT3與配體的結合可以促進配體的二聚體化及其后通過多種胞質蛋白的磷酸化介導的細胞信號傳導，包括SHC, SHP-2, SHIP, Cbl, Cbl-b, Gabl and Gab2，還可以激活多種信號傳導的下游通路例如Ras/Raf/MAPK 及 PI3Ras/Raf/MAPK and PI3 激酶等。
[0005]FLT3基因的突變是最常見的基因畸變，這種變異在急性髓性白血病中被發(fā)現(xiàn)過的。位于近膜區(qū)的長度突變是最常發(fā)生的一種突變類型，約占20-25%，其次是位于第二個絡氨酸激酶的酶活區(qū)域的突變，大多數(shù)是由于該區(qū)域835處的密碼子突變和836位密碼子缺失造成，所占比例是7-8%。另外在近膜區(qū)的點突變也曾被發(fā)現(xiàn)，而全基因范圍內(nèi)許多新類型的突變情況依然在增多。
[0006]在急性髓性白血病中約有20-25%的FLT3基因序列中出現(xiàn)內(nèi)部串聯(lián)重復序列，插入和缺失(極少見)的改變。這種情況也被認為與5-10%真的骨髓增生異常綜合癥、難治性貧血伴原始細胞增多及急性，少量的淋巴細胞白血病密切相關。FLT3中重復序列一般在第11位外顯子上，但有時也出現(xiàn)在11位內(nèi)含子及12位外顯子上。這種序列上的異常重復最常用的描述術語是FLT3-1TD(FLT3基因內(nèi)部串聯(lián)重復)。但是由于分子結構上的嚴重異常，F(xiàn)LT3-LM(FLT3長度突變)這種描述似乎更為充分準確。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明采用建立一株特異性強，穩(wěn)定高效分泌具有抗FLT3生物學活性的雜交瘤細胞株，使用其分泌的FLT3單克隆抗體應用于抑制急性淋巴瘤的形成從而可用于惡性腫瘤的治療。
[0008]本發(fā)明的技術方案為:篩選出特異穩(wěn)定分泌小鼠抗人FLT3抗體的雜交瘤細胞株FLT3E6。通過DNA測序和體外和體內(nèi)測試，證實了所述雜交瘤細胞株分泌的抗體是一種全新的抗FLT3的單克隆抗體，可抑制急性淋巴瘤的形成，從而可用于惡性腫瘤的治療。
[0009]進一步地，具體步驟為:用基因重組的FLT3表達蛋白，免疫BALB/C小鼠j^PEG4000將免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合；反復進行ELISA及WB進行篩選,建立特異穩(wěn)定表達抗FLT3的雜交瘤細胞株；大量擴增，接種小鼠腹腔，制備腹水；收集腹水，進行ELISA效價檢測、WB檢測、增殖抑制試驗的生物學活性檢測。
[0010]本發(fā)明中所述單克隆抗體由FLT3E6單克隆雜交瘤細胞株特異穩(wěn)定分泌產(chǎn)生，該細胞株正向中國典型培養(yǎng)物保藏中心提交保藏申請。經(jīng)基因組DNA測序鑒定，該單克隆細胞株編碼的FLT3的抗體基因型序列獨特，其編碼為全新的抗FLT3的單克隆抗體。
[0011]體內(nèi)實驗結果顯示，用該單克隆抗體注射荷瘤小鼠，與對照(僅注射正常小鼠IgG)相比，注射該單克隆抗體的荷瘤小鼠的生存期明顯延長(彡3月，p〈0.05)、瘤體縮小明顯(較對照組平均縮小50%以上)或消失。
[0012]體內(nèi)體外的實驗結果均表明，所述單克隆抗體可用于抑制急性淋巴瘤的形成，抑制腫瘤的生長，減小腫瘤大小，從而達到治療腫瘤的目的。
[0013]本發(fā)明擬以穩(wěn)定表達具有抗FLT3生物學活性的雜交瘤細胞mRNA為模板，小鼠IgV區(qū)簡并引物擴增VH及VL。再經(jīng)重疊PCR技術構建VH-1inker-VL目的片段，最終構建成大腸桿菌BL21/pETa (32+) -VH-1inker-VL基因工程表達菌；經(jīng)常規(guī)發(fā)酵擴增、IPTG誘導表達、破碎、純化后進行藥物的體內(nèi)外活性及藥代學檢測。進行中試表達純化，建立一套可行的生產(chǎn)工藝及規(guī)程；申報藥物的1、IIJII期臨床試驗批文，最終獲得國家新藥生產(chǎn)證書；進行產(chǎn)品宣傳并推向市場，應用于臨床治療，為人類健康作出應有的貢獻。
[0014]運用美國LynnonB1soft公司開發(fā)的高度集成化的分子生物學應用軟件DNAMAN6.0.3.99結合圖2中western結果，確認FLT3蛋白的抗體表原分布范圍在從871位纈氨酸至最993末位絲氨酸處(紅色方框標明)，約122個氨基酸。。
[0015]FLT3單克隆抗體可變區(qū)核酸序列在NCBI網(wǎng)站中進行BLAST，選取了相似性最高的三種鼠源特異性單克隆抗體3F9、4C8、KP14重鏈可變區(qū)序列作為比對序列。在informaxinc公司開發(fā)的軟件vector NTI 8.0將四種序列進行分析比對，證實本發(fā)明中的FLT3單克隆抗體是獨立于其他序列高度相似的單克隆抗體的一個全新序列的抗體(見圖3)。

【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明由以下實施例來例證，但應當注意的是，以下實施例僅用于例證和解釋本發(fā)明，而不是對本發(fā)明保護范圍的限制。
實施例1制備特異性針對FLT3的雜交瘤細胞株
[0017]以重組的人FLT3為免疫原。根據(jù)常規(guī)方法經(jīng)皮下多點免疫BALB/C小鼠，適時與SP2/0進行經(jīng)PEG 4000進行融合。按單克隆抗體制備常規(guī)進行篩選及亞克隆，獲得能高效、穩(wěn)定分泌特異性抗人FLT3的雜交瘤細胞株FLT3E6。
[0018]將該雜交瘤細胞經(jīng)擴增后接種于已預先用液體石蠟致敏7天的BALB/C小鼠腹腔，約10?14天收集小鼠腹水用于后續(xù)試驗研究。
[0019]腹水經(jīng)硫酸銨鹽析純化及Protein G-Sepharose 4B親和層析純化后(以后簡稱純化抗體)檢測ELISA效價> 409600。
[0020]用宮頸癌細胞(Hela)，人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)、白血病細胞(HL60和K562)的細胞裂解物為抗原進行western-blot鑒定。結果除Hela細胞外，細胞裂解物均在約I 1kd處出現(xiàn)一明顯條帶(見圖4)。這些結果顯示，所述雜交瘤分泌的抗體對FLT3具有特異性。
實施例2人FLT3單克隆抗體對荷瘤小鼠的治療試驗
[0021]常規(guī)用0.25%胰酶消化收集處于對數(shù)生長期HL60細胞(白血病細胞)，用生理鹽水調細胞濃度為5X107個/ml，接種于裸鼠腋下，每只0.2ml，共二十只。同時注射雌激素(0.15mg/ml) 0.2ml,每天一次。
[0022]約20天后，所有裸鼠腋下均長出約綠豆大小瘤體，隨機分為兩組，每組十只。
[0023]分別尾靜脈注射正常BALB/C IgG 0.1ml和純化的抗FLT3單克隆抗體0.1ml (含100 μ g McAb)，同時肌肉注射雌激素0.2ml/只。
[0024]觀察記錄裸鼠生存狀況和瘤體大小。
[0025]根據(jù)各組瘤體大小及生存期均值分別制作瘤體大小柱形圖(見圖5)和生存柱形圖(見圖6)。
[0026]如圖5所示，通過使用本發(fā)明的抗FLT3單克隆抗體治療，荷瘤小鼠的瘤體大小逐漸減少甚至直至消失，而對照組的瘤體大小則逐漸增加。而圖6則證實了通過使用本發(fā)明的抗FLT3單克隆抗體治療，顯著地增加了荷瘤小鼠的生存期。
【專利附圖】

【附圖說明】
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[0027]圖1是western鑒定FLT3抗原表位圖。左圖:FLT3C1:650-820位氨基酸的GST融合蛋白，F(xiàn)LT3C2:650-870位氨基酸的GST融合蛋白，F(xiàn)LT3C3 =750-998位氨基酸的GST融合蛋白。右圖:抗FLT3抗體只能識別含有FLT3C3的抗原。
[0028]圖2是FLT3抗原表位序列分析圖。
[0029]圖3是三種不同抗體與FLT3單克隆抗體重鏈可變區(qū)核酸序列比對圖。
[0030]圖4是western鑒定FLT3抗體特異性圖。
[0031]圖5是注射FLT3抗體小鼠與對照組腫瘤重量對比柱狀圖。其中5，14，21代表以第一次注射抗體為O天，其后相隔5，14，21天后取出瘤體進行稱重。FLT3抗體組的腫瘤增殖明顯小于對照組。
[0032]圖6是注射FLT3抗體小鼠與對照組生存期比較圖。其中5，14，21代表以第一次注射抗體為O天，其后相隔5，14，21天計算存活小鼠的數(shù)量。注射FLT3抗體組的存活率明顯高于對照組。
【權利要求】
1.一種利用具有中和FLT3生物學活性的McAb應用于腫瘤的靶向治療的新方法，其特征在于:利用新的分泌FLT3單克隆抗體的細胞株所分泌的FLT3單克隆抗體治療腫瘤。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用具有中和FLT3生物學活性的McAb應用于腫瘤的靶向治療的新方法，其特征在于:建立一株特異性強，穩(wěn)定高效分泌具有抗FLT3生物學活性的雜交瘤細胞株，使用其分泌的FLT3單克隆抗體應用于抑制急性淋巴瘤的形成從而可用于惡性腫瘤的治療。
3.根根據(jù)權利要求2所述的一種利用具有中和FLT3生物學活性的McAb應用于腫瘤的靶向治療的新方法，其特征在于:具體步驟為:用基因重組的FLT3表達蛋白，免疫BALB/C小鼠；經(jīng)PEG4000將免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合；反復進行ELISA及WB進行篩選，建立特異穩(wěn)定表達抗FLT3的雜交瘤細胞株；大量擴增，接種小鼠腹腔，制備腹水；收集腹水，進行ELISA效價檢測、WB檢測及增殖抑制試驗生物學活性檢測。
【文檔編號】A61K39/395GK104288765SQ201410315632
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年7月3日 優(yōu)先權日:2014年7月3日
【發(fā)明者】劉聰, 章崇杰 申請人:成都中聯(lián)生科基因科技有限公司