一種牛膝總皂苷在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種牛膝總皂苷在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，中藥材牛膝經(jīng)中提取的牛膝總皂苷用于在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中；所述牛膝總皂苷的藥物劑型上包括片劑、膠囊劑、口服液、口含片、顆粒劑、混懸劑、栓劑、注射劑、粉針劑、滴丸、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑；所述牛膝總皂苷對(duì)白細(xì)胞介素-1β所致軟骨細(xì)胞凋亡有抑制作用，還可抑制白細(xì)胞介素-1β引起的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對(duì)軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用。本發(fā)明拓寬了牛膝總皂苷的應(yīng)用范圍，也為骨關(guān)節(jié)炎的防治提供了新途徑。
【專利說明】一種牛膝總皂苷在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及一種牛膝總皂苷在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, 0A)是一種慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)于老年人，以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變，半月板損傷，輕度滑膜炎，骨重構(gòu)，軟骨下骨硬化，骨贅形成等為主要病理特征，又稱骨關(guān)節(jié)病、退行性骨關(guān)節(jié)病、肥大性或增生性關(guān)節(jié)炎等。OA是全球范圍內(nèi)最常見的骨關(guān)節(jié)病，我國(guó)OA患者約占總?cè)丝诘?%，其中大部分為膝骨關(guān)節(jié)病。
[0003]OA的病因及詳細(xì)的病理機(jī)制目前仍不完全清楚，現(xiàn)一般認(rèn)為關(guān)節(jié)軟骨破壞及其修復(fù)過程的失衡導(dǎo)致0A。各種致病因素造成軟骨退行性病變時(shí)均從各自途徑導(dǎo)致了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的死亡以及軟骨基質(zhì)的降解，其中軟骨細(xì)胞的死亡又是軟骨退行性病變的關(guān)鍵。
[0004]OA的治療包括藥物治療和外科手術(shù)等。其中治療藥物可分為:快作用緩解癥狀的藥物，主要是非留體類藥物，但引起胃腸道明顯的不良反應(yīng)以及可能破壞軟骨細(xì)胞進(jìn)而限制了它的長(zhǎng)期應(yīng)用；慢作用緩解OA炎癥的藥物及軟骨保護(hù)劑，如補(bǔ)充軟骨基質(zhì)的氨基葡萄糖類以及IL-1抑制劑如雙醋瑞因，軟骨保護(hù)劑如透明質(zhì)酸等，但因價(jià)格昂貴而限制了使用。中醫(yī)藥治療OA類疾病歷史悠久，不良反應(yīng)少，因此可深入挖掘中醫(yī)藥治療的特色與優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)藥防治OA實(shí)驗(yàn)研究取得了很大成績(jī)，但是復(fù)方研究居多，尋找有效成分明確、質(zhì)量可控且安全高效的組分中藥具有顯著的實(shí)用價(jià)值。
[0005]牛膝為覓科多年生草本植物Achyranthes bidentata B1.干燥根，又稱懷牛膝，具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎、引血下行及逐瘀通經(jīng)的作用。皂苷類成分是牛膝中重要的活性成分，現(xiàn)有專利申請(qǐng)涉及總皂苷的提取方法，但對(duì)牛膝總皂苷作為骨關(guān)節(jié)炎防治藥物的作用并未見報(bào)道。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，在于提供一種牛膝總皂苷在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，拓寬了牛膝總皂苷的應(yīng)用范圍，也為骨關(guān)節(jié)炎的防治提供了新途徑。
[0007]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)問題的:
[0008]一種牛膝總皂苷在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，中藥材牛膝經(jīng)中提取的牛膝總皂苷用于在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中。
[0009]進(jìn)一步地，所述牛膝總皂苷的藥物劑型上包括片劑、膠囊劑、口服液、口含片、顆粒劑、混懸劑、栓劑、注射劑、粉針劑、滴丸、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑。
[0010]進(jìn)一步地，所述牛膝總皂苷對(duì)白細(xì)胞介素-1 β所致軟骨細(xì)胞凋亡有抑制作用，還可抑制白細(xì)胞介素-1 β引起的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對(duì)軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用。
[0011]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0012]牛膝飲片經(jīng)乙醇回流提取，正丁醇萃取，DlOl大孔吸附樹脂富集，獲得牛膝總皂苷。牛膝總皂苷對(duì)白細(xì)胞介素-1β (IL-Ιβ)所致軟骨細(xì)胞凋亡有抑制作用，還可抑制IL-1 β引起的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對(duì)軟骨細(xì)胞有顯著保護(hù)作用。大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉造成實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎模型，牛膝總皂苷能顯著抑制實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹，降低血清IL-1 β與一氧化氮(NO)水平，抑制軟骨膠原蛋白的降解，對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎大鼠有顯著治療作用。總之，本發(fā)明拓寬了牛膝總皂苷的應(yīng)用范圍，也為骨關(guān)節(jié)炎的防治提供了新途徑。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0013]下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0014]圖1為牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力影響的柱狀圖。
[0015]圖2為Hoechst33258染色檢測(cè)牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的顯微圖。
[0016]圖3Α為Annexin V-FITC流式檢測(cè)牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖。
[0017]圖3Β為Annexin V-FITC流式檢測(cè)牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡柱形圖。
[0018]圖4為牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡蛋白的影響Western Blot圖。
[0019]圖5為牛膝總皂苷抑制IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞caspase3活性的柱狀圖。
[0020]圖6為牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中炎癥介質(zhì)的影響Western Blot圖。
[0021]圖7為牛膝總阜昔對(duì)大鼠血清IL-1 β水平的影響柱狀圖。
[0022]圖8為牛膝總阜昔對(duì)大鼠血清NO水平的影響柱狀圖。
[0023]圖9為牛膝總皂苷對(duì)大鼠血清羥脯氨酸水平的影響柱狀圖。
【【具體實(shí)施方式】】
[0024]請(qǐng)參閱圖1?9所示，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0025]本發(fā)明涉及一種牛膝總皂苷在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，中藥材牛膝經(jīng)中提取的牛膝總皂苷用于在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中。
[0026]所述牛膝總皂苷的藥物劑型上包括片劑、膠囊劑、口服液、口含片、顆粒劑、混懸劑、栓劑、注射劑、粉針劑、滴丸、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑。
[0027]所述牛膝總皂苷對(duì)白細(xì)胞介素-1 β所致軟骨細(xì)胞凋亡有抑制作用，還可抑制白細(xì)胞介素-1 β引起的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對(duì)軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用。
[0028]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0029]實(shí)施例一:干燥的牛膝飲片3.5kg，略破碎，加入4倍體積75%乙醇，水浴加熱，回流提取三次，時(shí)間分別為4h、2h、2h。合并提取液，減壓濃縮，稱重?？偨嘤眠m量水溶解，依次用石油醚，水飽和正丁醇萃取，最后將正丁醇萃取液進(jìn)行減壓濃縮，稱重。在預(yù)處理過的DlOl大孔吸樹脂層表面放入一張濾紙，將事先準(zhǔn)備好的上樣液(樣品液的前處理:樣品用適量蒸餾水超聲溶解，3000r/min離心20min以除去沉淀和雜質(zhì)，得到的樣品液放置于冰箱4°C低溫放置備用)沿玻璃柱內(nèi)壁小心加入柱子，以3mL/min (即I滴/秒)的流速放液，直至樣品液降至樹脂層表面。依次用5倍柱體積的水、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %乙醇以3mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫，收集50%洗脫液，經(jīng)回流濃縮、干燥，獲得牛膝總皂苷提取物，以5%香草醛-冰乙酸:高氯酸:冰乙酸(2:8:50)為顯色劑進(jìn)行含量測(cè)定，所得提取物中牛膝總皂苷含量高于50%。
[0030]實(shí)施例二:無菌環(huán)境下，小心刮取100 ± 1g的SD雄性大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨坪及髕骨內(nèi)側(cè)透明軟骨，用含100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗軟骨，剪碎至Imm3大小。將軟骨碎片轉(zhuǎn)移至離心管中，依次用0.25%的胰蛋白酶及0.3%的II型膠原酶分別消化30min，3h。II型膠原酶消化時(shí)每隔30min吹打60s。將消化液經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，得到細(xì)胞懸液，1200rpm/min離心lOmin。用DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(含20%新生牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)使用第2?3代細(xì)胞。
[0031]2?3代的軟骨細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，將細(xì)胞濃度調(diào)為I X 15個(gè)細(xì)胞ZmL,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入含5% NCS的DMEM/F-12培養(yǎng)基，牛膝總皂苷(終濃度為3，10，30μ8/πιυ或IL-1 β (終濃度為10ng/mL)，至37°C,5% CO2條件下培養(yǎng)4h，每孔加MTT(5mg/mL) 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸出培養(yǎng)上清，每孔加入DMS0150yL，待結(jié)晶充分溶解后，570nm處測(cè)定OD值。如圖1所示，圖1為牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力影響的柱狀圖，(η = 3，**ρ〈0.0lvs模型組)。結(jié)果:牛膝總皂苷能顯著抑制IL-1 β引起的大鼠軟骨細(xì)胞活力下降，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。
[0032]實(shí)施例三:實(shí)施例二得到的第2?3代的軟骨細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入牛膝總皂苷(終濃度為3，10，30 μ g/mL)或IL-1 β (終濃度為10ng/mL)，37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)24h。
[0033]按照細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒說明書的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果參閱圖2，圖2為Hoechst33258染色檢測(cè)牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的顯微圖，其中，(a)正常組，(b) IL-1 β，(c) IL-1 β + 牛膝總皂苷(3 μ g/mL)，(d) IL-1 β + 牛膝總皂苷(10 μ g/mL)，(e) IL-1 β +牛膝總皂苷(30 μ g/mL)。結(jié)果顯示:正常軟骨細(xì)胞呈藍(lán)色，IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞呈致密濃染，顏色發(fā)白，提示軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡。牛膝總皂苷(10，30yg/mL)可逆轉(zhuǎn)IL-1 β引起的軟骨細(xì)胞凋亡。
[0034]實(shí)施例四:用實(shí)施例三的方法將軟骨細(xì)胞接種及給藥。
[0035]給藥24h后，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書的方法，在Ih內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。重點(diǎn)參閱圖3A和圖3B，其中，n = 3，*p〈0.05，**p〈0.0lvs模型組。圖3Α為Annexin V-FITC流式檢測(cè)牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖，其中(a)正常組，(b) IL-1 β，(c) IL-1 β + 牛膝總皂苷(3 μ g/mL)，(d) IL-1 β + 牛膝總皂苷(10 μ g/mL)，(e) IL-1 β +牛膝總皂苷(30 μ g/mL)，圖3B為Annexin V-FITC流式檢測(cè)牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡柱形圖。結(jié)果顯示刺激軟骨細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡增力口，牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β所致的軟骨細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用。
[0036]重點(diǎn)參閱圖4，圖4是牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡蛋白的影響Western Blot圖。對(duì)于IL-Ιβ誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白Bcl-Xlj表達(dá)降低和凋亡蛋白Bax、Bad表達(dá)上升，牛膝總皂苷有顯著抑制作用。
[0037]重點(diǎn)參閱圖5，圖5是牛膝總皂苷抑制IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞caspase3活性的柱狀圖，(n = 3, **p〈0.0lvs.模型組)。對(duì)于IL-1 β引起的細(xì)胞凋亡酶caspase3活性上升，牛膝總皂苷有顯著抑制作用。
[0038]重點(diǎn)參閱圖6，圖6為牛膝總皂苷對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中炎癥介質(zhì)的影響Western Blot圖。牛膝總皂苷還可下調(diào)IL-1 β引起的基質(zhì)金屬蛋白酶(ΜΜΡ3，ΜΜΡ9)和環(huán)氧化合酶(C0X-2)的表達(dá)。
[0039]實(shí)施例五:200±20g雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組、模型組、牛膝總皂苷(50、100、200mg/kg)三個(gè)劑量組、硫酸氨基葡萄糖(75mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組。除對(duì)照組外，其余各組大鼠右肢膝關(guān)節(jié)腔注射10mg/mL的碘乙酸鈉生理鹽水溶液100 μ L，各組大鼠灌胃給藥或?qū)φ找?，觀測(cè)大鼠關(guān)節(jié)腫脹情況。分別于造模前l(fā)h，及造模后第1，2，3，7，14，21天，用500型開式雙外爪游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠右肢膝關(guān)節(jié)直徑。結(jié)果如下表:
[0040]
xV正常組模型組低劑量組中劑量組高削量組陽(yáng)性對(duì)照組
N.(mm)(mm)(mm)(mm)(mm)(rnm)
第 0 天9.82±0.48 9.96±0.519.87±0.5310.05±0.37 9.98±0.239.9牡31
第 I 天9.99±0.2312.36±0.35##12.53±0.2512.03±0.35 12,03±0,1412,02±0.16*
第 2 天9.86±0.1513.87±0.48##13.23±0.5212.96士0.51*11.80±0.30*11.34±0.38-*
第 3 天10.01±0.1111.83±0.21##11.03±0.0710.65士0.20*10.42±0.11**10.30士0.08**
第 7 天10.85±0.0511.76±0.11##11.37±0.4811.26±0.3210.98±0.12**10.51±0.18**
第 M 天11.15士0,79 11,73±0.1511.47±0.2811.36士0.45 11.30±0.5111.11 士0.75
第 21 天11.07±0.82 11,74±0.0711.47±0,3011.38±0.41 11.27±0.5711.14±0.68
[0041](注:η= 6, *ρ〈0.05, **ρ〈0.0lvs.模型組，#p<0.05, ##p<0.0lvs.正常組)
[0042]實(shí)施例六:實(shí)施例五中大鼠造模后第28天，各組大鼠斷頭取血，分離膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本。血清及標(biāo)本_80°C凍存，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。
[0043]重點(diǎn)參閱圖7，圖7為牛膝總皂苷對(duì)大鼠血清IL-1 β水平的影響柱狀圖，(η = 6，**P<0.01vs.模型組)。按照IL-Ιβ檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示:模型組大鼠血清中的IL-1 β水平顯著上升，牛膝總皂苷(100、200mg/kg)能顯著減少大鼠血清IL-1 β的水平。
[0044]重點(diǎn)參閱圖8，圖8為牛膝總皂苷對(duì)大鼠血清NO水平的影響柱狀圖，(η = 6，*Ρ<0.05, **p〈0.01vS.模型組)。按照一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示:模型組大鼠血清中的NO水平顯著上升，牛膝總皂苷能劑量依賴性降低大鼠血清NO的水平。
[0045]重點(diǎn)參閱圖9，圖9為牛膝總皂苷對(duì)大鼠血清羥脯氨酸水平的影響柱狀圖，(η = 6，**P<0.01vs.模型組)。按羥脯氨酸試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示:模型組大鼠血清中羥脯氨酸水平顯著上升，牛膝總皂苷(100、200mg/kg)能顯著降低大鼠血清中Hyp的水平，表明牛膝總皂苷能抑制實(shí)驗(yàn)性O(shè)A大鼠軟骨膠原蛋白的降解。
[0046]綜上，本發(fā)明的牛膝飲片經(jīng)乙醇回流提取，正丁醇萃取，DlOl大孔吸附樹脂富集，獲得牛膝總皂苷。牛膝總皂苷對(duì)白細(xì)胞介素-1 β (IL-Ιβ)所致軟骨細(xì)胞凋亡有抑制作用，還可抑制IL-Ιβ引起的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對(duì)軟骨細(xì)胞有顯著保護(hù)作用。大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉造成實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎模型，牛膝總皂苷能顯著抑制實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹，降低血清IL-1 β與一氧化氮(NO)水平，抑制軟骨膠原蛋白的降解，對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎大鼠有顯著治療作用?？傊景l(fā)明拓寬了牛膝總皂苷的應(yīng)用范圍，也為骨關(guān)節(jié)炎的防治提供了新途徑。
[0047]雖然以上描述了本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但是熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，我們所描述的具體的實(shí)施例只是說明性的，而不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍的限定，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在依照本發(fā)明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應(yīng)當(dāng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求所保護(hù)的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種牛膝總皂苷在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，其特征在于:中藥材牛膝經(jīng)中提取的牛膝總皂苷用于在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中。
2.如權(quán)利要求1所述的一種牛膝總皂苷在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述牛膝總皂苷的藥物劑型上包括片劑、膠囊劑、口服液、口含片、顆粒劑、混懸劑、栓劑、注射劑、粉針劑、滴丸、緩釋劑、控釋劑、靶向制劑。
3.如權(quán)利要求1所述的一種牛膝總皂苷在防治骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述牛膝總皂苷對(duì)白細(xì)胞介素-1 β所致軟骨細(xì)胞凋亡有抑制作用，還可抑制白細(xì)胞介素-1β引起的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對(duì)軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用。
【文檔編號(hào)】A61P19/02GK104127455SQ201410342914
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】徐先祥, 張小鴻, 李瓊 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)