一種腦靶向水溶性藥物負(fù)載及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種腦靶向水溶性藥物負(fù)載及其制備方法與應(yīng)用，通過(guò)選取血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的LDL受體作為傳輸水溶性藥物來(lái)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的靶點(diǎn)，以生物相容性很好的殼聚糖作為藥物載體材料，研制低毒高效的水溶性藥物納米腦靶向制劑，本發(fā)明能增強(qiáng)水溶性藥物的腦靶向性、增強(qiáng)療效、降低其毒副作用，并提高其生物利用度。
【專利說(shuō)明】一種腦靶向水溶性藥物負(fù)載及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于靶向載體藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種腦靶向水溶性藥物負(fù)載及其制 備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇，全球患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS)疾病的人數(shù)與日俱增。許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，需要使治療藥物滲透到整個(gè)中樞神 經(jīng)系統(tǒng)。
[0003] 血腦屏障（blood-brain barrier, BBB)為一個(gè)介于血液與腦以及脊髓之間、通透 性較低、有選擇性通過(guò)能力的動(dòng)態(tài)界面。血腦屏障的存在對(duì)腦組織形成有效保護(hù)，避免有害 物質(zhì)（如毒素和病毒等）的侵害，但也阻礙許多治療藥物進(jìn)入腦部病灶區(qū)，如抗癌藥、抗生 素和大分子物質(zhì)（肽類）等。它的存在使98%的藥物無(wú)法進(jìn)入腦組織，是制約中樞神經(jīng)系 統(tǒng)藥物發(fā)展的重要因素。臨床上采用的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物大多是能夠擴(kuò)散通過(guò)血腦屏障的 小分子脂溶性物質(zhì)，而這類藥物已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需要，很多疾病的診斷、治療需要大 分子、水溶性物質(zhì)。傳統(tǒng)的將這類大分子藥物導(dǎo)入腦部的方法效果差、危險(xiǎn)性大，因此近年 來(lái)針對(duì)能夠通過(guò)血腦屏障腦部靶向給藥技術(shù)的研究逐漸成為熱點(diǎn)。
[0004] 目前解決藥物有效透過(guò)血腦屏障的方法有：制備前體藥物、打開(kāi)血腦屏障緊密結(jié) 構(gòu)或使用載體系統(tǒng)如抗體、脂質(zhì)體、納米粒等。其中，前體藥物存在改變藥性、引入毒性的風(fēng) 險(xiǎn)，而打開(kāi)血腦屏障緊密結(jié)構(gòu)有可能引入其他有害物質(zhì)。相比較來(lái)說(shuō)載體系統(tǒng)成為比較理 想的透過(guò)血腦屏障的方法。
[0005] 在載體系統(tǒng)中，低密度脂蛋白LDL被視為脂質(zhì)體的天然搭檔，具有脂質(zhì)核心，可被 應(yīng)用于藥物載體的研究中。LDL作為靶向因子在腫瘤診斷（負(fù)載顯影劑）、抗腫瘤藥物和基 因載體等領(lǐng)域得到過(guò)應(yīng)用。
[0006] 根據(jù)治療因子與LDL復(fù)合物形成的方法，主要分為兩種類型：1、治療因子通過(guò)疏 水鏈插入LDL磷脂層，從而"錨定"在LDL表面上（"鉚釘法"）；2、萃取LDL的類脂體再用脂溶 性的藥物重組LDL("重組法")。其中，"鉚釘法"中，含疏水側(cè)鏈的大分子同樣存在"嵌入"LDL 可能。Jin-Seok Kim等人研究了由帶硬脂基側(cè)鏈的聚賴氨酸/LDL/DNA所形成的"Terplex" 體系作為DNA載體的應(yīng)用，體系間主要是通過(guò)疏水聚賴氨酸、LDL和質(zhì)粒DNA之間的電荷/ 疏水力平衡達(dá)到穩(wěn)定，在組成比合適的情況下并不會(huì)發(fā)生沉淀。這一體系對(duì)平滑肌A7R5細(xì) 胞的轉(zhuǎn)染率甚至超過(guò)了 Lipofectin相當(dāng)（高出2. 2倍），在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)"Terplex"的胞吞 是經(jīng)由LDL受體介導(dǎo)的。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同細(xì)胞系（CCD-32LU成纖維細(xì)胞） 這一體系仍然可以被用作DNA載體。然而需要注意的是，聚合物與LDL之間的比例非常重 要，否則會(huì)造成聚合物完全覆蓋LDL。
[0007] "重組法"是將LDL中心的膽固醇脂萃取出來(lái)，再把藥物填入LDL的磷脂單分子層 空殼中。這種"重組法"弊端是工序繁瑣，蛋白質(zhì)收率不高，且整個(gè)過(guò)程可能會(huì)破壞LDL的 結(jié)構(gòu),而且要求對(duì)親水藥物進(jìn)行疏水改性。
[0008] 以上研究結(jié)果顯示LDL作為靶向因子的作用主要是LDL表面的載酯蛋白在發(fā)揮作 用，而如何保護(hù)載酯蛋白ApoB-IOO使其充分暴露在細(xì)胞膜受體表面也是LDL實(shí)現(xiàn)靶向的關(guān) 鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種腦靶向水溶性藥物負(fù)載，旨在增強(qiáng)水溶性藥物的腦靶 向性、增強(qiáng)療效、降低其毒副作用，并提高其生物利用度。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述腦靶向水溶性藥物負(fù)載的制備方法。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述腦靶向水溶性藥物負(fù)載的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供由上述腦靶向水溶性藥物負(fù)載制備得到的腦靶向水 溶性藥物制劑。
[0013] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述腦靶向水溶性藥物制劑的制備方法。
[0014] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種腦靶向水溶性藥物負(fù)載，包括藥物載體丙炔?；瘹ぞ?糖PA-CS-CH0、疊氮探針N-(2-(2-疊氮乙氧基）乙基）棕櫚酰胺NAEP以及LDL ;LDL表面 組裝疊氮探針NAEP，PA-CS-CHO上的炔基與N3-LDL上的疊氮發(fā)生反應(yīng)形成LDL靶向端作為 疏水端的兩親性分子。
[0015] 優(yōu)選地，所述丙炔?；瘹ぞ厶荘A-CS-CHO的結(jié)構(gòu)式如下所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種腦靶向水溶性藥物負(fù)載，其特征在于，包括藥物載體丙炔?；瘹ぞ厶?PA-CS-CHO、疊氮探針N- (2- (2-疊氮乙氧基）乙基）棕櫚酰胺NAEP以及LDL ;LDL表面組裝 疊氮探針NAEP，PA-CS-CHO上的炔基與N3-LDL上的疊氮發(fā)生反應(yīng)形成LDL靶向端作為疏水 端的兩親性分子。
2. 如權(quán)利要求1所述的腦靶向水溶性藥物負(fù)載，其特征在于，所述丙炔酰化殼聚糖 PA-CS-CHO的結(jié)構(gòu)式如下所示：
其中，X的范圍為2?30 ;y'的范圍為2?20 ;z的范圍為8?30。
3. 權(quán)利要求1或2所述的腦靶向水溶性藥物負(fù)載的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： 將N-(2-(2-疊氮乙氧基）乙基）棕櫚酰胺NAEP與低密度脂蛋白LDL在共溶溶劑中混 合，通過(guò)自組裝反應(yīng)得到表面具有疊氮探針的LDL，標(biāo)記為N3-LDL ;其中，所述N-(2-(2-疊 氮乙氧基）乙基）棕櫚酰胺NAEP、低密度脂蛋白LDL的摩爾比為1 : (0. 5?2); 通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在溫和的條件下，丙炔?；瘹ぞ厶荘A-CS-CHO上的炔基與N3-LDL上 的疊氮發(fā)生反應(yīng)，得到腦靶向水溶性藥物負(fù)載；其中，所述丙炔酰化殼聚糖PA-CS-CHO與 N3-LDL的摩爾比為1 : (0? 1?2)。
4. 如權(quán)利要求3所述的腦靶向水溶性藥物負(fù)載的制備方法，其特征在于，所述 N-(2-(2-疊氮乙氧基）乙基）棕櫚酰胺NAEP的制備包括以下步驟： (1) C15H31 ⑶NHCH2CH20CH2CH20H(NHEP)的合成 在氮?dú)鈿夥障?，往棕櫚酸?-(2-氨基乙氧基）乙醇和三乙胺混合液中加入二甲基甲酰 胺攪拌溶解，冰浴冷卻后，加入事先混合的苯并三氮唑_N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸 鹽和N-羥基苯并三氮唑，室溫反應(yīng)，薄層層析確定反應(yīng)終點(diǎn)，得到反應(yīng)物溶液；其中，所述 棕櫚酸、2-(2-氨基乙氧基）乙醇、三乙胺、二甲基甲酰胺、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四 甲基脲六氟磷酸鹽和N-羥基苯并三氮唑的摩爾比為I : (1?1.5) : (1?3) : (1? 5) : (1 ?4. 5) : (1 ?6); 將反應(yīng)物溶液逐滴滴入攪拌中的冷水中，用氯仿萃取；收集到的氯仿溶液依次用檸檬 酸溶液，碳酸氫鈉溶液，飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥后旋蒸去氯仿得到粗產(chǎn)物， 粗產(chǎn)物在乙醇中重結(jié)晶純化，真空干燥，干燥器保存； (2) C15H31 ⑶NHCH2CH2OCH2CH2OTs (PEMBS)的合成 將步驟（1)得到的NHEP溶于氯仿中，加入吡啶；降溫后，加入對(duì)甲基苯磺酰氯，回復(fù)至 室溫，攪拌過(guò)夜，薄層層析確定反應(yīng)終點(diǎn)，得到反應(yīng)產(chǎn)物；其中，所述NHEP、氯仿、吡啶、對(duì)甲 基苯磺酰氯的摩爾比為I : (1?6) : (4?5.6) : (1?1.4); 將反應(yīng)產(chǎn)物滴入鹽酸溶液中，離心出去上清液后得到產(chǎn)物；產(chǎn)物分別用鹽酸和水沖洗， 在室溫下真空干燥，干燥器儲(chǔ)存； (3) C15H31 ⑶NhCH2CH2OCH2CH2N3 (NAEP)的合成 將步驟（2)中得到的PEMBS在氮?dú)獗Ｗo(hù)下溶于二甲基甲酰胺中，加入疊氮鈉，緩慢加 熱，回流一定時(shí)間后降至室溫；產(chǎn)物溶液在攪拌中滴入冰水中，過(guò)濾，用水反復(fù)沖洗濾餅后， 室溫真空干燥；通過(guò)柱層析純化得到最終產(chǎn)物，在室溫下真空干燥，干燥器儲(chǔ)存；其中，所 述PEMBS、二甲基甲酰胺、疊氮鈉的摩爾比為I : (1?5) : (4?5. 6)。
5. 如權(quán)利要求3所述的腦靶向水溶性藥物負(fù)載的制備方法，其特征在于，所述丙炔酰 化殼聚糖PA-CS-CHO的制備包括以下步驟 ： 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，殼聚糖的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液與高碘酸鉀以合適的比例4°C下攪拌反 應(yīng)；然后向溶液中加入適量的乙二醇溶液來(lái)中止反應(yīng)；產(chǎn)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后分別在NaCl 水溶液和去離子水中透析以除去雜質(zhì)，最后產(chǎn)物冷凍干燥，得到醛化殼聚糖CS-CHO ;其中， 所述殼聚糖、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、高碘酸鉀、乙二醇之間的摩爾體積比為I : (1? 5) : (0? 1 ?1) : (0? 1 ?1); 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，丙炔酸水溶液中，加入N-羥基琥珀酰亞胺，溶解后逐滴滴入醛化殼聚 糖CS-CHO水溶液中，攪拌均勻后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽；醛 化殼聚糖、丙炔酸、N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽的 摩爾比為I : (1?4) : (1?3) : (1?3)混合物反應(yīng)10?72h后，轉(zhuǎn)移至透析袋中， 在NaCl水溶液和去離子水中透析除去未反應(yīng)的小分子，冷凍干燥得到產(chǎn)物。
6. -種腦靶向水溶性藥物制劑，其特征在于，包括上述權(quán)利要求1或2所述的腦靶向水 溶性藥物負(fù)載以及腦靶向水溶性藥物；其中，腦靶向水溶性藥物負(fù)載中作為疏水端的兩親 性分子與水溶性藥物自組裝形成LDL祀向端裸露在外面的腦祀向水溶性藥物制劑。
7. 如權(quán)利要求6所述的腦靶向水溶性藥物制劑，其特征在于，所述腦靶向水溶性藥物 制劑的形態(tài)為35?100納米的納米微球； 所述腦靶向水溶性藥物為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、治療需要的大分子、水溶性物質(zhì)， 包括力可拉敏、加蘭他敏、石蒜堿。
8. 權(quán)利要求6或7所述的腦靶向水溶性藥物制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟：將腦靶向水溶性藥物負(fù)載溶于有機(jī)溶劑中制備有機(jī)溶液，再將所述有機(jī)溶液與腦靶向 水溶性藥物的水溶液在透析袋中進(jìn)行自組裝；其中，腦靶向水溶性藥物負(fù)載與有機(jī)溶劑的 體積比為I : (1?10)，透析袋的WMCO = 1000,所述有機(jī)溶劑包括二甲基亞砜、N，N-二甲 基甲酰胺、丙酮、四氫呋喃。
9. 權(quán)利要求1或2所述的腦靶向水溶性藥物負(fù)載在制備腦靶向水溶性藥物制劑方面的 應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1或2所述的腦靶向水溶性藥物負(fù)載在制備中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/36GK104208709SQ201410423851
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】吳正治, 段麗紅 申請(qǐng)人:吳正治, 段麗紅