一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物及其合成方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，該藥物的有效成分為多肽，多肽由絲氨酸和天門冬氨酸兩種氨基酸組成，多肽中含有2～50個(gè)氨基酸，絲氨酸和天門冬氨酸的個(gè)數(shù)比為(0.25～4)：1，藥物中有效成分的質(zhì)量含量為50～60％。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以骨質(zhì)疏松治療為目標(biāo)、以來(lái)源于體內(nèi)天然蛋白的小分子活性多肽為骨靶治療藥物，該靶向藥物兼具有成骨細(xì)胞靶向性、良好的促進(jìn)成骨能力，低細(xì)胞毒性和副作用，較低的用藥量，將為未來(lái)骨質(zhì)疏松治療提供重要藥選擇。
【專利說(shuō)明】
一種靶向増強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物及其合 成方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨是高等脊椎動(dòng)物體內(nèi)一種高度特異的結(jié)締組織，它提供了對(duì)肌體的支持作用和 肌肉附著部位。它也是無(wú)機(jī)離子的主要來(lái)源，并積極參與體內(nèi)的鈣磷平衡。骨骼的正常發(fā)育 和維護(hù)需要骨不斷吸收和重建。生理狀態(tài)下，這種平衡是協(xié)調(diào)的，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及 骨細(xì)胞的功能正常，骨量和微觀結(jié)構(gòu)的完整性保持在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)。然而，這種骨改建失 衡是眾多骨疾病包括骨質(zhì)疏松癥，佩吉特氏癥，骨質(zhì)疏松癥，骨轉(zhuǎn)移癌，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨 髓炎等的重要原因。
[0003] 作為一個(gè)復(fù)雜的活組織，骨主要由三種不同類型的細(xì)胞:成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞和骨 細(xì)胞。成骨細(xì)胞是骨形成細(xì)胞，來(lái)源于局部的成骨祖細(xì)胞，負(fù)責(zé)合成骨基質(zhì)。破骨細(xì)胞是骨 吸收細(xì)胞，核大，來(lái)源于多種造血組織。這兩種類型的細(xì)胞只存在于骨表面的礦化骨基質(zhì)， 而骨細(xì)胞位于骨基質(zhì)內(nèi)，并能吸收并形成骨基質(zhì)。由于其通過(guò)突觸相連的特性。骨細(xì)胞外基 質(zhì)是由有機(jī)質(zhì)以及高度礦化的羥基磷灰石組成的。隨著骨生物學(xué)研究的不斷深入，近幾年 骨代謝疾病的治療藥物不斷發(fā)展，骨形成表面、骨吸收表面、破骨細(xì)胞、骨基質(zhì)等已經(jīng)作為 新的治療靶點(diǎn)納入研究。雖然有些研究產(chǎn)物已應(yīng)用于藥物的開(kāi)發(fā)，但具體到骨及細(xì)胞受體， 大多數(shù)新開(kāi)發(fā)的治療藥物不具備骨特異性。
[0004] 骨質(zhì)疏松癥(0 Serteoporo Seri Ser)是一種由骨代謝失衡引起的骨量減少、骨 骼微細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞所導(dǎo)致骨骼脆弱而易發(fā)生骨折的全身性疾病。骨質(zhì)疏松癥是一個(gè)世界 范圍內(nèi)重要的健康問(wèn)題。隨著人口老齡化的加重，骨質(zhì)疏松癥的患病人數(shù)顯著增加。目前， 全世界約有2億人罹患骨質(zhì)疏松癥，其發(fā)病率已躍居常見(jiàn)病的第七位。其中絕經(jīng)后女性的患 病率更高。65歲以上的女性高發(fā)骨折，嚴(yán)重影響中老年的生活質(zhì)量、健康和壽命。
[0005] 目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物分為三類：1)抑制骨吸收藥物，如雙磷酸鹽、雌激素 等;2)促進(jìn)骨形成藥物，如甲狀旁腺素、氟化物等;3)雙向作用藥物:維生素 K、鍶鹽等。由于 骨組織有著硬度大、局部血供不豐富、滲透性差和生理生化過(guò)程特殊等特點(diǎn)，按一般的給藥 途徑很難使藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至病灶部位。這些藥物常通過(guò)全身給藥，增大使用劑量才能在骨組織 中達(dá)到有效的治療濃度。由于藥物缺乏骨特異性，不僅降低了藥物的治療指數(shù)，而且會(huì)對(duì)病 人的非骨組織或器官造成不必要的毒副作用，如激素替代療法的長(zhǎng)期副作用的最近的報(bào)告 顯示，以代表藥物甲狀旁腺素為例，應(yīng)用超過(guò)兩年療效降低，骨量丟失，甚至嚴(yán)重副作用可 有神經(jīng)癥狀，腎衰竭等。因此尋求一種靶向性能好的治療骨質(zhì)疏松的藥物已經(jīng)十分必要了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種靶向性能好、毒 性和副作用小的靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物及其合成方法。
[0007] 本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥 物，該藥物的有效成分為多肽，所述的多肽由絲氨酸和天門冬氨酸兩種氨基酸組成，所述多 肽中含有2~50個(gè)氨基酸，所述絲氨酸和天門冬氨酸的個(gè)數(shù)比為(0.25~4): 1，所述藥物中 有效成分的質(zhì)量含量為50~60%。
[0008] 所述的多肽包括3個(gè)絲氨酸和2個(gè)天門冬氨酸，所述多肽的序列為Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表絲氨酸，Asp代表天門冬氨酸。
[0009] 牙和骨組織作為人體中礦化程度最高的器官，其中的促進(jìn)礦化蛋白具有增加骨 量，治療骨質(zhì)疏松的潛力。Ser Asp Ser Ser Asp選自牙本質(zhì)磷蛋白（DPP)-級(jí)結(jié)構(gòu)，該蛋白 氨基酸排列順序有特征性的Ser Asp以及Ser Ser Asp重復(fù)序列。選擇該序列有以下原因： (I )DPP來(lái)源于人體礦化程度最高的硬組織，牙齒，其表達(dá)位置為礦化的牙本質(zhì)，骨組織中也 有表達(dá)；（2)DPP是牙本質(zhì)中表達(dá)量最高的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在牙槽骨中也有顯著表達(dá)；（3) DPP缺乏的小鼠其牙本質(zhì)和骨組織礦化受到明顯抑制，牙齒變薄，牙槽骨吸收明顯；（4)蛋白 質(zhì)化學(xué)，細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DPP中氨基酸Asp是高度酸性的氨基酸，導(dǎo)致Ser Asp Ser Ser Asp酸性較高，能夠特異性結(jié)合骨組織表面的羥基磷灰石，明顯促進(jìn)成牙細(xì)胞和成 骨細(xì)胞的成熟和分泌礦化基質(zhì)。作為較特異的礦化調(diào)節(jié)蛋白，在牙本質(zhì)的發(fā)育與礦化過(guò)程 中起重要作用。（5)體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn)Ser Asp Ser Ser Asp多肽，能夠通過(guò)與成骨細(xì)胞表 面特異性蛋白骨膜蛋白（perio Sertin)結(jié)合，并胞吞進(jìn)入細(xì)胞，從而特異性靶向作用于成 骨細(xì)胞。
[0010]作為牙和骨中重要的促礦化蛋白的重復(fù)氨基酸序列，所述多肽Ser Asp Ser Ser Asp具有DPP促進(jìn)成骨基質(zhì)蛋白表達(dá)，促進(jìn)骨基質(zhì)礦化的功能。
[0011] 所述的藥物還包括生理鹽水，作為溶劑，使得藥物可以直接靜脈注射。
[0012] 所述的多肽表面修飾有PEG，即聚乙二醇。
[0013] -種如上所述靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物的合成方法，包括以下幾個(gè)步驟：
[0014] (1)多肽的制備:通過(guò)十二通道半自動(dòng)多肽合成儀按比例將氨基酸縮合成多肽，待 用；
[0015] (2)多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的 EDC和NHS進(jìn)行多肽的活化;其中，EDC為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，NHS 為N-羥基琥珀酰亞胺；
[0016] (3)多肽的修飾:將PEG與多肽以（0.5~2): 1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，靜置過(guò)濾后即得 所述靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物。
[0017] 步驟⑵所述活化的溫度為2~10°C，活化時(shí)間為5~20min。
[0018] 步驟(3)所述靜置的溫度為2~10°C，靜置的時(shí)間為10~20h。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在以下幾方面：
[0020] (1)本發(fā)明的有效成分來(lái)源于具有高礦化調(diào)節(jié)能力的天然蛋白DPP，具有很高的靶 向性，可以將藥物準(zhǔn)確送至骨細(xì)胞中，減少了藥物的副作用；
[0021] (2)本發(fā)明的有效成分來(lái)源于具有高礦化調(diào)節(jié)能力的天然蛋白DPP，具有促進(jìn)成 骨，促進(jìn)生物礦化的作用；
[0022] (3)本發(fā)明采用短肽，合成簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為本發(fā)明的合成步驟示意圖；
[0024] 圖2為藥物的體內(nèi)器官分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
[0025] 圖3為實(shí)施例1藥物在成骨細(xì)胞表面的靶向?qū)嶒?yàn)結(jié)果圖；
[0026] 圖4為小鼠注射實(shí)施例1藥物1月后骨量變化示意圖；
[0027] 圖5為小鼠注射實(shí)施例1藥物3天后骨基質(zhì)蛋白表達(dá)結(jié)果圖；
[0028] 圖6為骨質(zhì)疏松癥模型小鼠注射實(shí)施例1藥物1月后骨量CT分析結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，其有效成分為多肽，該多肽由3個(gè)絲氨酸和 2個(gè)天門冬氨酸組成，其序列為Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表絲氨酸，Asp代表天門 冬氨酸，其中多肽的表面修飾有PEG。
[0032]該藥物還包括生理鹽水，有效成分的含量為55%，在使用時(shí)，直接通過(guò)靜脈注射進(jìn) 入人體。
[0033] 上述靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，其合成方法如圖1所示，包括以下幾個(gè)步 驟：
[0034] (1)多肽的制備:通過(guò)十二通道半自動(dòng)多肽合成儀按Ser: Asp = 2: 3比例將氨基酸 縮合成多肽，待用；
[0035] (2)多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的 EDC和NHS進(jìn)行多肽的活化;活化的溫度為4°C，活化時(shí)間為IOmin;
[0036] (3)多肽的修飾:將PEG與多肽以1:1進(jìn)行混合反應(yīng)，靜置過(guò)濾后即得所述骨質(zhì)疏松 癥靶向治療多肽藥物。靜置溫度為4°C，靜置時(shí)間為12h。
[0037] (4)多肽的保存:將修飾后多肽進(jìn)行凍干，-80 °C冰箱保存。
[0038] 將上述靶向藥物帶上熒光標(biāo)記，鼠尾靜脈注射FITC熒光標(biāo)記所述藥物后，通過(guò)活 體成像儀觀察，其結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示，熒光信號(hào)在軟組織器官中相近，在骨組織中實(shí) 驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明該載體具有骨靶向作用。
[0039] 小鼠尾靜脈注射所述藥物遞送FITC熒光標(biāo)記小核酸后，切片觀察，結(jié)果如圖3所 示，結(jié)果顯示，熒光蛋白在成骨細(xì)胞中特異性富集，說(shuō)明該載體具有成骨細(xì)胞靶向作用。
[0040] 小鼠尾靜脈注射所述藥物1月后，將骨組織固定切片觀察，結(jié)果如圖4所示，該藥物 能夠使骨小梁增粗，骨量增加。
[0041] 小鼠尾靜脈注射所述藥物3天后，提取骨組織RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖5所 示，該藥物能夠增加骨橋蛋白（0CN)、骨涎蛋白（B SerP)、堿性磷酸酶(ALP)等骨基質(zhì)蛋白的 表達(dá)。
[0042] 成骨細(xì)胞將上述所得的靶向藥物，體內(nèi)注射，靶向干預(yù)雌激素缺乏造成的骨質(zhì)疏 松，注射一月后，骨質(zhì)疏松癥小鼠骨量明顯增加，結(jié)果如圖6所示，說(shuō)明該多肽藥物治療骨質(zhì) 疏松癥。
[0043] 實(shí)施例2
[0044] -種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，其有效成分為多肽，該多肽由1個(gè)絲氨酸和 1個(gè)天門冬氨酸組成，其序列為Ser Asp，其中，Ser代表絲氨酸，Asp代表天門冬氨酸，其中多 肽的表面修飾有PEG。
[0045] 該藥物還包括生理鹽水，有效成分的含量為50%，在使用時(shí)，直接通過(guò)靜脈注射進(jìn) 入人體。
[0046] 上述靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，包括以下幾個(gè)步驟：
[0047] (1)多肽的制備：通過(guò)十二通道半自動(dòng)多肽合成儀按Ser:Asp = 1:1比例將氨基酸 縮合成多肽，待用；
[0048] (2)多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的 EDC和NHS進(jìn)行多肽的活化;活化的溫度為2°C，活化時(shí)間為20min;
[0049] (3)多肽的修飾:將PEG與多肽以0.5:1進(jìn)行混合反應(yīng)，靜置過(guò)濾后即得所述骨質(zhì)疏 松癥靶向治療多肽藥物。靜置溫度為2 °C，靜置時(shí)間為20h。
[0050] (4)多肽的保存:將修飾后多肽進(jìn)行凍干，-80 °C冰箱保存。
[0051] 將所得多肽進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該多肽具有靶向治療骨質(zhì)疏松的作用。
[0052] 實(shí)施例3
[0053] 一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，其有效成分為多肽，該多肽由10個(gè)絲氨酸 和40個(gè)天門冬氨酸組成，其序列為：
[0054] Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp，其中，Ser代表絲氨酸， Asp代表天門冬氨酸，其中多肽的表面修飾有PEG。
[0055] 該藥物還包括生理鹽水，有效成分的含量為60%，在使用時(shí)，直接通過(guò)靜脈注射進(jìn) 入人體。
[0056] 上述靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，包括以下幾個(gè)步驟：
[0057] (1)多肽的制備:通過(guò)十二通道半自動(dòng)多肽合成儀按Ser: Asp = 1:4比例將氨基酸 縮合成多肽，待用；
[0058] (2)多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的 EDC和NHS進(jìn)行多肽的活化;活化的溫度為10°C，活化時(shí)間為5min;
[0059] (3)多肽的修飾:將PEG與多肽以2:1進(jìn)行混合反應(yīng)，靜置過(guò)濾后即得所述骨質(zhì)疏松 癥靶向治療多肽藥物。靜置溫度為1 〇 °C，靜置時(shí)間為IOh。
[0060] (4)多肽的保存:將修飾后多肽進(jìn)行凍干，-80 °C冰箱保存。
[0061] 將所得多肽進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該多肽具有靶向治療骨質(zhì)疏松的作用。
[0062] 實(shí)施例4
[0063] -種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，其有效成分為多肽，該多肽由8個(gè)絲氨酸和 2個(gè)天門冬氨酸組成，其序列為Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp，其中，Ser代 表絲氨酸，Asp代表天門冬氨酸，其中多肽的表面修飾有PEG。
[0064] 該藥物還包括生理鹽水，有效成分的含量為53%，在使用時(shí)，直接通過(guò)靜脈注射進(jìn) 入人體。
[0065] 上述靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，包括以下幾個(gè)步驟：
[0066] (1)多肽的制備：通過(guò)十二通道半自動(dòng)多肽合成儀按Ser: Asp = 4:1比例將氨基酸 縮合成多肽，待用；
[0067] (2)多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的 EDC和NHS進(jìn)行多肽的活化;活化的溫度為4°C，活化時(shí)間為17min;
[0068] (3)多肽的修飾:將PEG與多肽以1:1進(jìn)行混合反應(yīng)，靜置過(guò)濾后即得所述骨質(zhì)疏松 癥靶向治療多肽藥物。靜置溫度為5 °C，靜置時(shí)間為16h。
[0069] (4)多肽的保存:將修飾后多肽進(jìn)行凍干，_80°C冰箱保存。
[0070]將所得多肽進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該多肽具有靶向治療骨質(zhì)疏松的作用。 <110>同濟(jì)大學(xué) <]20> -種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物及其合成方法 <160> 3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>多肽 <400> 1 Ser Asp Ser Ser Asp I S <210>2 <211>50 <212> PRT <213>人工序列 [0071 ] <400> 2 Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp I 5 10 Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp II 15 20 Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp 21 25 30 Ser Asp Asp Asp Ser \sp Asp A.sp Asp Asp 31 35 40 Ser Asp Asp Asp See Asp \sp Asp Asp Asp 41 45 50 <210>3 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <400> 3 Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Scr Asp I 5 10
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，其特征在于，該藥物的有效成分為多肽，所述 的多肽由絲氨酸和天門冬氨酸兩種氨基酸組成，所述多肽中含有2~50個(gè)氨基酸，所述絲氨 酸和天門冬氨酸的個(gè)數(shù)比為(0.25~4): 1，所述藥物中有效成分的質(zhì)量含量為50~60%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，其特征在于，所述的多肽包 括3個(gè)絲氨酸和2個(gè)天門冬氨酸，所述多肽的序列為Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表絲 氨酸，Asp代表天門冬氨酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，其特征在于，所述的藥 物還包括生理鹽水。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物，其特征在于，所述的多 肽表面修飾有PEG。5. -種如權(quán)利要求1~4任一所述靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物的合成方法，其特征 在于，該方法包括以下幾個(gè)步驟： (1) 多肽的制備:通過(guò)十二通道半自動(dòng)多肽合成儀按比例將氨基酸縮合成多肽，待用； (2) 多肽的活化:將步驟（1)所得多肽溶于去離子水中，然后加入與多肽等質(zhì)量的EDC和 NHS進(jìn)行多肽的活化； (3) 多肽的修飾:將PEG與多肽以（0.5~2): 1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，靜置過(guò)濾后即得所述 靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物的合成方法，其特征在 于，步驟(2)所述活化的溫度為2~10°C，活化時(shí)間為5~20min。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種靶向增強(qiáng)成骨細(xì)胞骨形成的藥物的合成方法，其特征在 于，步驟(3)所述靜置的溫度為2~10°C，靜置的時(shí)間為10~20h。
【文檔編號(hào)】A61K38/05GK106075389SQ201610596298
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月27日 公開(kāi)號(hào)201610596298.6, CN 106075389 A, CN 106075389A, CN 201610596298, CN-A-106075389, CN106075389 A, CN106075389A, CN201610596298, CN201610596298.6
【發(fā)明人】孫瑤, 王曉剛, 蔡明詳
【申請(qǐng)人】同濟(jì)大學(xué)