人源抗人α干擾素抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人源抗人α干擾素抗體及其編碼基因與應(yīng)用。通過基因工程手段和噬菌體表面展示技術(shù)結(jié)合運用，從全合成單鏈人抗體庫中篩選出抗人IFNα多個亞型的基因工程單鏈抗體，并獲得其抗體的可變區(qū)基因序列，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建全人單克隆Fab及IgG抗體重組載體，經(jīng)哺乳動物細胞表達、純化獲得高純度抗體分子。本發(fā)明獲得抗體的Fab與人IFNα-2結(jié)合的親和力不大于0.5nM，與IFNα-1的親和力不大于5nM。本發(fā)明抗體能夠在細胞水平有效阻斷IFNα-2等多個亞型IFNα的生物學(xué)活性，本發(fā)明為治療干擾素相關(guān)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病提供了一種特異性抗體藥物。
【專利說明】人源抗人a干擾素抗體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及治療用人源基因工程抗體的制備及應(yīng)用，主要是特異性針對多種亞型 人a干擾素（interferon alpha, IFN a )，通過阻斷IFN a與IFN a受體的結(jié)合，抑制IFN a 的生物學(xué)功能，從而達到治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡等與IFNa相關(guān)的自身免疫性疾病的治療用 基因工程抗體。

【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素（interferon，IFN)是由病毒或其他種類的干擾素誘導(dǎo)劑，刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮 系統(tǒng)、巨噬細胞、淋巴細胞以及體細胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白。干擾素是一種廣譜抗病毒劑， 并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而 抑制病毒的復(fù)制；同時還可增強自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力， 從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強抗病毒能力。它們在多種細胞上具有廣譜的抗病毒、抗增 殖、免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)分化作用。干擾素的作用有以下幾個特點：①間接性；②廣譜性；③種 屬特異性：一般在同種屬細胞中活性高，對異種細胞無活性；④發(fā)揮作用迅速：干擾素既能 中斷受染細胞的病毒感染又能限制病毒擴散；在感染的起始階段，體液免疫和細胞免疫發(fā) 生作用之前，干擾素發(fā)揮重要作用（陸再英，鐘南山等，內(nèi)科學(xué)，第7版）。干擾素作為一種重 要的細胞因子藥物，在多種惡性腫瘤的治療以及病毒性疾病的防治方面發(fā)揮了巨大作用。
[0003] 干擾素分為I型、II型和III型。I型干擾素有7種：IFN_ a、IFN-P、IFN-e、 IFN- K、IFN- co、IFN- S 和 IFN- T，人類沒有 IFN- S 和 IFN- T ; II 型僅有 IFN- Y (且僅有 一個亞型），111型干擾素有IFN-A (目前發(fā)現(xiàn)的至少有三個亞型）。根據(jù)報道，I型干擾素 中的IFN-a約有十三個亞型，部分亞型又可根據(jù)等位基因的差異再進行細分。不同種類的 I型干擾素及其分型具有差異的特異活性，但其生物學(xué)功能是一致的。全部的I型干擾素具 有共同的受體IFNAR。IFNAR含有IFNARl和IFNAR2兩條鏈，且都是糖蛋白。其中，IFNAR2 有三種不同的剪接形式：長型跨膜受體（IFNAR2C)、短型跨膜受體（IFNAR2b)和可溶性受體 (IFNAR2a)。I型干擾素通過結(jié)合單獨的IFNAR2C或者IFNARl與IFNAR2C復(fù)合膜受體，激活 下游JAK-STAT途徑產(chǎn)生一系列生物學(xué)反應(yīng)。
[0004] 傳統(tǒng)研究一般都關(guān)注干擾素在抗病毒、抗腫瘤方面的效果和作用，隨著近些年研 究的深入，干擾素在免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)分化方面的功效越來越受重視。例如，I型干擾素可 促進幼稚T細胞向Thl分化；可維持記憶性T細胞的存活以及功能活力；可促進漿母細胞 分化成漿細胞，增強抗體的產(chǎn)生；可誘導(dǎo)/激活樹狀細胞的形成等。此外，大量研究顯示， 多種自身免疫性疾病可能與I型干擾素的高表達存在相關(guān)性。特別地，高水平的IFNa 與包括胰島素依賴的糖尿?。╥nsulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)、系統(tǒng)性 紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE)和自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis)等多種疾病的活動密切相關(guān)。由此，IFNa活性的阻斷策略可能對多種自身 免疫病患者有益。目前，國外有兩株針對IFNa的抗體，MedImmune公司的Sifalimumab和 Genetech公司的Rontalizumab,已相繼進入SLE治療的II期臨床試驗階段，用于銀屑病、 皮肌炎、多肌炎等多種自身免疫病治療的臨床研究也正在進行。
[0005] 人抗體是治療性抗體發(fā)展的最終方向，臨床上應(yīng)用人抗體，尤其是在自身免疫性 疾病的治療中，可最大限度減少抗體的免疫原性、延長藥物在體內(nèi)的半衰期并可借助人免 疫球蛋白Fc段介導(dǎo)免疫調(diào)理、ADCC及CDC等效應(yīng)，進而增強抗體的生物學(xué)效應(yīng)。人抗體的 主要研制手段包括抗體庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)。其中，抗體庫技術(shù)因其具有簡單、便捷和 靈活等特點，廣受抗體開發(fā)者的青睞，目前，該技術(shù)已經(jīng)非常成熟，被認為是目前最成功的 開發(fā)治療性抗體的技術(shù)手段之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個目的在于提供人源抗IFNa抗體及其活性片段的氨基酸序列。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的在于提供編碼上述抗體或其活性片段的編碼基因。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的在于提供上述抗體及其活性片段在制備治療IFNa相關(guān)的 自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的抗體可變區(qū)氨基酸序列模式為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。 在此，F(xiàn)Rl?4代表4個框架區(qū)域，⑶Rl?3代表3個高變區(qū)。FRl?4可以是從恒定區(qū)序 列分離而來（比如人免疫球蛋白輕重鏈類、亞類或亞家族最常用的氨基酸），也可以是從個 人抗體框架區(qū)分離而來或從不同的框架區(qū)基因組合而來。例如Kabat等庫中收錄的眾多人 抗體框架區(qū)序列。其中，重鏈為人免疫球蛋白亞群人重鏈VH III家族，輕鏈為Lambda I家 族。關(guān)于輕重鏈的CDR區(qū)，通過丙氨酸掃描及其他同類氨基酸突變，獲得大量突變體，對輕 鏈CDR1、CDR2和CDR3的突變體評價結(jié)果表明：CDRlL序列為：SGSSSNX1GSNX2VX3(SEQ ID N01)，其中，Xl可以是Ile、Val或Met，優(yōu)選為lie ;X2可以是Tyr、Lys、Arg或Leu，優(yōu)選為 Tyr;X3 可以是 Ser、Gly 或 Ala，優(yōu)選為 Ser。CDR2L 序列為：DXNQRPS(SEQ ID N02)，在此， X 可以是 Asn 或 Thr，優(yōu)選為 Asn。CDR3L 序列為：QSX1DX2X3LVX4(SEQ ID N03)，其中，Xl 可 以是Asn、Ser或Ala,優(yōu)選為Asn ;X2可以是Ala、Met或Leu,優(yōu)選為Ala ;X3可以是Ser、 Gly 或 Ala,優(yōu)選為 Ser ;X4 可以是 Glu、Met、Lys、Asp、Thr、Ala 或 Gly，優(yōu)選為 Glu。對重鏈 CDR1、CDR2和CDR3的突變體評價結(jié)果表明：CDRlH序列為：SX1X2MS(SEQ ID N04)，其中，Xl 可以是 Tyr、Gly、Leu、Val、Met 或 Ala,優(yōu)選為 Tyr ;X2 可以是 Ala、Ser 或 Gly,優(yōu)選為 Ala。 CDR2H 序列為：AISGSGGSTXYADSVKG(SEQ ID N05)，在此，X 可以是 Tyr、Asn、Leu、Ile、Met* Val，優(yōu)選為 Tyr。CDR3H 序列為：YX1SX2X3X4SFDY(SEQ ID N06)，其中，Xl 可以是 Tyr、Trp、 Ser、Pro或Ala,優(yōu)選為Tyr ;X2可以是Phe、Leu和Met,優(yōu)選為Phe ;X3可以是Tyr、Val、 Pro、Phe或Ala,優(yōu)選為Tyr ;X4可以是1111'、413、617、或4811。對該抗體的輕重鏈0)1?區(qū)進 行丙氨酸掃描，結(jié)果表明，輕鏈⑶RlXDR2及重鏈⑶R3對抗體與IFN a -2的結(jié)合至關(guān)重要； 除重鏈CDR2外的其他CDR區(qū)對抗體結(jié)合IFN a -1的影響都十分明顯，僅單個氨基酸的變化 可引起親和力幾倍至幾十倍的改變，具體見實施例3。
[0010] 因此，本發(fā)明提供了 一種人源抗人IFN a抗體，其輕鏈包含以下⑶R氨基酸序列， CDRLl 序列如 SEQ ID NO. 1 所示，CDRL2 序列如 SEQ ID NO. 2 所示，CDRL3 序列如 SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 進一步地，本發(fā)明提供的人源抗人IFN a抗體其重鏈⑶R3含有如SEQ ID NO. 6所 示的氨基酸序列。
[0012] 更進一步地，其重鏈可變區(qū)包含以下CDR氨基酸序列，⑶RHl序列如SEQ ID NO. 4 所示，CDRH2序列如SEQ ID NO. 5所示，CDRH3序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0013] 本發(fā)明提供的人源抗人IFNa抗體，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所 /Jn 〇
[0014] 本發(fā)明提供的人源抗人IFNa抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所 /Jn 〇
[0015] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的人源抗人IFNa抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)氨基酸序列 分別如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
[0016] 本發(fā)明提供的抗體可以為單鏈抗體、Fab、微型抗體、嵌合抗體或全抗體免疫球蛋 白 IgGl、IgG2、IgG4、IgA、IgE、IgM 或 IgD 中的一種。
[0017] 本發(fā)明提供的抗體為全抗體或各種其他形式的基因工程抗體。如，抗IFNa抗體 可以是全抗體或抗體片段?？贵w分子本身可用于治療和診斷。抗體可以被標記、交聯(lián)或偶 聯(lián)及與其他蛋白或多肽分子融合表達形成復(fù)合物（如細胞毒性物質(zhì)、放射性核素和\或化 學(xué)分子等）用于診斷和治療。
[0018] 本發(fā)明更進一步提供：編碼抗體的獨立基因，表達載體，載體轉(zhuǎn)染宿主細胞相關(guān)控 制技術(shù)及宿主細胞，抗體表達流程及在細胞培養(yǎng)上清中回收抗體的方法。
[0019] 編碼上述抗體輕鏈可變區(qū)的基因為如下1)、2)或3)所示：
[0020] 1)其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；
[0021] 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；
[0022] 3)與1)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述輕鏈可變區(qū)的DNA分 子。
[0023] 編碼上述抗體重鏈可變區(qū)的基因為如下1)、2)或3)所示：
[0024] 1)其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示；
[0025] 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；
[0026] 3)與1)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分 子。
[0027] 在本發(fā)明中，"嚴格條件"是指：（1)在較低的離子強度和較高溫度下的雜交和洗 脫，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C ;或（2)雜交時加有變性劑，如50% (V/V)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/〇. lFicoll，42°C等；或（3)僅在兩條序列之間的相同性至少在70%以上，較佳地 至少80%以上，更佳地90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。
[0028] 本發(fā)明提供了含有上述基因的表達載體以及含有所述表達載體的宿主菌、宿主細 胞或表達盒。
[0029] 本發(fā)明提供了制備人源抗人IFN-a抗體的方法，利用噬菌體展示抗體庫技術(shù)篩 選抗IFNa特異性單鏈抗體，獲得抗體輕重鏈可變區(qū)基因，并將其克隆入全抗體表達載體， 通過哺乳動物表達系統(tǒng)對其進行全抗體表達，獲得其全抗體蛋白。
[0030] 上述方法中，所述的抗體輕重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10 所示。
[0031] 此處所公開和要求保護的SEQ ID NO. 1?8所示序列包括"保守序列修飾"，即不 明顯影響和改變所述抗體或含有所述氨基酸序列抗體的結(jié)合特征的核苷酸和氨基酸序列 修飾。所述保守序列修飾包括核苷酸或氨基酸替換、添加或缺失。可以通過本領(lǐng)域的標準 技術(shù)，如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變等將修飾導(dǎo)入SEQ ID NO. 1?8中，如本發(fā)明實施例3 中通過對抗體CDR區(qū)進行丙氨酸掃描和對部分位點進行氨基酸突變，即為保守序列修飾的 范例。保守氨基酸替換包括氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基或其他氨基酸殘基代 替。本領(lǐng)域中，已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈 的氨基酸（如賴氨酸、精氨酸、組氨酸），具有酸性側(cè)鏈的氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸），具 有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸（如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸、色氨酸），具有非極性側(cè)鏈的氨基酸（如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸），具有3分支側(cè)鏈的氨基酸（如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和具 有芳香側(cè)鏈的氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，優(yōu)選用來自于同一側(cè) 鏈家族的另一種氨基酸殘基代替人抗IFNa多個亞型的抗體中的非必須氨基酸殘基。
[0032] 因此，此處公開的核苷酸序列編碼的抗體或/和含有此處公開的氨基酸序列的抗 體包括基本上由經(jīng)保守序列修飾的相似序列編碼的，或含有經(jīng)保守序列修飾的相似序列的 抗體，均應(yīng)視為本發(fā)明的范疇。
[0033] 此外，考慮到密碼子的簡并性，編碼本發(fā)明SEQ ID NO. 1?8所述抗體的基因可以 但不局限于SEQ ID NO. 9和10,例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，對編碼 上述抗體的基因序列進行修改，獲得編碼相同抗體的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)表達 抗體宿主的密碼子偏好性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達效率。
[0034] 本發(fā)明還提供一種抗體靶向藥物分子，包含連接于化學(xué)分子、放射性同位素、多肽 分子、毒素或生物大分子的上述人源抗人IFNa抗體。連接方式為抗體被標記、體外交聯(lián)或 分子偶聯(lián)。
[0035] 本發(fā)明還提供一種雙特異性或多特異性分子，包含上述人源抗人IFNa抗體或抗 體的抗原結(jié)合部位。
[0036] 一種抗體與其他蛋白或/和多肽的融合蛋白，包含上述人源抗人IFNa抗體和功 能性蛋白或多肽分子的復(fù)合物。
[0037] 上述融合蛋白是將抗體基因與融合蛋白基因連接構(gòu)建重組表達載體，通過哺乳動 物細胞或其他表達系統(tǒng)獲得重組融合蛋白分子。
[0038] 本發(fā)明還提供了含有上述人源抗人IFNa抗體的藥物、制劑或檢測試劑。
[0039] 本發(fā)明同樣提供含有抗體的組分和藥理學(xué)上可接受的遞送分子或溶液。本治療用 組分為無菌，可低溫凍干。
[0040] 本發(fā)明提供了人源抗人IFNa抗體在制備以IFNa為靶標的疾病治療藥物中的應(yīng) 用。所述的疾病為系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素依賴型糖尿病、自身免疫性甲狀腺炎、銀屑病、多 肌炎、皮肌炎、硬化病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。
[0041] 本發(fā)明提供一種抗人IFNa多個亞型的抗體，該抗體可以抑制IFNa所表現(xiàn)的一 種或多種生物學(xué)活性。本抗體通過阻礙IFNa與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，也可以通過降低體 內(nèi)IFNa水平發(fā)揮作用。IFNa拮抗劑所具有的所有干擾功能均應(yīng)平等地視為本發(fā)明的目 的。
[0042] 在本發(fā)明的實施例中， 申請人:利用自構(gòu)建的庫容量達到I. 35X 101°的大容量全合 成噬菌體單鏈人抗體資源庫（ZL. 200910091261. 8)，以IFN a _lb和IFN a _2b為靶標，通過 交替篩選獲得了一株針對多種亞型人IFNa的功能抗體AIA22,其輕鏈可變區(qū)和重鏈可變 區(qū)氣基酸序列分別如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所不，AIA22抗體的氣基酸序列和DNA序 列分別如SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示。
[0043] 本發(fā)明運用噬菌體表面展示技術(shù)，從大容量全合成人源單鏈抗體庫中，通過多輪 的生物淘洗（bio-panning),篩選獲得特異性抗人IFNa的單鏈基因工程抗體（single chain variable fragment, scFv)。在本發(fā)明實施例中，將上述抗體輕重鏈可變區(qū)基因分別 克隆入全抗體哺乳動物細胞瞬時表達載體PABL和pABGl中，通過共轉(zhuǎn)染HEK293-T細胞進 行瞬時分泌表達，親和純化獲得全抗體AIA22。
[0044] 本發(fā)明描述的抗體AIA22具有良好的治療應(yīng)用前景，主要表現(xiàn)為通過與重組人 IFNa -UIFNa -2、IFN a -4、IFN a -5、IFN a -6、IFN a -8、IFN a -14、IFN a -17、IFN a -21 等 多個亞型的特異性結(jié)合活性，能夠有效阻斷其對Daudi細胞增殖的抑制作用。
[0045] 采用BIAcore3000系統(tǒng)對AIA22與IFNa -Ib和IFNa -2b的結(jié)合能力進行檢測， 結(jié)果表明，該抗體Fab與IFN a -2b的親和力Kd為0. 213nM，與HSA-IFN a _lb融合蛋白的親 和力Kd為3. 24nM。
[0046] 本發(fā)明通過大容量全合成抗體庫技術(shù)篩選獲得1株抗人IFNa多個亞型的全人源 抗體和一系列親和力保持不變或提高的突變體抗體，并證實所發(fā)明抗體均特異性與IFNa 結(jié)合，并抑制其生物學(xué)功能。利用上述獲得的全人源抗IFNa基因工程抗體可變區(qū)基因以 及抗體序列特征下的全抗體基因，可以在原核細胞、酵母細胞、真核細胞及任何重組系統(tǒng)中 表達和生產(chǎn)此抗體，或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有此抗體基因的任何其它基因，獲得具有 抑制IFNa生物學(xué)活性的抗體產(chǎn)物，或利用體外標記或交聯(lián)的方法獲得的復(fù)合物，制成臨 床上用于治療與IFNa相關(guān)的自身免疫性疾病的特異性抗體藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047] 圖1所示為載體圖譜，其中圖IA為pABL載體圖譜，圖IB為pABK載體圖譜，圖IC 為pABGl載體圖譜。
[0048] 圖2所示為采用FreeStyle?HEK293-T瞬時表達系統(tǒng)表達并通過ProteinA柱親和 純化獲得的 AIA22、Sifalimumab 全抗體 SDS-PAGE 非變性電泳圖；l:Pr Marker，2:AIA22， 3:Sifalimuamb〇
[0049] 圖3所示為AIA22全抗體以濃度梯度結(jié)合多種類型抗原的ELISA特異性鑒定結(jié) 果；圖例所示為抗原類型及其包被濃度。
[0050] 圖 4 所示為利用 BIAcore3000 系統(tǒng)測定 AIA22 與 IFNa -2b 和 HSA-IFNa -Ib 的 親和力曲線。其中，圖4A:為測定AIA22與IFNa-2b親和力結(jié)果，從上至下曲線代表的 IFNa -2b 濃度依次為 20nM、10nM、5nM、2. 5nM、l. 25nM 和 0? 625nM ;圖 4B :為測定 AIA22 與 HSA-IFNa -Ib親和力結(jié)果，從上至下曲線代表的HSA-IFNa -Ib濃度依次為400nM、200nM、 100nM、50nM、25nM 和 12. 5nM。
[0051] 圖5所示為AIA22和Sifalimuab阻斷IFN a _2b抑制Daudi細胞增殖活性的結(jié)果； 使用的IFN a _2b抑制Daudi的增殖濃度為25pM。
[0052] 圖6所示為AIA22對不同IFNa亞型的中和活性圖。縱坐標表示AIA22對不同亞 型的EC50值與各亞型IFNa使用濃度的比值，比值越小，表明AIA22對該亞型的中和活性 越強。
[0053] 圖7所示為AIA22部分突變體阻斷IFNa不同亞型的抑增殖活性結(jié)果；圖7A :為 阻斷IFN a _2b活性，IFN a _2b的使用濃度為25pM ;圖7B :為阻斷IFN a _la活性，IFN a _la 的使用濃度為36pM。

【具體實施方式】
[0054] 以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0055] 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0056] 實施例1特異性人源抗人a干擾素抗體的篩選與鑒定
[0057] 一、材料與方法：
[0058] 1.材料：大容量全合成噬菌體單鏈抗體庫由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院構(gòu) 建（ZL200910091261.8)，庫容量1.35X10'篩選抗體庫的抗原為在大腸桿菌中重組表 達的人IFNa _2b(以色列ProSpec-Tany公司）以及與人血清白蛋白（HSA)融合表達的 HSA-IFN a _lb 和 HSA-IFN a _2b (抗體在線公司）。菌株為 XLl-Blue (美國 Stratagene);所 用噬菌體為M13K07(美國Invitrogene公司）。真核表達載體pABGUpABK和pABL為本室 保存，載體結(jié)構(gòu)圖譜如圖1所示，哺乳動物細胞FreeStyle?HEK293-T購自Invitrogene公 司。MedImmune公司Sifalimumab的可變區(qū)核酸序列合成服務(wù)由北京天一輝遠生物科技有 限公司提供。
[0059] 2?方法
[0060] 2. 1 噬菌體抗體庫的呈現(xiàn)，參照 Pharmacia 公司的 Recombinant phage selection module用戶手冊（Cat. NO. XY-040-00-05)進行，但稍作修改，具體如下：
[0061] 取凍存的抗體庫，在200ml2XYT-CTG(氯霉素C終濃度為100ug/mL，四環(huán)素T終 濃度為l〇ug/mL，Glucose終濃度為0? 5% )培養(yǎng)基中37°C，220rpm培養(yǎng)至0D600 = 0? 5， 按冊1 = 20:1的比例加入輔助噬菌體組31(07，室溫靜置201^11。371：，150印111緩慢搖床 培養(yǎng)lh，加入卡那霉素至終濃度為50ii g/ml，并加IPTG至終濃度為0. lmmol/L，于30°C， 220rpm搖床培養(yǎng)10?12h。次日，離心收取培養(yǎng)上清加入1/5體積的PEG8000buffer(20% PEG8000+2. 5mol/L NaCl)，混勻后于冰上放置45min，沉淀噬菌體。4°C，IOOOOg離心20min， 棄上清，沉淀重懸于5ml含2% BSA和15%甘油的PBS緩沖液中，-70°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0062] 2. 2噬菌體滴度的測定
[0063] 挑取宿主菌（XLl-Blue)單克隆接種于LB培養(yǎng)基，37°C，搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期 (0D_ = 0. 5)。取50 ill制備好的噬菌體懸液，用LB培養(yǎng)基進行系列10倍梯度稀釋。向 稀釋到一定倍數(shù)的懸液中加入對數(shù)生長期的宿主菌，37°C，150?180rpm搖床培養(yǎng)lh。取 培養(yǎng)后的菌液100或200 涂布在LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜，次日，計數(shù)菌落數(shù)，并計算滴 度。
[0064] 2. 3抗IFNa多個亞型特異性抗體的淘選，參照Pharmacia公司的Recombinant phage selection module 用戶手冊（Cat. NO. XY-040-00-05)稍作改動，用 IFNa _2b 和 HSA-IFN a _lb交替進行淘選，具體如下：
[0065] 第一輪IFNa _2b篩選：將重組蛋白抗原IFNa _2b用包被液稀釋為20 ii g/ml (第 二、三輪包被濃度分別為5ug/mL和lug/mL)包被免疫管，1ml/管,4°C包被過夜。次日，免 疫管用PBS洗滌2遍，2min/遍，然后用2% BSA37°C封閉2h(以后各輪交替使用0. 2%酪 蛋白和2% BSA，）。制備好的噬菌體抗體庫用封閉液（同免疫管封閉液，0. 1% TWeen20， 包被抗原為HSA融合蛋白時，相應(yīng)加入終濃度40ug/mL的HSA封閉）37°C封閉30min。將 預(yù)封閉后的噬菌體抗體庫加入封閉后的免疫管中，4 °C作用過夜。棄免疫管中溶液，進行洗 滌：PBST洗10次，5min/次，PBS洗5次，5min/次（以后各輪洗滌強度逐漸加大，依次為： 第二輪PBST洗15次，5min/次，PBS洗10次，5min/次；第三輪PBST洗15次，5min/次， PBS+NaCl 洗 15 次，5min/ 次）。加入 ImlO. 2mol/L 的 Glycine-HCl (pH2. 2)洗脫，室溫作 用IOmin,立即用lmol/L Tris中和至pH7. 4(在第三輪篩選中，首先加入ImlO. 2mol/L的 Glycine-HCl (pH4. 5)洗脫，室溫作用lOmin，棄去洗脫液，用PBS洗滌2次，3min/次。然后再 按照常規(guī)洗脫）。吸出中和后的洗脫液，向其中加入9ml對數(shù)生長期的大腸桿菌XLl-Blue， 37°C緩慢搖床培養(yǎng)Ih ;同時，將免疫管用PBS洗滌一次后，用Iml對數(shù)生長期的大腸桿菌 XLl-Blue直接感染，37°C，150rpm搖床培養(yǎng)lh，然后將從洗脫后的感染菌液和直接感染的 菌液中各取1 %涂2 X YT-CTG平板上，37°C培養(yǎng)至形成清晰的菌落，對克隆數(shù)進行統(tǒng)計，并 計算投入產(chǎn)出比。同時將剩余菌液涂2 X YTCTG平板，37 °C培養(yǎng)過夜。用液體2 X YT-CTG培養(yǎng) 基將菌落刮取下來，取適量菌液投入100ml2 X YTCTG液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)至0D600 =0.5時，按冊1 = 20:1加入輔助噬菌體機31(07，室溫靜置20111111，301：，150印111搖床培養(yǎng) lh，加入等體積的2 X YT-CT培養(yǎng)基（C、T濃度同前），并加入卡那霉素K至終濃度為50 ii g/ ml，IPTG至終濃度0. 15mM，繼續(xù)在30°C、200rpm搖床培養(yǎng)10h，離心收取培養(yǎng)上清加入1/5 體積的PEG8000buffer(20% PEG+2. 5mol/L NaCl)，混勻后于冰上放置45min，沉淀噬菌體。 4°〇，1000(^離心201^11，棄上清，沉淀重懸于51111含0.2%酪蛋白的？85緩沖液中，-701：凍 存?zhèn)溆?。將三份噬菌體測定滴度，按比例合并，投入第一輪的HSA-IFN a _lb篩選。第一輪 HSA-IFN a _lb篩選包被抗原HSA-IFN a _lb濃度為60ug/mL (第二輪為15ug/mL)，篩選過程 其余步驟如前所述。第三輪僅用IFNa _2b篩選。
[0066] 2. 4噬菌體ELISA鑒定陽性克隆
[0067] 挑取經(jīng)篩選后的克隆于96孔深孔板中，每孔250 ill 2 XYTCTG培養(yǎng)基，37 °C搖床培 養(yǎng)至00600 = 0.5，加入1\108?包/!^的輔助噬菌體，室溫靜置151^11，371：，150印111搖床培 養(yǎng)lh，加入等體積2 X YT-CTKI (卡那霉素K終濃度為50 ii g/ml，IPTG終濃度為0. 2mmol/L)， 30°C搖床培養(yǎng)過夜。次日，離心收取上清，加入BSA至終濃度2%，加入Tween-20至終濃度 0. 1 %，37°C靜置15min，備用。抗原（HSA-IFN a _lb和HSA-IFN a _2b)分別用包被液稀釋至 2 U g/ml，加入96孔酶聯(lián)板，50 iil/孔，4°C包被過夜。次日，棄包被液，酶聯(lián)板用PBST洗2 次，PBS 洗一次，每次 3min，用 2% BSA+0. 1% Tween-20 封閉，200iil/孔，37°C，2h。棄去封 閉液，加入經(jīng)封閉后的單克隆噬菌體抗體，50 iil/孔，37°C，靜置lh。棄去液體，用PBST洗 2次，PBS洗一次，200 iil/孔，每次5min。將HRP標記的鼠抗M13抗體用PBST稀釋，稀釋比 例為1 : 5000,同時加入終濃度2%的BSA，37°C預(yù)封閉15min。將預(yù)封閉后的鼠抗M13抗 體加入酶聯(lián)板，50 iil/孔，37°C靜置30min。棄去液體，酶聯(lián)板用PBST洗2次，PBS洗一次， 200 iil/孔，每次5min。棄去洗滌液，加入OPD底物顯色液，50 iil/孔，室溫靜置顯色。用 2M H2SOjS止顯色。酶標儀測定光吸收值0D492/630。
[0068] 包被緩沖液（pH9. 6) :Na2C03l. 59g，NaHC032. 93g，雙蒸水加至 IL ;
[0069] 封閉液：lXPBS+2% BSA(或 0? 2%酪蛋白）+0? 1% Tween20 ;
[0070] 洗滌液 PBST : I X PBS+0. I % Tween20 ;
[0071] OPD 底物液稀釋液：0? 2M Na2HP04(28 . 4g/L)25. 7ml，0. IM 檸檬酸（19. 2g/ L) 24. 3ml,蒸饋水，50ml。
[0072] 2. 5噬菌體單鏈抗體轉(zhuǎn)換為全抗體
[0073] 載體pABGl和pABL分別用于克隆八可變區(qū)基因，分別采用引物H3F(SEQ ID N011)和 HR(SEQ ID N012)擴增 VH3 可變區(qū)基因；L1F(SEQ ID N013)和 LR(SEQ ID N014) 擴增Vu可變區(qū)基因。Vu可變區(qū)基因利用酶切位點BsrG I和Hind III克隆入載體PABL， Vh3可變區(qū)基因利用酶切位點Afl II和NheI克隆入載體pABGl。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ToplO，通過對重組質(zhì)粒進行菌液PCR及測序鑒定，獲得構(gòu)建正確的全抗體輕、重鏈表達載 體。大提質(zhì)粒后將抗體輕重鏈以摩爾比1 :1轉(zhuǎn)染FreeStyle?HEK293-T細胞，進行全抗體的 瞬時表達，經(jīng)ProteinA親和層析柱對表達上清進行純化，并對純化后的全抗體進行電泳分 析、親和力和特異性測定等。
[0074] 2. 6Sifalimumab的全抗體改造、表達和純化
[0075] Sifalimumab的序列信息參見專利US7741449B2。Sifalimumab輕重鏈氨基酸序列 如SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20。設(shè)計其可變區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18,在輕鏈兩端引入酶切位點Xba I和Kas I，在重鏈兩端引入酶切位點Afl II和Nhe I，分別利用酶切連接操作克隆入載體PABK和pABGl。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，通過 對重組質(zhì)粒進行菌液PCR及測序鑒定，獲得構(gòu)建正確的全抗體輕、重鏈表達載體。大提質(zhì)粒 后將抗體輕重鏈以摩爾比I : 1轉(zhuǎn)染HEK293-T細胞，進行全抗體的瞬時表達，經(jīng)ProteinA親 和層析柱對表達上清進行純化，以其為對照抗體開展后續(xù)研究。
[0076] 二、結(jié)果
[0077] 1.全抗體的表達純化
[0078] 對第三輪IFNa _2b篩選獲得的單克隆進行鑒定，獲得特異性噬菌體抗體命名為 AIA22,其噬菌體單鏈抗體可特異性結(jié)合IFN a _2b和INF a _lb，該單鏈抗體的氨基酸和核 苷酸序列如SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示，其輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)氨基酸序列 分別如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
[0079] 將噬菌體抗體AIA22的輕、重鏈可變區(qū)基因以及Sifalimumab的輕、重鏈基因分別 克隆入全抗體瞬時表達載體pABL和pABGl中，構(gòu)建其全抗體輕、重鏈重組表達載體，并通過 HEK293-T細胞瞬時表達系統(tǒng)實現(xiàn)了哺乳動物細胞瞬時分泌表達。經(jīng)Protein A柱純化后獲 得全抗體蛋白純品，其SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2所示，抗體純度較高，電泳條帶位置符合預(yù) 期，可以用于后續(xù)實驗。
[0080] 3. AIA22的特異性鑒定
[0081] 在全抗體水平上對AIA22的特異性進行分析，以HSA-IFN a _lb和HSA-IFN a _2b 為陽性抗原，IFNw、HSA、His-IL6R(帶 His 標簽的 IL6R)、VEGF、TNF、AHC-AP -T(AHC、A3 片段以及肉毒毒素融合蛋白）以及J1EK293碎細胞上清為對照抗原，4°C過夜包被酶聯(lián)板，力口 入純化后梯度稀釋的AIA22全抗體，以HRP標記抗人IgG抗體為二抗進行ELISA，檢測AIA22 全抗體的特異結(jié)合活性。結(jié)果如圖3所示，可以看出，AIA22與目標抗原HSA-IFNa _lb和 HSA-IFNa _2b的結(jié)合是特異的。
[0082] 實施例2 AIA22親和力和體外中和活性分析
[0083] -、材料與方法：
[0084] 1?材料：CM5 芯片購自 GE Healthcare Life Sciences 公司。IFNa _1、IFNa _2、 IFN a _4、IFN a _5、IFN a _6、IFN a _8、IFN a _1〇、IFN a _14、IFN a _16、IFN a _17、IFN a _21 等亞型均購自PBL公司（貨號11002-1)。Daudi細胞（人Burkitt' s淋巴瘤細胞）購買自 中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。CCK-8購自日本同仁化學(xué)株式會社。新生牛血 清NCS購自PAA公司。RPMI1640細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司。其它涉及材料同實施例1。
[0085] 2?方法
[0086] 2. lBIAcore3000系統(tǒng)測定抗體親和力
[0087] 本例采用BIAcore3000系統(tǒng)檢測AIA22對IFN a _2b和HSA-IFN a _lb的親和力， 具體操作步驟如下：
[0088] 將純化后抗體AIA22用HBS-EP緩沖液稀釋至lug/mL，并偶聯(lián)至預(yù)先包被有 Prot-G的CM5芯片上，偶聯(lián)條件：溫度25°C，流速L/min，偶聯(lián)目標值為200RU。抗 原IFNa _2b作為流動相，用HBS-EP作兩倍濃度梯度稀釋，其濃度范圍為20nM?625pM。 測試條件：溫度25 °C，流速30 ii L/min ;結(jié)合時間為3min，解離時間為15min。完成一個 反應(yīng)后，對芯片進行再生，再生條件：3M MgCl2,30uL/minX30s，再生后繼續(xù)偶聯(lián)同樣目 標值的AIA22,進行下一輪反應(yīng)。實驗完畢，扣除空白對照和無關(guān)抗體對照響應(yīng)值，用 BIAevaluation軟件進行結(jié)果分析。
[0089] 以HSA-IFN a _lb作為抗原，重復(fù)上述過程，其濃度范圍為400nM?12. 5nM，結(jié)合時 間為4min，解離時間為20min，其它條件不變。
[0090] 2. 2AIA22體外中和活性分析
[0091] IFNa功能（包括在系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE病理中的作用）的發(fā)揮是通過與細胞表 面的I型干擾素受體IFNAR結(jié)合，激活下游JAK-STAT通路得以實現(xiàn)的。IFNa抑制Daudi 細胞的增殖也是如此。人IFNa抑制體外培養(yǎng)的Daudi細胞增殖效果明顯，并存在確定的 量效關(guān)系。通過評價AIA22在體外阻斷人IFN a與IFNAR的結(jié)合，促進Daudi細胞增殖的 情況，可以間接反映出其在疾病治療當中的實際作用。
[0092] 通過抑制實驗探究不同亞型人IFNa抑制Daudi增殖的細胞毒性曲線，從而確定 其有效抑制濃度；在此基礎(chǔ)上通過抗體阻斷實驗驗證抗人IFNa抗體AIA22的體外中和活 性。具體操作如下：
[0093] 2. 2. IIFNa抑制Daudi細胞增殖的細胞毒性曲線
[0094] 1)細胞懸液計數(shù)，并用含10% NCS的RPMI1640培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋至2xl05個 /mL的最終密度，按50uL/孔接種細胞至96孔板；
[0095] 2)以2ug/mL(或300IU/mL)為起始濃度（HSA融合的IFNa起始濃度采用20ug/ mL，作2倍系列稀釋），用完全培養(yǎng)基對待測IFN a亞型進行1. 5倍系列稀釋，作14個稀釋 度，混勻后按50uL/孔加入相應(yīng)孔中。同時設(shè)置"細胞+空白培養(yǎng)基"、"無細胞+空白培養(yǎng) 基"以及"無細胞+含最高劑量IFNa空白培養(yǎng)基"的對照。
[0096] 3)480rpmX3min振搖培養(yǎng)板，然后置于37°C，5% C02細胞孵箱孵育72h ;
[0097] 4)按IOuL/孔加入CCK-8,240rpmX3min振搖培養(yǎng)板，使充分混合，37°C，5% C02 孵育3h后，用酶標儀檢測吸光值0D450nm/0D630nm ;
[0098] 5)記"細胞+空白培養(yǎng)基"孔的顯色值為A0,含IFNa實驗孔顯色值為As，"無細胞 +含高劑量IFNa空白培養(yǎng)基"的對照孔顯色值為Ab;則細胞的存活率（％) = [(As-Ab)/ (AO-Ab)] X 100%，作細胞毒性曲線。
[0099] 2. 2. 2抗IFN a抗體AIA22體外中和活性評價
[0100] 1)細胞懸液計數(shù)，并用含10% NCS的1640培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋至2X IO5個/ mL的最終密度，按50uL/孔轉(zhuǎn)接細胞至96孔板（每種干擾素亞型占2列，對應(yīng)每種抗體的 14個濃度梯度，同時，抗體的每個濃度對應(yīng)一孔不含干擾素的對照，即每一對mAb/IFN需要 8x4孔，同時設(shè)2個復(fù)孔，總共需要接種的細胞孔數(shù)按此計算）；
[0101] 2)分別用含有IFNa的完全培養(yǎng)基（使用濃度根據(jù)毒性曲線確定，取恰好完全抑 制細胞增殖的濃度）和不含干擾素的完全培養(yǎng)基對抗IFNa抗體AIA22進行2. 5倍系列 稀釋，抗體起始濃度為l〇〇ug/mL，作14個稀釋度，混勻后按50uL/孔加入相應(yīng)孔的細胞中。 此時，每孔細胞最終密度為1\10 4個/10〇1117孔；抗體濃度為5〇1^/1^(3121^)到134?8/ mL(0.84pM);同時設(shè)置不含抗體（僅含IFNa)和空白培養(yǎng)基對照孔。
[0102] 3)37°C，5% CO2 細胞孵箱孵育 72h ;
[0103] 4)按IOuL/孔加入CCK-8, 240rpmX 3min振搖培養(yǎng)板，使充分混合，37°C，5 % CO2 孵育3h后，用酶標儀檢測吸光值0D450nm/630nm ;
[0104] 5)數(shù)據(jù)處理：以不含抗體孔作為0%阻斷效率，以各抗體濃度下不含干擾素的孔 作為100%阻斷效率，計算各濃度抗體/干擾素對應(yīng)的阻斷效率，通過CurveExpert擬合抗 體濃度-阻斷效率曲線，計算EC 5tl值。
[0105] 二、結(jié)果
[0106] I. BIAcore3000系統(tǒng)測定抗體親和力：
[0107] CM5芯片偶聯(lián)抗體AIA22，以濃度梯度的HSA-IFNa_lb和IFNa_2b為流動相，采 用 BIAcore3000 系統(tǒng)測定抗體與 HSA-IFN a _lb、IFN a _2b 的親和力，依托 BIAevaluation 軟件，分析曲線特征，選取適當擬合區(qū)間，擬合曲線并計算抗體親和力（圖4A和圖4B)，結(jié)果 如下表所列。
[0108] 表I AIA22結(jié)合特征

【權(quán)利要求】
1. 一種人源抗人IFN-α抗體，其特征在于，其輕鏈包含以下CDR氨基酸序列，CDRL1序 列如SEQ ID NO. 1所示，CDRL2序列如SEQ ID NO. 2所示，CDRL3序列如SEQ ID NO. 3所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，其重鏈⑶R3含有如SEQ ID NO. 6所示的氨 基酸序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)包含以下CDR氨基酸序列， CDRH1 序列如 SEQ ID NO. 4 所示，CDRH2 序列如 SEQ ID NO. 5 所示，CDRH3 序列如 SEQ ID NO. 6所示。
4. 如權(quán)利要求1?3任一所述的抗體，其特征在于，其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
5. 如權(quán)利要求1?3任一所述的抗體，其特征在于，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
6. 如權(quán)利要求1?3任一所述的抗體，其特征在于，其輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)氨基酸 序列分別如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示。
7. 如權(quán)利要求1?6任一所述的抗體，其特征在于，其為單鏈抗體、Fab、微型抗體、嵌 合抗體或全抗體免疫球蛋白IgGl、IgG2、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD。
8. 編碼權(quán)利要求1?7任一項所述抗體的基因。
9. 如權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于，編碼輕鏈可變區(qū)的基因為如下1)、2)或3) 所示： 1) 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示； 2) 在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子； 3) 與1)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述輕鏈可變區(qū)的DNA分子。
10. 如權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于，編碼重鏈可變區(qū)的基因為如下1)、2)或3) 所示： 1) 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示； 2) 在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子； 3) 與1)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子。
11. 含有權(quán)利要求8?10任一所述基因的表達載體。
12. 含有權(quán)利要求11所述表達載體的宿主菌、宿主細胞或表達盒。
13. 制備權(quán)利要求1?7任一項所述抗體的方法，其特征在于，利用噬菌體展示抗體庫 技術(shù)篩選抗IFN-α特異性單鏈抗體，獲得抗體輕重鏈可變區(qū)基因，并將其克隆入全抗體表 達載體，通過哺乳動物表達系統(tǒng)對其進行全抗體表達，獲得其全抗體蛋白。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述的抗體輕、重鏈可變區(qū)基因的核苷酸 序列如 SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10 所示。
15. -種抗體靶向藥物分子，其特征在于，包含連接于化學(xué)分子、放射性同位素、多肽分 子、毒素或生物大分子的權(quán)利要求1?7任一所述的抗體。
16. 如權(quán)利要求15所述的抗體靶向分子，其特征在于，連接方式為抗體被標記、體外交 聯(lián)或分子偶聯(lián)。
17. -種雙特異性或多特異性分子，其特征在于，包含權(quán)利要求1?7任一項抗體或抗 體的抗原結(jié)合部位。
18. -種抗體與其他蛋白或/和多肽的融合蛋白，其特征在于，包含權(quán)利要求1?7之 任一項抗體和功能性蛋白或多肽分子的復(fù)合物。
19. 如權(quán)利要求18所述的融合蛋白，其特征在于，將抗體基因與免疫毒素或細胞因子 基因連接構(gòu)建重組表達載體，通過哺乳動物細胞或其他表達系統(tǒng)獲得重組融合蛋白分子。
20. 含有權(quán)利要求1?7任一項所述抗體的藥物、制劑或檢測試劑。
21. 權(quán)利要求1?7任一項所述抗體在制備以IFNa為靶標的疾病治療藥物中的應(yīng)用。
22. 如權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的疾病為系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素依 賴型糖尿病、自身免疫性甲狀腺炎、銀屑病、多肌炎、皮肌炎、硬化病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。
【文檔編號】A61K47/48GK104292331SQ201410506009
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】孫志偉, 王雙, 杜鵬, 仇瑋祎, 余云舟 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所