專利名稱：抗tl1a的人源化抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗TLlA的抗體，以及制造和使用這種抗體的方法。預期所述抗體在治 療諸如克羅恩氏病之類的炎癥性疾病方面特別有用。
背景技術：
結構上與腫瘤壞死因子(TNF)有關的蛋白質被統稱為TNF超家族。作為TNF超家 族成員的TLlA是TNF樣細胞因子，它結合至死亡域受體(DR) 3并向活化淋巴細胞提供共刺 激信號。通過這種相互作用，TLlA誘導IFN-Y的分泌，因此可能參與輔助性T細胞-1型 效應子應答的形成。TLlA是II型跨膜蛋白且已被命名為TNF超家族成員15(TNFSF15)。TLlA主要由 內皮細胞和單核細胞表達，并且其表達可由TNF-a和IL-Ia誘導。Migone等，Immunity，16 479-92(2002)。TLla受促炎細胞因子TNF和IL-I正調節(jié)，也受免疫復合物(IC)正調節(jié)。 Hsu 等，Exp. Cell Res.，292 :241_51 (2004)。TLlA經由其關聯受體DR3介導信號轉導，DR3是死亡受體，已知該受體的活化誘導 死亡因子和存活因子。類似于TNF，TL1A也被推定為以同源三體的可溶形式循環(huán)。Kim等， J. Immunol. Methods,298(1-2) 1-8(2005 年 3 月)。TLlA以高親和性結合至死亡受體3 (DR3)，該受體是含死亡域的TNF受體家族的 成員，并且該受體也被稱為Wsl-1、Apo-3、TRAMP和LARD，現被命名為TNF受體超家族成員 25(TNFRSF25)。根據細胞環(huán)境，TLlA與DR3的連接可引發(fā)兩種信號通路中的一種、轉錄因 子NF-kB的活化或胱天蛋白酶的活化以及凋亡。TLl在T細胞共刺激和Thl極化中起作用。 在活化的T細胞上，TLlA經由其表面結合受體DR3特異性地起作用，以促進細胞存活和促 炎細胞因子的分泌。所分泌的誘餌受體3 (DcR3)(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的可溶 性蛋白)阻斷 TLlA 的作用。Kim 等，“Identification of naturallysecreted soluble form of TL 1A, a TNF-Iike cytokine, “ J Immunol Methods，298 :1—8 (2005)。潛在的治療靶標過敏反應和哮喘伴隨由NKT細胞引起的升高的IgE水平和IL-13產量的CD4T細胞的Th2極化是過 敏反應和哮喘中肺部炎癥的主要原因。TLlA在過敏性肺部炎癥方面起主要作用(Fang等， J. Exp. Med. 2008)。TLlA共刺激NKT細胞中IL-4和IL-13產量。通過TLlA抗體或顯性失 活TLlA突變體阻斷TLlA和DR3的相互作用來消除肺部炎癥。肺癌和結腸癌TNF及其受體超家族中的成員調節(jié)免疫應答并誘導凋亡。DR3優(yōu)先由T淋巴細胞 表達，并在T細胞活化期間被上調。DR3的配體是TL1A。TLlA也結合誘餌受體DCR3/TR6，該誘餌受體在幾種肺癌和結腸癌中表達，也在一些正常組織中表達。TLlA受促炎細胞因子 TNF和IL-I的正調節(jié)。TLlA是TLl的較長變體(也稱為VEGI)。動脈粥樣硬化另外，TL IA也已被報道是血管生成抑制性的(angiostatic)且誘導金屬蛋白 酶和 IL-8 基因表達(Su 等，Exp. Cell Res.，312 :266_277 (2006) ；Kang 等，Cytokine, 29 229-235 (2005))。實際上，TLlA和DR3可能因增加促炎細胞因子和趨化因子的產量以及通 過誘導細胞外基質降解酶而降低斑塊穩(wěn)定性而與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制有關(Kang等， Cytokine,29 :229_235(2005))。風濕性關節(jié)炎也有證據表明TL1A/DR3與風濕性關節(jié)炎的病因有關(Bossen等，J. Biol. Chem.， 281 (20) 13964-13971(2006 年 5 月 19 日)。炎癥性腸病研究者已發(fā)現TLlA的表達與炎癥性腸病之間的關聯(Prehn等，Clin. Immunol.， 112:66-77(2004) ；Bamias 等，J. Immunol, 171 4868-4874(2003)) Thl-介導的腸內疾病，例如克羅恩氏病克羅恩氏病是侵襲年輕成年人(20-30歲)的嚴重炎癥性腸病。該病被認為是由 導致效應子(促炎性)和調節(jié)性T細胞應答的失衡的易感性遺傳因素和環(huán)境因素引起的， 導致胃腸黏膜的炎癥和疾病。TL1A/DR3通路在Thl-介導的腸內疾病(如克羅恩氏病)中起重要作用。 Konstantinos φ, The Journal of Immunology,2005,174 =4985-4990(2005) ；Bamias φ, J. Immunol, 171 =4868-74(2003)。因此，TL1A/DR3通路的阻斷可為克羅恩氏病提供治療機遇。TLlA通過抗⑶3和抗⑶28和IL-12/IL-18刺激的外周血(PB)T細胞來增加 IFN- Y產量。通過TLlA的DR3激活誘導形成包含TRADD、TRAF2和RIP的信號轉導復合物， 并且激活NF-kB和ERK、JNK和p38促分裂原活化的蛋白激酶途徑。Kang等，Cytokine，29 229-35(2005)。TLlA可被釋放從而以同源三體的可溶形式循環(huán)。Wen等，〃 TL lA-induced NF-kappaB activation and c_IAP2production prevent DR3_mediated apoptosis in TF-I cells, “ J. Biol. Chem.，278 :39251-8(2003)。死亡受體及其配體在組織穩(wěn)態(tài)的維持和程序性細胞死亡的生理學調節(jié)方面起著 關鍵作用。死亡配體的結合誘導受體的低聚化、經由保守的細胞質信號元件(被稱為死亡 域)的銜接蛋白質的征集(recruitment)、胱天蛋白酶的活化和凋亡的誘導。Young等，Proc Natl. Acad. Sci. USA.，103(22) :8303_8304(2006 年 5 月 30 日)。雖然死亡受體(例如Fas/Apo-l/CD95、TNF-Rl、TRAIL-Rl、TRAIL-R2 或 DR3)最初 被描述為凋亡的誘導物，但越來越多的證據證明這些受體也具有非凋亡功能，包括適應性 免疫應答的調節(jié)。Bamias 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 :8441_8446 (2006)報道稱， TLlA由固有層樹突細胞表達，并通過增加記憶細胞(而非天然CD4+T細胞)的增殖發(fā)揮作 用，且與IL-12和/或T細胞受體的低劑量刺激起協同作用以強烈增加IFN- γ基因表達。 腸中的INF-Y表達已被認為是炎癥的標志，并且用于治療克羅恩氏病的許多策略依賴于 對抑制免疫激活狀態(tài)的大量嘗試。但是，這些方法(類固醇治療和免疫抑制藥物)并不特定地針對腸，因此具有它們本身的并發(fā)癥?；谑褂肨NF-α的拮抗物的靶向療法在1990 年代被成功地提出，參考文件1中報道的結果顯示，特異性地針對TLlA或其受體的療法可 為這種虛弱疾病提供替代性的靶向療法。如在Bamias 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，103 :8441_8446 (2006)中所報道的， 當在炎癥期間在腸中表達時，TLlA似乎具有一種最深遠的作用。雖然在自然殺傷細胞中也 觀察到了增加的表達，但當與IL-12/18結合時，TLlA在誘導IFN- Y在人T細胞中的表達方 面起協同作用(Migone 等，Immunity.，16 :479_492 (2002) ；Papadakis 等，J. Immunol, 174 4985-4990(2005) ；Papadakis 等，J. Immunol，172 :7002_7007 (2004))。Bamias 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，103 =8441-8446(2006)是關于在克羅恩氏病的小鼠模型中觀察到相 似結果的首次報道，并且通過顯示出當T細胞受體被微弱刺激時或當用IL-12處理T細胞 時會發(fā)生協同作用而擴展了早期的數據。雖然在Bamias等中當將TLlA處理與IL-18結 合時未觀察到協同作用，但這一結果并不意外，因為IL-18和TLlA通過NF-kB信號轉導。 盡管Migone等關于TLlA的最初報道證實它是T細胞共刺激信號，但Bamias等證實它是 應答最強烈的記憶T細胞，這與這類T細胞群在表達IFN-γ方面增加的能力相適應。因 為該細胞群確實增殖，它也表達較高水平的TLlA受體，因此進一步提高細胞增殖和表達 IFN-Y的能力。鑒于僅知的TLlA的受體是DR3(—種含死亡域的受體)，并且可能已假定 觸發(fā)該受體會導致細胞死亡，這個發(fā)現可能被認為有些意外。(TL1A經由DR3進行信號轉 導，DR3是其僅知的細胞表面受體。TLlA也結合至可溶性誘餌受體(DcR3))。但是，NF-kB 依賴性抗凋亡基因(例如凋亡抑制劑2)已顯示由TLlA誘導(Wen等，J. Biol. Chem.，278 39251-39258(2003))，因此凋亡的觸發(fā)以及增殖可能是細胞類型依賴性的?？肆_恩氏病的當前治療方案包括抗TNF-α的單克隆抗體、英夫利西單 抗(infliximab) (Remi cade ； Centocor, Inc. , Horsham, ΡΑ)、單克隆抗體阿達木單抗 (Adalimumab)(商標Humira ；Abbott)以及抗發(fā)炎劑(例如，柳氮磺吡啶)、皮質酮或類固 醇(例如，潑尼松)、免疫系統抑制劑(例如，6-巰基嘌呤)和抗生素。但是，英夫利西單抗 是具有高度特異性的僅有的治療方案；其余的治療方案的特異性低。Proc Natl Acad Sci U. S. A.，103 (22) =8303-8304 (2006年5月30日)。這意味著治療未靶向疾病區(qū)域。雖然英 夫利西單抗具有高特異性且通常具有良好的耐受性，但英夫利西單抗可導致肺結核感染的 復發(fā)以及心力衰竭的惡化、脫髓鞘病和增加的淋巴瘤的發(fā)生率。因此，在本領域中仍然需要可被用于各種炎癥性和免疫疾病和病癥的治療和診斷 的組合物，例如過敏反應/哮喘、風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、克羅恩氏病、炎癥性腸病、慢 性阻塞性肺病、牛皮癬、I型糖尿病和移植排異反應。本發(fā)明涉及抗TLlA的單克隆抗體，其 可滿足這種需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明公開一種特異性地結合至TNF樣細胞因子TL1A(參見GenBank登錄號 AF520785)的抗原結合多肽分子。所述多肽包括人源化的重鏈可變區(qū)和人源化的輕鏈可變 區(qū)。例如，該多肽可包括人抗體的輕、重鏈可變區(qū)的構架區(qū)(framework region, FR)，同時 基本保持親本單抗的抗原結合特異性。除互補決定區(qū)(CDR)之外，人源化的重鏈可變區(qū)和 /或人源化的輕鏈可變區(qū)至少約87%被人源化，至少約90%被人源化，至少約95%被人源化，至少約98%被人源化，或者至少約100%被人源化。所述抗原結合多肽分子可衍生自單 抗供體(例如，小鼠單抗供體)且可包括來自單抗的CDR(例如，小鼠單克隆CDR)。該多肽 可起TLlA受體拮抗劑作用。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的多肽的藥物組合物、制造這種多肽和組合物的方法以 及治療需要本發(fā)明的組合物的對象的方法?？墒褂帽景l(fā)明的組合物治療的示例性病癥包括 但不限于自身免疫性疾病(例如狼瘡)、炎癥性腸病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、關節(jié) 炎(例如風濕性關節(jié)炎)、多發(fā)性硬化、移植排異反應、中樞神經系統損傷、Thl介導的腸內 疾病(例如克羅恩氏病)、牛皮癬、白血病或淋巴瘤(例如，慢性淋巴細胞白血病(CLL))、動 脈粥樣硬化、肺癌和結腸癌。在一些實施方式中，所述抗原結合多肽特異性地結合至TLlA并且包括(a)人 源化抗體重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含(1)包含氨基酸序列({L，S，N}Y{G, A}MN)的 CDR-Hl ； (2)包含氨基酸序列(WINT{Y，N}TG{Ε, N}PTYA{D, Q} {D, G}F{K, T}G)的 CDR-H2 和(3)包含氨基酸序列(D{T，Y} {A, G} {Μ, K} {D，Y} {Y，G} {A, D} {M，Y} {A, Y} {Y，A}MDY)的 CDR-H3 ；和(b)人源化抗體輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含(1)包含氨基酸序列({K，R} SSQ {N，S} {I, L} V {H, Y} S {D, N} GNTYL {E, N, D})的 CDR-Ll ； (2)包含氨基酸序列(KVSNR{F，D} S)的 CDR-L2 和(3)包含氨基酸序列({F，M}QG{S，T}H{V，-} {P,-} {L，-} {Τ,-})的 CDR-L3。在某些實施方式中，所述抗原結合多肽特異性地結合至TLlA并且包括人源 化抗體重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含(1)⑶R-H1，所述⑶R-Hl包含下述氨基酸序列、 基本上由下述氨基酸序列組成或由下述氨基酸序列組成TSNMGVV ;(2)CDR-H2，所述 CDR-H2包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列組成或由下述氨基酸序列組成 HILffDDREYSNPALKS ；和(3) CDR-H3，所述CDR-H3包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸 序列組成或由下述氨基酸序列組成MSRNYYGSSYVMDY。在一些實施方式中，所述抗原結合多肽包含人源化抗體重鏈可變區(qū)，所述重鏈可 變區(qū)包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列組成或由下述氨基酸序列組成QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSNMGVVfflRQPPGKALEffLAHILffDDREYSNPALKSRL TISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMSRNYYGSSYVMDYWGQGTLVTVSS。在所述多肽的一些實施方式中，(I)CDR-Hl由氨基酸序列(LYGMN)或(NYGMN) 構成；(2) CDR-H2由氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDFKG)構成；(3) CDR-H3由氨基酸序列 (DTAMDYAMAY)或 DYGKYGDYYAMDY 構成；(4)CDR-Ll 由氨基酸序列(KSSQNIVHSDGNTYLE)或 (RSSQSIVHSNGNTYLD)構成；(5)CDR_L2 由氨基酸序列(KVSNRFS)構成；并且(6)CDR_L3 由氨 基酸序列(FQGSHVPLT)構成。在一些實施方式中，所述多肽包含以下人源化抗體重鏈可變區(qū)(Q{V，1} QLVQSG{S, P}ELKKPG{Α, Ε} {S, Τ}VK{V, 1}SCKASGYTFT{L, S, N} YlG, A}MNffV{R, K}QAPG{Q, K}GL{Ε, KlffMGffINTlY, N}TG{Ε, N}PTYA{P, Ql{P, GlF{K, TlGRF{V, A}FSL{D, Ε}TS{V, A} STAYLQI {S，N} {S, Τ} LK {A, N} ED {Τ, Μ} A {V, Τ} Y {Y, F} CARD {Τ, Y} {A, G} {Μ, K} {D, Y} {Y, G} {Α, D} {Μ, Y} {Α, Y} {Y，A}MDY) WGQGT{L, SjVTVSS)。例如，所述多肽可包含以下人源化抗體重鏈 可變區(qū)(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNffVRQAPGQGLEWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDTAMDYAMAYffGQGTLVTVSS)或
(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDTAMDYAMAYWGQGTLVTVSS)?？蛇x地，所述多肽可包含以下人源化抗體重鏈可變區(qū)(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVRQAPGQGLEWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYGKYGDYYAMDYffGQGTLVTVSSS)或(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVRQAPGKGLKWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYGKYGDYYAMDYffGQGTLVTVSS)。在一些實施方式中，所述多肽包含以下人源化抗體輕鏈可變區(qū)(DVVMTQ{T，S} PLSLPV{Τ, S} {P, L}G{E, D, Q} {P, Q} ASISC{K, RiSSQIN, Si U, L iViH, Yi SDGNTYL IE, Ni W{Y, F} {L, Q}Q{K, R} PGQSP {Q, K, R} {L, V, Ri LIYKVSNRiF, Di SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI IS, N} RVEAED{L, V}GVY{Y, FlC{F, MlQG{S, TlHiV, ~1 {P, ~1 {L, ~1 {T, ~1 {F, ff}G{G, S, Q}GTK{V, L} EIKR)。例如，所述多肽可包含以下人源化抗體輕鏈可變區(qū) (DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR)或(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR)。在另一個實施方式中，所述多肽可包 含以下人源化抗體輕鏈可變區(qū)(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIKR)。本發(fā)明還公開人源化抗體重鏈可變區(qū)。所述人源化抗體重鏈可變區(qū)可包含(1) 包含氨基酸序列({L，S，N}Y{G，A}MN)的CDR-Hl ； (2)包含氨基酸序列(WINT {Y，N} TG {E，N} PTYA {D，Q} {D，G}F{K，T}G)的 CDR-H2 ；禾口 (3)包含氨基酸序列(DTAMDYAMAY)的 CDR-H3。例 如，所述人源化抗體重鏈可變區(qū)可包含以下氨基酸序列(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNffVRQAPGQGLEWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDTAMDYAMAYffGQGTLVTVSS)。可選地，所述多肽可包含以下 人源化抗體重鏈可變區(qū)(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNffVKQAPGKGLKWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDTAMDYAMAYffGQGTLVTVSS)。在另一個實施方式中，人源化抗體重鏈可變區(qū)包含(1)包含氨基酸序列(NYGMN) 的CDR-Hl ； (2)包含氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDFKG)的CDR-H2 ；和(3)包含氨基酸序列 (DYGKYGDYYAMDY)的CDR-H3。例如，該人源化抗體重鏈可變區(qū)可包含以下氨基酸序列(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVRQAPGQGLEWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYGKYGDYYAMDYWGQGTLVTVSS)?？蛇x地，所述多肽可包含 以下序列的人源化抗體重鏈可變區(qū)(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVKQAPGKGLKWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYGKYGDYYAMDYWGQGTLVTVSS)。在另一個實施方式中，人源化抗體重鏈可變區(qū)包含(1)包含氨基酸序列(NYAMS) 的CDR-Hl ； (2)包含氨基酸序列(TIYSGGGYTFYLDSLKG)的CDR-H2 ；和(3)包含氨基酸序列 (HSYPMTTVITYAPYYFYY)的CDR-H3。例如，所述人源化抗體重鏈可變區(qū)可包含以下氨基酸序列(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMSWVKQAPGKGLKWMGTIYSGGGYTFYLDSLKGRF VFSLDTSVSTAYLQSSLKAEDTAVYFCARHSYPMTTVITYAPYYFYYWGQGTLVTVSS)。本發(fā)明還公開人源化抗體輕鏈可變區(qū)。所述人源化抗體輕鏈可變區(qū)可包含.(1) 包含氨基酸序列({K，R} SSQ {N，S} {I，L} V {H，Y} S {D，N} GNTYL {E，N，D})的 CDR-Ll ； (2)包含 氨基酸序列(KVSNR{F，D}S)的 CDR-L2 ；和(3)包含氨基酸序列({F，M}QG{S，T}H{V，-} {P,-} {L，-} {Τ, -})的 CDR-L3。在其他實施方式中，抗原結合多肽特異性的結合至TLlA并且包括人源化抗體輕 鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含(1)⑶R-L1，所述⑶R-Ll包含下述氨基酸序列、基本上由 下述氨基酸序列組成或由下述氨基酸序列組成SASSSVNYMH ； (2)⑶R-L2，所述⑶R-L2包 含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列組成或由下述氨基酸序列組成STSNLAS ；和 (3)CDR-L3，所述CDR-L3包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列組成或由下述氨 基酸序列組成HQWNNYGT。在一些實施方式中，抗原結合多肽包含人源化抗體輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū) 包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列組成或由下述氨基酸序列組成DIQLTQSPSFLSASV⑶RVTTTCSASSSVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTE FTLTISSLQPEDFATYYCHQffNNYGTFGQGTKVEIKR。例如，人源化抗體輕鏈可變區(qū)可包含以下氨基酸序列DVVMTQSPLSLPVTLGQPASIS CKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVP LTFGGGTKVEIKR)。在另一個實施方式中，所述多肽可包含以下序列的人源化抗體輕鏈可變 區(qū)(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIKR)?？蛇x地，所述多肽可包含以下序列的 人源化抗體輕鏈可變區(qū) DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffYLQKPGQSPQLLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR，或DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKINRVEAEDVGVYFCFQGSHVPLTFGGGTKLEIKRo人源化抗體輕鏈可變區(qū)還可包含(1)包含氨基酸序列(RSSQSIVHSNGNTYLD)的 CDR-Ll ； (2)包含氨基酸序列(KVSNRFS)的CDR-L2 ；和(3)包含氨基酸序列(FQGSHVPLT)的 CDR-L3。例如，人源化抗體輕鏈可變區(qū)可包含以下氨基酸序列(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLDffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKRo 可選地，所述多肽可包含以下序列的 人源化抗體輕鏈可變區(qū)(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLDffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIKR))。在另一個實施方式中，人源化抗體輕鏈可變區(qū)包含⑴包含氨基酸序列 (RSSQSIVHSNGNTYLD)的 CDR-L 1 ； (2)包含氨基酸序列(KVSNRFS)的 CDR-L2 ；和(3)包含氨 基酸序列(FQGSHVPLT)的⑶R-L3。例如，人源化抗體輕鏈可變區(qū)可包含以下氨基酸序列(DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLDffYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR))，或(DWMTQTPLSLPVSL ⑶ QASISCRSSQSIVHSNGNTYLDWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCFQGSHVPLTFGGGTKLEIKR))。前述人源化重鏈和人源化輕鏈可存在于特異性地結合至TLlA的抗原結合多肽中。抗原結合多肽可選自抗體分子、Fab片段、Fab，片段、F(ab' )2片段和scFv分子。 在一些實施方式中，所述多肽是抗體分子?？贵w分子可包括嵌合抗體，該嵌合抗體包括人重 鏈恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)。例如，當多肽包括IgG分子的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)時，抗體 分子可為IgG分子(例如，IgGl或IgG4分子)。多肽可為scFv分子。例如，scFv的分子式 可選自NH2-L-VH-X-VK-C00H和NH2-L-VK-X-VH-C00H ；其中L是前導序列；VH是人源化抗體 重鏈可變區(qū)；X是連接多肽；并且VK是人源化抗體輕鏈可變區(qū)。所述多肽可為Fab HSA融合 分子。例如，Fab HSA融合物的分子式選自結合有NH2-VK-CK-CooH的NH2-VH-CH1-HSA-C00H ； 其中VH-CHl-HSA是人源化抗體重鏈可變區(qū)(VH)和人重鏈恒定區(qū)1 (CHl)與人血清白蛋白 (HSA)形成的融合蛋白，該融合蛋白隨后與其同源的人源化抗體輕鏈可變區(qū)(VK)和人κ恒 定區(qū)(CK)混合(fold)以形成Fab HSA融合蛋白?？乖Y合多肽還可共軛或融合至治療試劑或診斷試劑。例如，治療試劑可選自細 胞毒素試劑、放射性標記、免疫調節(jié)劑、激素、酶、寡核苷酸、光敏治療劑或它們的組合。診斷 試劑的例子可包括放射性標記、光敏診斷劑、超聲增強劑或非放射性標記?？乖Y合多肽可為TLlA的拮抗劑。通常，所述多肽不是TLlA的激動劑?？乖Y合多肽以特異性和高親和性結合至TLlA受體。通常，所述多肽以至少約 IO6M4 (優(yōu)選至少約lOl1，更優(yōu)選至少約108Μ_\更優(yōu)選至少約10 的親和常數結合至 TLlA0本發(fā)明還公開了包含前述抗原結合多肽以及載體(例如，稀釋劑或賦形劑)的藥 物組合物。所述藥物組合物可進一步包含額外的如本文所公開的治療試劑或診斷試劑。本發(fā)明還公開了治療或診斷疾病或病癥的方法，所述方法包括給有需要的患者服 用所公開的藥物組合物。例如，藥物組合物可被服用以治療或診斷炎癥性的、免疫性的和/ 或癌癥的疾病或病癥。疾病和病癥的例子可包括自身免疫疾病(例如，狼瘡)、炎癥性腸病 (IBD)、慢性阻塞性肺病(C0PD)、關節(jié)炎(例如，風濕性關節(jié)炎)、多發(fā)性硬化、移植排異反 應、中樞神經系統損傷、克羅恩氏病、牛皮癬、I型糖尿病、肺癌和結腸癌、以及白血病或淋巴 瘤(例如，慢性淋巴細胞白血病(CLL))。本發(fā)明還公開了編碼前述多肽的多核苷酸。該多核苷酸可被可操作地連接至用于 在適當宿主細胞中表達所編碼的多肽的啟動子。這樣，生產由重組多核苷酸編碼的多肽的 方法包括a)培養(yǎng)用重組多核苷酸轉化的細胞以表達所編碼的多肽；和b)回收以這種方式 表達的多肽。之前的一般性描述以及以下


和詳細描述都是示例性和說明性的，并且旨 在提供對所要求保護的發(fā)明的進一步解釋。從以下本發(fā)明的詳細描述，本領域技術人員可 容易看出本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點和新的特征。

圖1圖示小鼠和倉鼠抗TLlA抗體對在TF-I細胞上的人TLlA (huTLlA)-誘導的胱天蛋白酶活性的抑制。Ab#l-19E06 ；Ab#2-12D01 ；Ab#3-15E09 ；Ab#4-16H02 ；Ab#5_14A03 ； Ab#6-04H08A ；Ab#7-12F11 ；Ab#8_12D08。圖2圖示小鼠抗TLlA 16H02的VH區(qū)與最接近的人類種系基因IGHV7-4-1-02的 比對。比對被用作模板以產生人源化的16H02VH的兩種不同版本，在圖中被標記為新人 16H02VH#1 和新人 16H02VH#2。圖3圖示兩種不同版本的人源化抗TLlA VH的小鼠與人之間的突變的數目以及人 源化百分率。圖4圖示小鼠抗TLlA 16H02的VK區(qū)與最接近的人類種系基因A17的比對。該比 對被用作模板以產生人源化的16H02VH的兩種不同版本，在圖中被標記為新人16H02VK#1 和新人 16H02VH#2。圖5圖示兩種不同版本的人源化抗TLlA 16H02VK的小鼠與人的突變的數目以及 人源化百分率。圖6圖示用人16H02抗TLlA VH#1和VH#2和人16H02 VH#1和VK#2瞬時轉染293F 細胞以產生全長人源化抗體分子的結果。圖7通過顯示與小鼠抗TLlA抗體對照相比人源化抗體對TF-I細胞中TLlA誘導的 胱天蛋白酶活性的抑制而圖示了一輪人源化過程后16H02 TLlA單克隆抗體的活性。12D01 =小鼠抗TLlA陰性對照；16H02 =小鼠抗TLlA陽性對照；19E06 =倉鼠抗TLlA對照；3009 =人源化的抗TLlA 16H02VH#1+VK#1 ；3010 =人源化的抗 TLlA 16H02 VH#2+VK#1 ；3011 =人源化的抗 TLlA 16H02 VH#1+VK#2 ;3012 =人源化的抗 TLlA 16H02 VH#2+VK#2。圖8圖示16H02 VK構架的完全人源化所需要的最終突變。為產生完全人源化的 16H02輕鏈，將新人16H02 VK#2(見圖4)起始序列與A17種系序列比對，3個獨特的區(qū)域或 區(qū)段被標記出來(實心圓圈)用于進一步的誘變。構建了合成的輕鏈，該輕鏈含有在這3 個區(qū)域或區(qū)段的每一個內的非突變的野生型VK#2序列( = W)或A17人類種系序列( = M) 的所有可能的組合。圖9圖示最終版本的人源化的16H02VK的瞬時轉染ID和LDC#。生成了合成的輕 鏈，該輕鏈含有圖8的新人16H02 VK#2的3個獨特區(qū)域或區(qū)段內的野生型(W)或突變(M) 序列的所有可能的組合。隨后用圖2的新人16H02VH#1共轉染合成的輕鏈，所產生的抗體 被用于測試對huTLlA誘導的胱天蛋白酶活性的抑制。圖10圖示圖9的一組不同人源化抗TLlA抗體對TF-I細胞上人TLlA(huTLlA)誘 導的胱天蛋白酶活性的抑制。被標記為3038的完全人源化的16H02TL1A抗體的活性被與 原始小鼠抗TLlA抗體16H02的活性比較。圖11圖示五種首要(lead)候選小鼠抗TLlA抗體的VH區(qū)的序列比對1B4、25B9、 11D8、27A8 和 38D6。圖12圖示五種首要候選小鼠抗TLlA抗體的VK區(qū)的序列比對1B4、25B9、11D8、 27A8 和 38D6。圖13圖示人源化的1B4VH區(qū)(人1B4VH AA)與原始小鼠VH區(qū)(1B4VHAA)和最接 近匹配的人類種系VH區(qū)(VH2-70-10)的序列比對。圖14圖示人源化的1B4VK區(qū)(人1B4VK AA)與原始小鼠VK區(qū)(1B4VKAA)和最接近匹配的人類種系VK區(qū)(VK-L8)的序列比對。圖15圖示與小鼠11D8抗體相比，人源化的TLlA抗體(1B4、11D8、25B9)對哺乳動 物來源的TLlA誘導的胱天蛋白酶活性的抑制。
具體實施例方式定義如本文所描述的，抗體是指全長(即，天然的或由通常的免疫球蛋白基因片段重 組過程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫學活性(即， 特異性結合)部分，例如抗體片段?？贵w片段是抗體的一部分，例如F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。無論 結構如何，抗體片段與完整抗體所識別的相同抗原結合。術語“抗體片段”包括適配體、鏡 像體(speigelmer)和雙抗體。術語“抗體片段”還包括通過結合至特異性抗原形成復合物 而像抗體一樣的合成的或基因工程化的蛋白質。例如，抗體片段包括由可變區(qū)構成的分離 的片段，例如由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)構成的“Fv”片段；重組單鏈多肽分子，其中輕鏈 可變區(qū)和重鏈可變區(qū)通過肽接頭(“scFv蛋白”)連接；Fab HSA融合多肽，其中VH-CHl與 HSA被生產為融合蛋白，該融合蛋白隨后與其同源的VK-CK輕鏈混合以形成Fab ；以及由類 似高變區(qū)的氨基酸殘基構成的最小識別單元。人源化抗體是一種重組蛋白，其中來自一個物種的抗體(例如，嚙齒動物抗體)的 CDR被從嚙齒動物抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)轉移至人重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，或 轉移至已被誘變成包括至少一部分的人重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的重鏈可 變區(qū)和輕鏈可變區(qū)(被表示為“人源化百分率”)。抗體分子的恒定區(qū)可來源于人抗體的恒 定區(qū)。如本文所使用的，“人源化百分率”是通過以下方法計算的確定人源化區(qū)域和種 系區(qū)域之間的構架氨基酸差異(即，非CDR差異)的數目，從氨基酸的總數中減去該數目， 再除以氨基酸的總數并乘以100。如本文所使用的，“CDR”是指存在于抗體重鏈的可變區(qū)(VH)或抗體輕鏈的可變區(qū) (VL或VK)的“互補決定區(qū)”。每個可變區(qū)包括三個⑶R，對于存在于重鏈可變區(qū)的⑶R，它們 被命名為⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，對于存在于輕鏈可變區(qū)的⑶R，它們被命名為⑶R-L1、 CDR-L2和CDR-L3。本文使用了 Kabat編號系統。這樣，CDR-Hl開始于約氨基酸31 (即， 第一個半胱氨酸殘基后約9個殘基)，包括約5-7個氨基酸，并結束于下一個色氨酸殘基。 ⑶R-H2開始于⑶R-Hl結束后的第十五個殘基，包括約16-19個氨基酸，并結束于下一個精 氨酸或賴氨酸殘基。CDR-H3開始于CDR-H2結束后的約第三十三個氨基酸殘基，包括3_25 個氨基酸，并以W-G-X-G結束，其中X是任何氨基酸。CDR-Ll開始于約殘基24 (即，在半胱 氨酸殘基之后)，包括約10-17個殘基，并結束于下一個色氨酸殘基。⑶R-L2開始于⑶R-Ll 結束后的約第十六個殘基，并包括約7個殘基。CDR-L3開始于CDR-L2結束后的約第三十三 個殘基(即，在半胱氨酸之后)，包括約7-11個殘基，并以序列F或W-G-X-G結束，其中X是 任何氨基酸。共軛至治療試劑或診斷試劑本文公開的抗原結合多肽可被共軛或融合至治療試劑，所述治療試劑可包括放射性標記、免疫調節(jié)劑、激素、光敏治療劑、細胞毒素試劑(可為藥物或毒素)和它們的組合。 藥物可包括具有藥物性質的那些藥物，藥物可選自抗有絲分裂劑、抗激酶劑、烷基化劑、抗 代謝劑、抗菌劑、生物堿、抗血管生成劑、凋亡劑和它們的組合。更具體地，這些藥物選自氮 芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、C0X-2抑制劑、嘧啶類似 物、嘌呤類似物、抗生素、酶、表鬼白毒素、鉬類金屬配位復合物、長春堿類、取代脲、甲基胼 衍生物、腎上腺皮質激素抑制劑、拮抗劑、內皮抑素、紫杉醇、喜樹堿、蒽環(huán)類、紫杉烷、它們 的類似物和它們的組合。本發(fā)明的毒素可選自蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、肥皂草毒蛋 白、核糖核酸酶(RNase)，例如抗腫瘤核糖核酸酶(onconase)、DNaseI、葡萄球菌腸毒素Α、 美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內毒素。免疫調節(jié)劑可選自細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因 子(CSF)、干擾素(IFN)、促紅細胞生成素、血小板生成素和它們的組合。特別有用的是淋巴 毒素(例如腫瘤壞死因子(TNF))、造血因子(例如白介素(IL))、集落刺激因子(例如粒細 胞集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如干擾 素_ α、干擾素_ β或干擾素_ Y )和干細胞生長因子(例如所命名的“Si因子”)。更具體地， 免疫調節(jié)劑可包括 IL-I、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-y TNF- α 或它們的組合。本文公開的抗原結合多肽可被共軛或融合至診斷試劑。診斷試劑可包括光敏診斷 劑或能量為60至4000keV的放射性標記，或非放射性標記。放射性標記優(yōu)選為Y射同位 素、β發(fā)射同位素和正電子發(fā)射同位素，且選自125I、131I、123I、124I、86y、186Re、188Re、62CU、64CU、 mid^Ga^TdCF^C^N^O^Br和它們的組合。診斷試劑可包括造影劑，例如 猛、鐵或利用雜交瘤技術制造抗TLlA抗體的示例性方法BALB/c小鼠可用重組TLlA蛋白(細胞外結構域)免疫。在通常的程序中，皮下注 射在50ml的弗氏完全佐劑(Sigma)中的IOmg蛋白?？山o予兩至四次額外的注射(使用在 弗氏不完全佐劑中的蛋白)，注射每隔2周進行一次，隨后為最終的加強免疫(使用在PBS 中的蛋白)?？蛇x地，可在腳肉墊中給予注射。三天后可處死小鼠，可收集它們的脾或胭淋 巴結，并可分離淋巴細胞用于融合?？衫肞EG/DMSO(Sigma)作為融合劑以5 1的比率 將淋巴細胞與P3X63Ag8. 653漿細胞瘤細胞融合。融合后，細胞可被重懸在選擇性HAT培養(yǎng) 基中并以IO6個細胞/孔接種于96孔平板中。經受住HAT選擇的雜交瘤的上清液可通過 直接結合ELISA來篩選，以確定TLlA結合抗體的存在?？勺R別出分泌TLlA結合抗體的雜 交瘤，并且它們的上清液可通過抑制結合ELISA而被進一步篩選，以篩選出抑制TLlA結合 至其受體DR3的抗體。被識別為對TLlA結合的抑制呈陽性的雜交瘤隨后可被篩選，篩選對 象為在TF-I細胞中的TLlA誘導的胱天蛋白酶活性的抑制，以識別出TLlA拮抗克隆。示例性抗體人源化策略人源化抗TLlA抗體的一個目的在于獲得保留90%至100 %的原始結合親和性和 特異性的70%至100%的人源化的VH區(qū)和VK區(qū)。VH和VK的單個高風險位置的位點定向 誘變可被用來進一步人源化抗體，同時維持結合親和性和特異性。人源化可通過⑶R移植和基于結構的分析以及可變區(qū)表面再造(resurfacing) 而進行。(參見 Jones 等，NATURE (1986) 5 月 29 日-6 月 4 ；321 (6069) :522_5 ； Roguska等，PROTEIN ENGINEERING,1996,9(10) :895_904 ；和 Studnicka 等，Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving3-D Structure. PROTEIN ENGINEERING,1994,H 7卷，第805頁。)抗體一級序列和3-D結構數據可被用來識別維持結合親和性和特異性所 需的關鍵構架殘基。由NCBI贊助的“Blast for Ig sequences”網站可被用來識別與用在 本研究中的小鼠VH區(qū)和VK區(qū)的最接近匹配。人類種系VH基因和VK基因可被選擇作為與 小鼠VH序列和VK序列的最佳匹配?？蛇x地，來自天然表達的人抗體譜的序列可被單獨用 作或與最接近匹配的人類種系基因一起用作人源化的模板。將小鼠抗TLlA VH和VK與最接近的人類種系或表達的基因譜 (expressed!·印ertoire of gene)的比對后，在每個位置的氨基酸都可被評價對結合和免 疫原性的潛在影響。該信息可被用來為每個位置的突變分配低、中等或高危值。在一個實 施方式中，只有低和中等危險位置被突變，而避免突變高危位置。如果需要，可通過在VH、 VK或兩者的CDR的每個位置加入酪氨酸配對而進行親和性成熟策略。來自雜奪瘤細胞』系的鼠禾斗云M勿杭TLlA VH K和VK K的劍列t?？私岛蜏y丨序雜交瘤細胞可被富集、用PBS洗滌3次，并根據生產商實驗方案利用Trizol試 劑(Invitrogen，目錄號15596-026)提取RNA?？筛鶕a商實驗方案利用5' RACE試劑 盒(Rapid Amplification of cDNA Ends, Invitrogen,目錄號 18374-058)將總 RNA 轉換 為cDNA。簡言之，RNA可被連接至隨機六聚體引物(Random N6)，并且第一鏈cDNA可利用 superscript II RNAase H陰性逆轉錄酶來產生?？衫门c該試劑盒一起提供的GlassMax 自旋筒(spin cartridge)純化cDNA，并且將cDNA與TdT (末端脫氧核糖核酸轉移酶)在 存在dCTP的情況下反應以在5，端將C堿基對添加至cDNA。帶dC尾巴的cDNA可利用對 dC尾巴特異的錨定引物以及基因特異引物而被PCR擴增，所述基因特異引物雜交至小鼠的 VH重鏈恒定區(qū)(CHl)和VK恒定κ區(qū)(CK)中的高度保守的DNA序列。所產生的PCR產 物可通過凝膠電泳分析對應于完整VH或VK區(qū)的正確尺寸，隨后根據生產商實驗方案純化 和連接進Τ0Ρ0 TA載體(Invitrogen目錄號K4575-01)中。轉化進細菌后，DNA可從含有 正確尺寸插入物的克隆中制備，DNA序列可利用Big Dye終止劑測序反應混合器(Applied Biosystems，部件號4336699)和3700ABI/Prism DNA分析儀根據生產商實驗方案來測定。示例性人源化鼠科動物抗TLlA抗體鼠科動物抗TLlA抗體可基于如上所產生的結合數據和序列數據而被識別。可利 用當前可獲得的公共數據庫(即，NCBI的IgG的Blast以及MRC的V-base)將這些抗體的 VH區(qū)和VK區(qū)的氨基酸序列與人類種系VH區(qū)和VK區(qū)比對。在構架中，在小鼠序列與人類種 系不同的那些位置處，迭代過程可被用來轉換或突變小鼠構架，因而小鼠構架匹配相應的 人類種系構架。另外或可選地，VH和VK的某些CDR氨基酸殘基可通過用酪氨酸(即，親和 性成熟的酪氨酸)替換而被突變，從而潛在地幫助彌補因構建殘基變化導致親和性的任何 損失。親和性成熟的且人源化的小鼠VH區(qū)和VK區(qū)可利用一組重疊的合成DNA寡核苷酸通 過聚合酶鏈反應過程產生。作為合成基因設計過程的一部分，可使用密碼子優(yōu)化策略，就是 說哺乳動物細胞為基因表達而優(yōu)先使用的每個氨基酸的三聯密碼子可被加入在每個位置。 合成的VH區(qū)和VK區(qū)可被克隆進專門的哺乳動物表達載體中，該表達載體允許相應的區(qū)在 完全是人的IgGl、G4或κ抗體骨架(antibody backbone)中表達。人源化抗體的小規(guī)模 生產可通過以下方法實現按照生產商實驗方案，利用脂質轉染胺(Invitrogen)將IgGl或G4構建體與κ構建體共轉染進239F細胞中。來自瞬時轉染的上清液可通過蛋白質A或G 樹脂，IgG可被純化至同質以用于基于細胞的分析中測試。以下實施例用來說明本發(fā)明。但應當理解，本發(fā)明不限于這些實施例中描述的特 定條件或細節(jié)。本文描述的所有公布文獻和/或公眾可獲得的文件都通過引用明確合并至 本文中。實施例1如本文所述制備的小鼠和倉鼠抗TLlA單克隆抗體的VH和VK區(qū)的氨基酸序列如 下所示?？勺儏^(qū)的CDR區(qū)域以下劃線表示。12D08VK DVLMTQTPLS LPVSL⑶QAS ISCRSSQSIV HSNGNTYLDff YLQKPGQSPN LLIYKVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP LTFGAGTKLE LKR16H02VK DVLMTQTPLS LPVSL⑶QAS ISCKSSQNIV HSDGNTYLEff YLQKPGQSPK LLIYKVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP LTFGSGTKLE IKR15E09VK ETTVTQSPAS LSMAIGEKVT IRCITSTDID DDMNWYQQKP GEPPKLLISE GNTLRPGVPSRFSSSGYGTD FVFTIEWLS EDVADYYCLQ SDNLPLTFGA GTKLELKR19E06VK DIVMTQSPSS LAVSTGGTVT LTCLSSQSLF SSDTNKNYLN WYLQKPGQSP KLLVYHASTRLTGVPDRFIG SGSGTDFTLT INSVQAEDLG DYYCQQHFRP PFTFGRGTKL EIKRIB4VK AAQIVLTQSPAIMSASLGAEITLTCSASSSVNYMHWYQQRSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQffNNYGTFGGGTKLEIKR25B9VK AAENVLTQSPAILAASLGQKVTMTCSASSSVSSGYLHWYQQKSGASPKPLIHRTSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLSISSYEAEDDATYYCQQffSGFPFTFGSGTKLEIKR27A8VK AADIVLTQSPASLTVSLGQRATISCRASQNVSTSSYSHMHWSQQKPGQPPKLLIKYASNLDSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDIATYYCQHSffEIPYTFGGGTKLEIKR11D8VK AADIVMTQSPASLTVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSHMHWYQQKPGQPPKLLIRYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTAIYYCQHSffELPYTFGGGTKLEIKR38D6VK AADIVLTQFPASLPVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSHMHWYQQKPGQPPKLLITYASNLDSGVPARISGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCHHSffELPYTFGGGTKLEIKR12D08VH QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGff INTYTGEPTYADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAKDY GKYGDYYAMD YffGQGTSVTVSS
16H02VH QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT LYGMNWVKQA PGKGLKWMGff INTYTGEPTYADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINTLKNED MATYFCARDT AMDYAMAYffG QGTSVTVSS15E09VH EVKLVDSGGG LVQPGDSLRL SCATSGFTFS DFYMEffVRQP PGKRLEffIAA SGNKANDYTTEYSASVKGRF IVSRDTSQSI LYLQMNDLRA EDTAIYYCVR DAGYGYffYFD VffGAGTTVTVSS19E06VH QIQLQESGPS LVKPSQSLSL TCSVTGYSIT SDSYffNWIRQ FPGKNLVWMG YISYRGSTNYNPSLKSRISI TRDTSRNQFF LQLNSVTTED TATYYCARYS GYSFffYFDFff GQGTQVTVSS1B4VHa. QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLTTSNMGVVfflRQPSGKGLEffLLHILffDDREYSNPALKSRLTISKDPFNNQVFLKIANVDTADTATYYCARMSRNYYGSSYVMDYffGQGTSVTVSS25B9VHEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKTGQGLEfflGYINSNNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCATGDYYGGTSYffYFDVffGAGTTVTVSS11D8VHEVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNVKQSNGKSLEfflGNIDPYFGDTNNYNQNFKGRATLTVDKSSNTAYMQLMSLTSEDSAVYYCAREGAARAKNYFDYffGQGTTLTVSS27A8VHEVQLQQSGPELETPGASVKISCKASGYSFTGYNMNVVKQTNGKSLEfflGNIDPYFGDANYNRKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLRSLTSEDSAVYYCAKEGAARAKNYFDYffGQGTTLTVSS38D6VH AAEVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNVVRQTNGKSLEfflGHIDPYYGDATYRQKFKGKATLTVDKSSNTAYMQLKSLTSEDSAVYFCAREGAARARNYFDYffGQGTTLTVSS實施例2本實施例描述了測量TF-I細胞上TLlA誘導的胱天蛋白酶活性的抑制的分析方案。為測定抗TLlA抗體的中和活性，測定了它們對在TF-I細胞中的TLlA誘導的胱天 蛋白酶活性的作用。見圖1。在含有胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中，在帶透明底的黑色96 孔平板中，以75000個細胞/孔接種TF-I細胞。在不存在或存在各種濃度的小鼠或倉鼠親 本TLlA抗體的情況下，在37°C用10yg/mL環(huán)己酰胺和100ng/mL TLlA處理細胞6小時。 通過Apo-One均質胱天蛋白酶-3/7分析試劑盒(Promega)測量胱天蛋白酶活性。含有胱 天蛋白酶底物(Z-DEVD-Rhodamine)的等體積的Ap0-One均質胱天蛋白酶_3/7分析緩沖液 被添加至每個含有細胞的孔中。溫育過夜后，通過具有485nm的激發(fā)濾片和535nm的發(fā)射 濾片的Wallac Victor2熒光分析儀來測量熒光。圖1所示的結果顯示，與胱天蛋白酶活性相關聯的熒光水平隨著四種(4)不同抗 TLlA 抗體的濃度的增加而降低Ab#l-19E06 ；Ab#3-15E09 ；Ab#4-16H02 ；和 Ab#8_12D08。對于本領域技術人員明顯的是，可對本發(fā)明的方法和組合物作出各種修改和改變而不違背本發(fā)明的精神或范圍。因此，如果這些修改或改變屬于所附權利要求的范圍內，本 發(fā)明意在涵蓋本發(fā)明的這些修改和改變以及它們的等同物。
權利要求
一種特異性結合至TL1A的分離的抗原結合多肽，所述多肽包含(a)人源化抗體重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含(1)包含氨基酸序列({L，S，N}Y{G，A}MN)的CDR H1；(2)包含氨基酸序列(WINT{Y，N}TG{E，N}PTYA{D，Q}{D，G}F{K，T}G)的CDR H2；和(3)包含氨基酸序列(D{T，Y}{A，G}{M，K}{D，Y}{Y，G}{A，D}{M，Y}{A，Y}{Y，A}MDY))的CDR H3；以及(b)人源化抗體輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含(1)包含氨基酸序列({K，R}SSQ{N，S}{I，L}V{H，Y}S{D，N}GNTYL{E，N，D})的CDR L1；(2)包含氨基酸序列(KVSNR{F，D}S)的CDR L2；和(3)包含氨基酸序列({F，M}QG{S，T}H{V， }{P， }{L， }{T， })的CDR L3。
2.如權利要求1所述的多肽，其中(a)CDR-Hl包含氨基酸序列(LYGMN)或(NYGMN)；(b)CDR-H2 包含氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDi7KG)或(WINTNTGNPTYAQGFTQ)；并且(c)CDR-H3 包含氨基酸序列(DTAMDYAMAY)或(DYGKYGDYYAMDY)。
3.如權利要求1所述的多肽，其中(a)CDR-Ll 包含氨基酸序列(KSSQNIVHSDGNTYLE)或(RSSQSIVHSNGNTYLD)；(b)CDR-L2包含氨基酸序列(KVSNRFS)；并且(c)CDR-L3包含氨基酸序列(FQGSHVPLT)。
4.如權利要求1-3任何一項所述的多肽，其中(1)CDR-Hl由氨基酸序列(LYGMN)構成；(2)CDR-H2 由氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDi7KG)構成；(3)CDR-H3由氨基酸序列(DTAMDYAMAY)構成；(4)CDR-Ll 由氨基酸序列(KSSQNIVHSDGNTYLE)構成；(5)⑶R-L2由氨基酸序列(KVSNRFS)構成；并且 ⑶R-L3由氨基酸序列(FQGSHVPLT)構成。
5.如權利要求1-3的任何一項所述的多肽，其中(1)CDR-Hl由氨基酸序列(NYGMN)構成；(2)CDR-H2 由氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDi7KG)構成；(3)CDR-H3 由氨基酸序列(DYGKYGDYYAMDY)構成；(4)CDR-Ll 由氨基酸序列(RSSQSIVHSNGNTYLD)構成；(5)⑶R-L2由氨基酸序列(KVSNRFS)構成；并且(6)CDR-L3由氨基酸序列(FQGSHVPLT)構成。
6.一種特異性結合至TLlA的分離的抗原結合多肽，所述多肽包含人源化抗體重鏈可 變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含(1)包含氨基酸序列TSNMGVV的CDR-Hl；(2)包含氨基酸序列HILWDDREYSNPALKS 的 CDR-H2 ；(3)包含氨基酸序列MSRNYYGSSYVMDY的CDR-H3。
7.一種特異性結合至TLlA的分離的抗原結合多肽，所述多肽包含人源化抗體輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含(1)包含氨基酸序列SASSSVNYMH的CDR-Ll；(2)包含氨基酸序列STSNLAS的⑶R-L2；和(3)包含氨基酸序列HQWNNYGT的CDR-L3。
8.如權利要求6所述的多肽，所述多肽進一步包含人源化抗體輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈 可變區(qū)包含(1)包含氨基酸序列SASSSVNYMH的CDR-Ll；(2)包含氨基酸序列STSNLAS的⑶R-L2；和(3)包含氨基酸序列HQWNNYGT的CDR-L3。
9.如權利要求1-5的任何一項所述的多肽，其中所述人源化抗體重鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列(Q {V, 1} QLVQSG {S, P} ELKKPG {A, E} {S, T} VK {V, 1} SCKASGYTFTIL, S, Ni Y |G, AiMNffV {R, K} QAPG {Q, K} GL {E, K} WMGffINT IY, Ni TGIE, Ni PTYA ID, Qi ID, GiFiK, Ti GRF {V, A} FSL {D, Ε} TS {V, A} STAYLQI {S, N} {S, Τ} LK {A, N} ED {Τ, Μ} A {V, Τ} Y {Y, F} CARD {Τ, Y} {A, G} {Μ, K} {D, Y} {Y, G} {A, D} {M, Y} {A, Y} {Y, A}MDY)WGQGT{L, S} VTVSS)。
10.如權利要求9所述的多肽，其中所述人源化抗體重鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列 (QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNffVRQAPGQGLEffMGfflNTYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDTAMDYAMAYffGQGTLVTVSS)。
11.如權利要求9所述的多肽，其中所述人源化抗體重鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列 (QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNffVKQAPGKGLKWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDTAMDYAMAYffGQGTLVTVSS)。
12.如權利要求9所述的多肽，其中所述人源化抗體重鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVRQAPGQGLEffMGfflNTYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYGKYGDYYAMDYffGQGTLVTVSS)。
13.如權利要求6所述的多肽，其中所述人源化抗體重鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列 QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSNMGVVfflRQPPGKALEffLAHILffDDREYSNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMSRNYYGS SYVMDYffGQGTLVTVS S。
14.如權利要求1-13的任何一項所述的多肽，其中所述人源化抗體輕鏈可變區(qū)包含下 述氨基酸序列(DVVMTQ{T, S}PLSLPV{Τ, S} {P, L}G{E, D, Q} {P, Q} ASISC {K, Rl SSQ{N, Sj {I, U V{H, Y}S{P, N}GNTYL IE, N, DlfflY, F}{L, Q}Q{K, R}PGQSP{Q, K, R}{L, V, R} LIYKVSNR{F, D} SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI {S, N}RVEAED{L, V}GVY{Y, F}C{F, Ml QG{S, TlH{V, -}{P, -}{L, -} IT, -} {F, ff}G{G, S, Q} GTK {V, L}EIKR)。
15.如權利要求14所述的多肽，其中所述人源化抗體輕鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR)。
16.如權利要求14所述的多肽，其中所述人源化抗體輕鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIKR)。
17.如權利要求14所述的多肽，其中所述人源化抗體輕鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列(DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR)。
18.如權利要求14所述的多肽，其中所述人源化抗體輕鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列(DWMTQTPLSLPVSL⑶QASISCKSSQNIVHSDGNTYLEWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR)。
19.如權利要求7所述的多肽，其中所述人源化抗體輕鏈可變區(qū)包含下述氨基酸序列 DIQLTQSPSFLSASV⑶RVTITCSASSSVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQffNNYGTFGQGTKVEIKR。
20.一種特異性結合至TLlA的抗原結合多肽，所述多肽包含權利要求10、11、12、13中 的一項的人源化重鏈和權利要求15、16、17、18或19中的一項的人源化輕鏈。
21.如權利要求1-20的任何一項所述的多肽，其中所述多肽選自抗體分子、Fab片段、 Fab，片段、F(ab' )2片段和scFv分子。
22.如權利要求21所述的多肽，其中所述分子是抗體分子。
23.如權利要求22所述的抗體，其特異性地結合至TL1A，并且具有(a)輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)的序列為DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSSVNYMHWYQ QKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQffNNYGTFGQGTKVEIKR ；禾口(b)重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)的序列為QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSNMGV VffIRQPPGKALEffLAHILffDDREYSNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMSRNYYGSSYVMDY WGQGTLVTVSS。
24.如權利要求22所述的多肽，其中所述抗體是嵌合抗體，所述嵌合抗體包含人重鏈 恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)。
25.如權利要求22至23的任何一項所述的多肽，其中所述抗體是IgG分子(例如IgGl 分子或IgG4分子)。
26.如權利要求1所述的多肽，其中所述多肽是scFv分子。
27.如權利要求26所述的多肽，其中所述scFv的分子式選自NH2-L-VH-X-VK-COOH和 NH2-L-VK-X-VH-COOH ；其中L是前導序列；VH是人源化抗體重鏈可變區(qū)；X是連接多肽；且 VK是人源化抗體輕鏈可變區(qū)。
28.如權利要求1所述的多肽，其中所述多肽是FabHSA融合分子。
29.如權利要求28所述的多肽，其中FabHSA融合分子的分子式選自與 NH2-VK-CK-COOH 結合的 NH2-VH-CH1-HSA-C00H 或 NH2-HSA-CH1-VH-C00H ；其中 VH-CHl-HSA 或HSA-CHl-VH是人源化抗體重鏈可變區(qū)(VH)和人重鏈恒定區(qū)1 (CHl)與人血清白蛋白 (HSA) 一起形成的融合蛋白，該融合蛋白隨后與其同源的人源化抗體輕鏈可變區(qū)(VK)和人 k恒定區(qū)(CK)混合以形成Fab-HSA或HSA-Fab融合蛋白。
30.如權利要求1-29的任何一項所述的多肽，所述多肽被共軛至治療試劑或診斷試劑。
31.如權利要求30所述的多肽，其中所述治療試劑選自細胞毒素試劑、放射性標記、免 疫調節(jié)劑、激素、酶、寡核苷酸、光敏治療劑或它們的組合。
32.如權利要求31所述的多肽，其中所述診斷試劑選自放射性標記、光敏診斷劑、超聲 增強劑或非放射性標記。
33.如權利要求1-32的任何一項所述的多肽，其中所述多肽是TLlA的拮抗劑。
34.如權利要求1-33的任何一項所述的多肽，其中所述多肽不是TLlA的激動劑。
35.如權利要求1-34的任何一項所述的多肽，其中所述多肽以至少約IO6M4(優(yōu)選至少 約lOl1，更優(yōu)選至少約IO8Mi更優(yōu)選至少約10 的親和常數結合至TL1A。
36.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求1-35的任何一項的多肽和載體。
37.如權利要求36所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包含額外的治療試劑或診斷 試齊LU
38.一種治療或診斷炎癥性疾病或病癥的方法，所述方法包含給有需要的患者服用權 利要求36或37的任何一項的組合物。
39.一種治療或診斷免疫疾病或病癥的方法，所述方法包含給有需要的患者服用權利 要求36或37的任何一項的組合物。
40.一種治療或診斷癌癥的疾病或病癥的方法，所述方法包含給有需要的患者服用權 利要求36或37的任何一項的組合物。
41.如權利要求38-40的任何一項所述的方法，其中所述疾病或病癥選自自身免疫疾 病(例如，狼瘡)、炎癥性腸病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、關節(jié)炎(例如，風濕性關節(jié) 炎)、多發(fā)性硬化、移植排異反應、中樞神經系統損傷、Thl介導的腸病，例如克羅恩氏病、牛 皮癬、白血病或淋巴瘤(例如，慢性淋巴細胞白血病(CLL))、動脈硬化癥、肺癌和結腸癌。
42.一種編碼權利要求1-35的任何一項的多肽的多核苷酸。
43.一種重組多核苷酸，所述重組多核苷酸包含可操作地連接至權利要求42的任何一 個多核苷酸的啟動子序列。
44.一種用權利要求43的多核苷酸轉化的分離的細胞。
45.一種生產由權利要求42的重組多核苷酸編碼的多肽的方法，所述方法包括a)培養(yǎng)用所述重組多核苷酸轉化的細胞以表達所編碼的多肽；和b)回收以這種方式表達的多肽。
46.如權利要求9所述的多肽，其中所述人源化抗體重鏈可變區(qū)包含以下氨基酸序列QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVRQAPGKGLKffMGfflNTYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYGKYGDYYAMDYffGQGTLVTVSS。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性結合至TNF超家族成員15(TNFSF 15)(也稱為TL1A)的人源化抗體。本發(fā)明也描述了制造和使用抗TL1A抗體的方法。所述人源化抗體可為拮抗劑并且可被用來治療或診斷與TL1A功能相關的病癥。
文檔編號A61P35/00GK101903402SQ200880120578
公開日2010年12月1日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權日2007年11月13日
發(fā)明者克雷格·羅森, 布里奇特·A·庫克西, 帕拉尼薩姆伊·卡納卡拉杰, 維克托·羅施克, 羅杰·史密斯 申請人:泰華生物制藥美國公司